In - silico подбор ферментов для генотипирования изолятов бактерий рода Campylobacter, выделенных у птиц Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

УДК 579.62: 579.253.4 DOI: 10.32786/2071-9485-2019-03-31

IN-SILICO ПОДБОР ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПТИЦ

IN-SILICO - SELECTION OF ENZYMES FOR GENOTYPING OF CAMPYLOBACTER BACTERIA ISOLATES FROM BIRDS

В.П. Терлецкий1, доктор биологических наук, профессор О.Б. Новикова2, кандидат ветеринарных наук В.И. Тыщенко2, кандидат биологических наук Л.А. Шинкаренко3, кандидат сельскохозяйственных наук

V.P. Terletsky1, O.B. Novikova2, V.I. Tyschenko2, L.A. Shinkarenko3

1ГАОУ ВО ЛО «Ленинградский государственный университет» им. А.С. Пушкина,

г. Санкт-Петербург, Россия

2

3

ВНИВИП - филиал ФГБНУ ФНЦ ВНИТИП РАН, г. Санкт-Петербург, г. Ломоносов, Россия Селеционно-генетический центр Северо-Кавказская зональная опытная станция по птицеводству - филиал ФНЦ ВНИТИП РАН, с. Обильное, Ставропольский край, Россия

1State Autonomous Educational Institution of Higher Education of the Leningrad Region «Pushkin Leningrad State University», Saint Petersburg, Russia 2«All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry» - the branch of Federal State Budget Scientific Institution Federal Scientific Center «All-Russian Scientific Research and Technological

Institute of Poultry» of the Russian Academy of Sciences, Saint Petersburg-Lomonosov, Russia 3«Breeding and genetic center North Caucasian zonal poultry experimental station» - the branch of Federal State Budget Scientific Institution Federal Scientific Center «All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Poultry» of the Russian Academy of Sciences, Stavropol region, Russia

Дата поступления в редакцию 29.07.2019 Дата принятия к печати 12.09.2019

Received 29.07.2019 Submitted 12.09.2019

Изложены современные представления о генотипировании патогенов бактериальной природы как элемента в превентивной ветеринарии. Идентификация бактериальных штаммов позволяет эффективно выявлять пути распространения инфекции и находить источники патогена во внешней среде. Эти знания дают возможность прервать эпизоотическую цепь и не допустить распространения инфекции. Рассматриваются вопросы различных методов генотипирования, их преимущества и недостатки. Представлены ранее полученные авторами результаты по генотипи-рованию отдельных видов микроорганизмов, подробно рассмотрены методические детали предлагаемого метода генотипирования бактерий, основанного на идее двойного расщепления и избирательного мечения фрагментов ДНК (ДРИМ). Использование баз данных секвенированных геномов бактерий и компьютерных программ, позволяющих теоретически моделировать расщепление геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции, позволяет предложить подход к генотипиро-ванию бактерий рода Campylobacter по аналогии, как это было сделано ранее при генотипирова-нии бактерий группы кишечной палочки, сальмонелл и псевдомонад. Предлагаемый метод основан на использовании одновременно двух эндонуклеаз рестрикции, одна из которых производит 3'-усеченные концы фрагментов ДНК патогена, способные включать меченый дезоксинуклео-зидтрифосфат, и фермента, производящего 3'-выступающие либо тупые концы, не способные к включению метки. Подбор пары эндонуклеаз рестрикции основан не только на частоте расщепления геномной ДНК микроорганизма, но и на совместимости ферментов в одном реакционном буфере, специфичности, коммерческой доступности и стоимости. В конечном итоге будет детектироваться 20-50 четко различимых меченых фрагментов ДНК, число и распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. При совпадении всех фрагментов ДНК у сравниваемых бактерий можно говорить о передаче возбудителя от одной заболевшей особи другой. Генотипирование бактериальных изолятов, выделенных из каких-либо объектов в разное время, позволяет установить первичный источник инфекции.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

The article presents modern ideas about the genotyping of pathogens of a bacterial nature as an element in preventive veterinary medicine. Identification of bacterial strains allows you to effectively identify the spread of infection and find pathogen sources in the environment. This knowledge makes it possible to interrupt the epizootic chain and prevent the spread of infection. The questions of various methods of geno-typing are considered. their advantages and disadvantages. The results obtained earlier by the authors on the genotyping of certain types of microorganisms are presented, the methodological details of the proposed method for bacterial genotyping based on the idea of double cleavage and selective labeling of DNA fragments (DRIM) are examined in detail. The use of databases of sequenced bacterial genomes and computer programs that theoretically model the cleavage of genomic DNA by restriction endonucleases allows one to propose an approach to genotyping of Campylobacter bacteria by analogy, as was done earlier when genotyping bacteria of the Escherichia coli group, Salmonella and pseudomonas. The proposed method is based on the use of two restriction endonucleases at the same time, one of which produces 3'-truncated ends of pathogen DNA fragments that can include labeled deoxynucleoside triphosphate, and an enzyme that produces 3'-protruding or blunt ends that are not able to turn on the label. The selection of a pair of restriction endonucleases is based not only on the frequency of cleavage of the genomic DNA of the microorganism, but also on the compatibility of enzymes in one reaction buffer, specificity, commercial availability and cost. Ultimately, 20-50 clearly visible labeled DNA fragments will be detected, the number and distribution of which is characteristic of each bacterial strain. With the coincidence of all DNA fragments in the compared bacteria, we can talk about the transmission of the pathogen from one diseased individual to another. Genotyping of bacterial isolates isolated from any objects at different times allows us to establish the primary source of infection.

Ключевые слова: патогенные бактерии, кампилобактер, превентивная ветеринария, генотипирование, эндонуклеазы рестрикции.

Key words: pathogenic bacteria, campylobacter, preventive veterinary medicine, genotyping, restriction endonucleases.

Работа выполнена по теме Государственного задания №599.01.Х3017 0599-2014-0222 в части идентификации штаммов бактерий и по заданию №0599-2019-0040 в части in-silico поиска ферментов для генотипирования Campylobacter

Цитирование. Терлецкий В.П., Новикова О.Б., Тыщенко В.И., Шинкаренко Л.А. In-silico подбор ферментов для генотипирования изолятов бактерий рода Campylobacter, выделенных у птиц. Известия НВ ЛУК. 2019. 3(55). 245-252. DOI: 10.32786/2071-9485-2019-03-31. Citation. Terletskiy V.P., Novikova O.B., Tyshchenko V.I., Shinkarenko L.A. In-silico selection of enzymes for genotyping Campylobacter bacteria isolates collected from birds. Proc. of the Lower Volga Agro-University Comp. 2019. 3(55). 245-252. (in Russian). DOI: 10.32786/2071-9485-2019-03-31.

Введение. Выяснение путей распространения инфекции и идентификация источников патогена являются актуальными вопросами в системе профилактических мероприятий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями человека и животных. Диагностика заболевания, включая ПЦР-анализ, дает возможность лишь указать на биологический вид возбудителя; необходимы способы более точного выявления генетических вариантов микроорганизма в пределах вида. Быстрый и точный метод идентификации бактериальных штаммов позволяет на научной основе планировать противоэпизоотические мероприятия. Кампилобактериз является проблемой как в медицине, так и в ветеринарии. Природным резервуаром кампилобактеров являются различные виды животных и птиц [3].

В настоящее время существует большое число методов генотипирования бактерий, каждый из которых имеет преимущества и недостатки [4, 5, 7]. Способы выявления генетических вариаций в последовательности нуклеотидов в отдельных генах бактерий, проводимые секвенированием (MLST), могут не давать необходимого разреше-

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

ния в разделении группы изолятов на кластеры. Многие исследователи [12] отдают предпочтение методу генотипирования, основанному на разделении фрагментов ДНК патогена в пульс-гель электрофорезе (111 Э). В последние годы иногда стали использовать высокотехнологичные подходы к генотипированию, использующие рамановскую [10] и масс-спектроскопию [2, 11]. Получил распространение метод выявления полиморфных повторов ДНК с применением полимеразной цепной реакции - МЦУА [8, 1], который иногда для повышения разрешающей способности комбинируется с ПГЭ и MLST [9]. В целом, метод ПГЭ обладает высокой дискриминационной способностью, однако является трудоемким и длительным в выполнении всех этапов [6].

Ранее нами был разработан метод генотипирования микроорганизмов, основанного на идее двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ), который положительно зарекомендовал себя на отдельных видах микроорганизмов, где был достигнут самый высокий уровень дискриминации ^>0,96). Существующие базы данных секвенированных геномов патогенных бактерий, а также доступные компьютерные программы по т^Шсо моделированию расщепления геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции позволяют провести предварительный подбор ферментов-кандидатов для генотипирования. Анализ по программе т^Шсо позволяет подобрать оптимальную комбинацию ферментов рестрикции для каждого биологического вида патогена. В частности, для Е. соН и сальмонелл оптимальным выбором будет использование комбинации ферментов ХЪаЕ^Й, для псевдомонад - SpeI/StuI. Геномы многих видов патогенных кампилобактерий секвенированы и есть возможность с использованием программы т^Шсо (http://insilico.ehu.es/) подобрать пару эндонуклеаз рестрикции для проведения генотипирования методом ДРИМ. Метод ДРИМ [7] основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндо-нуклеазами и избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК. Первая эндонукле-аза рестрикции, имеющая 10-40 сайтов узнавания и расщепления в геноме, при ферментативном гидролизе ДНК образует ограниченное число фрагментов с так называемыми «липкими концами» (т.е. имеет З'-усеченные концы), которые могут включать метку (биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат, био-дЦТФ). Фрагменты ДНК, образованные второй эндонуклеазой рестрикции, имеющей около 1000 сайтов узнавания, дают только тупые или З'-выступающие концы фрагментов, которые не могут включать метку. Известно, что геномы большинства патогенных бактерий состоят из 2000-6000 тыс. пар оснований ДНК. Учитывая частоту расщепления генома вторым ферментом, образуемый средний размер фрагментов составит 2000-6000 пар оснований, что является оптимальным с точки зрения разделения этих фрагментов в обычном агарозном геле. Такая избирательность мечения позволяет уменьшить число фрагментов ДНК с нескольких тысяч до нескольких десятков и выявить это ограниченное число фрагментов на фильтре.

Целью работы является т^Шсо подбор оптимальной пары эндонуклеаз рестрикции для использования в генотипировании кампилобактерий методом ДРИМ.

Материалы и методы. Первым этапом работы является выращивание микроорганизма в подходящей питательной среде с целью получения чистой культуры (изолят). Предварительные опыты показали, что в отношении грамм-отрицательных бактерий рода Сатру1оЬа&ег подходит стандартная процедура экстракции ДНК с использованием фенольно-хлороформенной стадии. Ночная культура центрифугируется в 1,5 мл пробирках типа Эппендорф в течение 5 минут при 8000 g. Осадок бактериальных клеток затем используется для выделения ДНК. ДНК растворяем в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА: НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Методически ДРИМ протокол очень прост: в пробирку вносили 15 мкл воды, 2 мкл буфера для эндонуклеаз рестрикции, 2 мкл ДНК и 1 мкл ферментной смеси. Ферментную смесь делаем путем смешивания двух ферментов рестрикции, Taq-полимеразы и био-дЦТФ. После окончания реакции ДРИМ продукты двойного расщепления и мечения вносим в лунки стандартного 0,8 % агарозного геля. Электрофорез проводим в течение 16 часов (ставим на ночь) при напряжении 60 вольт, длина геля равна 25 см. По окончании электрофореза фрагменты ДНК переносим на нейлоновый фильтр. Для этого используем аппарат вакуумного переноса. Процедура длится 30 минут при уровне вакуума 30-40 мПа в дистиллированной воде. Фиксация перенесенных фрагментов ДНК на фильтре достигается облучением фильтра ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут на трансиллюминаторе. Детекцию биотинилированных фрагментов ДНК на фильтре проводим с использованием стандартных реактивов для выявления щелочной фосфатаз (красители NBT и BCIP). Используем конъюгат стрептави-дин-щелочная фосфатаза для связывания его с биотинилированными фрагментами [7].

Результаты и обсуждение. Результатом генотипирования методом ДРИМ является группа фрагментов ДНК в виде окрашенных полос на фильтре, распределение которых специфично для каждого штамма. Ранее проведенные эксперименты по геноти-пированию изолятов Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enterica доказали как эффективность метода, так и предсказуемость числа детектируемых фрагментов ДНК в зависимости от числа сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции. Обычно число фрагментов ДНК на фильтре составляет от 20 до 50, и они распределены по длине электрофоретической дорожки таким образом, что их положение легко идентифицировать (рисунок 1).

Рисунок 1 - Генотипирование методом ДРИМ трех видов патогенных бактерий -C. difficile, P. aeruginosa и S. enterica

Figure 1 - DRIM genotyping of three types of pathogenic bacteria -

C. difficile, P. aeruginosa and S. Enterica

При совпадении всех фрагментов ДНК у двух сравниваемых бактериальных изолятов делаем вывод об их генетической идентичности, т.е. изоляты, вероятно, имеют один источник и являются клонами одного штамма. В данном случае можно говорить о передаче инфекции от одного животного другому. Зачастую можно диагности-

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА: НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

ровать близкородственные штаммы, проявляющиеся в сходных профилях распределения фрагментов ДНК. Как правило, эпизоотологически не родственные штаммы (разные регионы, годы) имеют совершенно разные генетические профили. Генотипирова-ние изолятов Escherichia coli, выделенных от больных и павших кур различных птицефабрик страны, позволило доказать факт передачи инфекции между отдельными птичниками и между особями в пределах одного объекта.

Использование баз данных секвенированных геномов бактерий с программой симулирования расщепления геномов эндонуклеазами рестрикции (http://insilico. ehu. es/) позволил осуществить предварительный отбор ферментов для генотипирования изолятов бактерий рода Campylobacter (таблицы 1 и 2).

Таблица 1 - Отобранные эндонуклеазы рестрикции, образующие З'-усеченные концы для генотипирования кампилобактерий методом ДРИМ и их основные свойства

Table 1 - Selected restriction endonucleases forming З'-truncated ends for genotyping of campylobac-

ter using the DRI M method and their main properties

Свойства The properties Фермент Enzyme Сайт расщепления Cleavage site Число сайтов в C. jejuni 4031 Number of sites in C. jejuni 4031 Число сайтов в C. coli 76339 Number of sites in C. coli 76339 Оптимальный буфер Optimal buffer Специфичность* Specificity*

Cfr9l CjCCGGG 11 13 Cfr9l 1б0

Sail GjTCGAC 6 10 О 80

Avrll CjCTAGG 62 76 Tango™ 1б0

Paul GjCGCGC 19 48 R 1б0

Eco52l CjGGCCG 13 11 Eco52l 1б0

*специфичность фермента, выражаемая в кратном избытке фермента, которое все-еще не вызывает неспецифический гидролиз ДНК

*specificity of the enzyme, expressed as a multiple excess of the enzyme, which still does not cause nonspecific DNA hydrolysis

Таблица 2 - Отобранные эндонуклеазы рестрикции, образующие З'-выступающие или тупые концы для генотипирования кампилобактерий методом ДРИМ и их основные свойства

Table 2 - Selected restriction endonucleases forming З'-protruding or blunt ends for genotyping of campylobacter using the DRIM method and their main properties

Свойства The properties Фермент Enzyme Сайт расщепления Cleavage site Число сайтов в C. jejuni 4031 Number of sites in C. jejuni 4031 Число сайтов в C. coli 76339 Number of sites in C. coli 76339 Оптимальный буфер Optimal buffer Специфичность* Specificity*

Rsal GTjAC 1297 1568 Tango™ 1б0

Hhal GCGjC 1176 1791 Tango™ 1б0

BsuRI GGjCC 644 571 R 1б0

Sspl AATjATT 1936 1550 G 15

При подборе учитывали следующие свойства ферментов: число сайтов узнавания и расщепления в геноме кампилобактерий, относительная нечувствительность к метилированию ДНК, максимальное значение специфичности, способность проявлять активность в различных реакционных буферах.

Анализ всех комбинаций ферментов позволил рекомендовать следующие оптимальные сочетания ферментов и буфера:

1. AvrII/RsaI, AvrII/HhaI, буфер Tango™, активность обоих ферментов в этом буфере - 100%.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

2. PauI/BsuRI, буфер R, активность обоих ферментов в этом буфере - 100 %.

3. SalI/BsurI, буфер О, активность Sali - 100%б активность BsurI - 50-100 %.

В связи с тем, что реакция молекулярной гибридизации проводиться не будет, нет нужды переносить ДНК в одноцепочечном состоянии. Поэтому этапы денатурации и нейтрализации, необходимые при классическом переносе по Саузерну, в нашем случае пропускаются. Это значительно ускоряет и упрощает процедуру.

Таким образом, все три комбинации ферментов можно рекомендовать для экспериментального подтверждения их эффективности при генотипировании методом ДРИМ. Однако необходимо учитывать отдельные нюансы их использования. Так, первым нуклеотидом, который должен включаться в З'-усеченные фрагменты ДНК, образуемые ферментом Sali, будет дезокситимидинтрифосфат (дТТФ), поэтому, помимо метки био-дЦТФ, в реакционную смесь должен быть включен этот дезоксинуклео-зидтрифосфат. В остальных случаях в этом нет необходимости.

Сравнивая значимость комбинаций AvrH/Rsai и AvrII/HhaI, необходимо отметить негативное свойство фермента RsaI, которое заключается в том, что фермент имеет пониженную активность расщепления в метилированных сайтах CpG, что может выразиться в неполностью расщепленных участках геномной ДНК и трудностях в интерпретации распределения детектируемых фрагментов. Фермент Hha не расщепляет метилированные участки CpG, что является преимуществом. Avril расщепляет ДНК независимо от ее метилирования, в противоположность ферменту Paul, которой не узнает метилированные участки CpG и вполне может быть использован в сочетании с ферментом BsuRi, не чувствительным к метилированию. Фермент Sali не расщепляет метилированные участки CpG, и с учетом того, что теоретическое число сайтов расщепления в геномах двух видов кампилобактерий всего 6 и 10 (таблица 1), этот фермент не должен рассматриваться как оптимальный для генотипирования, тем более для проведения реакции требуется дополнительное внесение дТТФ.

Заключение. Анализируя все вышеизложенное, можно в качестве первой оптимальной комбинации ферментов при генотипировании изолятов бактерий рода Camplylobacter предложить пару AvrII/HhaI. Оба фермента работают в одном буфере со 100 % активностью; очень интересным представляется свойство HhaI не расщеплять метилированные участки CpG. В этом случае есть возможность выявления разницы в штаммах с идентичными участками ДНК, но различающимися по сайтам метилирования. Генотипирование методом ДРИМ сможет выявить различия там, где обычное се-квенирование покажет идентичную последовательность нуклеотидов в участках ДНК у сравниваемых геномов.

Библиографический список

1. Генотипирование штамма молочнокислых бактерий методом ПЦР-анализа/ Т.В. Кузнецова, К.М. Кебекбаева, Г.Т. Джакибаева, А.Е. Молжигитова // Современные проблемы науки и образования. 2016. №5. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/ view?id=25349 (дата обращения: 31.08.2019).

2. Идентификация Stenotrophomonas maltophilia с использованием методов прямого се-квенирования 16s рРНК и MALDI-TOF масс-спектрометрии/ Ю. И. Останкова, А.В. Семенов, Е.В.Зуева, М.А. Вашукова, А.А. Тотолян // Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т.2. №3. С. 165-170. DOI: 10.18821/0869-2084-2017-62-3-165-170.

3. Порин А.А. Возбудители кампилобактериозов // Инфекция и иммунитет. 2016. Т. 6. №3. С. 94.

4. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций / О.С.Бондарева, С.С. Савченко, Г.А. Ткаченко, А.И. Абуева, Ю.О. Муратова, В.А. Антонов // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014. №1. С. 34-44.

250

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

5. Сравнительное генетическое типирование изолятов Staphylococcus aureus, выделенных с поверхности кожи, из носовой полости и кишечника у детей, страдающих атопическим дерматитом / А.П. Пикина, А.Н. Шкопоров, Е.В. Кулагина, Е.В. Хохлова, А.В. Чаплин, Н.Н. Володин, Л И. Кафарская, Н.Г. Короткий, Б.А. Ефимов // Вестник РАМН. 2016. Т.71. №5. С. 367-374. DOI: 10.15690/vramn695.

6. Шпилевая М.В., Образцова О.А., Честков А.В. Использование методов генотипирования Neisseria gonorrhoeae// Вестник дерматологии и венерологии. 2015. №6. С. 33-40.

7. Эффективный метод генетической паспортизации штаммов Bacillus subtilis - перспективных продуцентов биопрепаратов/ В.П. Терлецкий, В.И. Тыщенко, И.И. Новикова, И.В. Бойкова, С.Д. Тюлебаев, И.Я. Шахтамиров // Микробиология. 2016. Т. 85. №1. С. 50-55. DOI: 10.7868/S0026365616010134.

8. Biotyping and genotyping (MLVA16) of Brucella abortus isolated from cattle in Brazil, 1977 to 2008 / S. Minharro, J.P. Silva, E.M. Dorneles, R.B. Pauletti, H. Neubauer, F. Melzer, F.P. Poester, M.G. Dasso, E.S. Pinheiro, P.M. Soares, R.L. Santos, M. Heinemann A.P. Lage // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. №12. D0I:10.1371/journal.pone.0081152.

9. Comparison of five molecular subtyping methods for differentiation of Salmonella Kentucky isolates in Tunisia / Y. Turki, I. Mehri, I. Fhoula, A. Hassen, H. Ouzari // World J. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol .30. №1. P. 87-98. DOI: 10.1007/s11274-013-1414-1.

10. Detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria using surface-enhanced Raman spectroscopy / K. Wang , S. Li, M. Petersen, S. Wang, X. Lu // Nanomaterials (Basel). 2018. V.8. №10. pii: E762. DOI: 10.3390/nano8100762.

11. Lartigue, M.F. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for bacterial strain characterization // Infect. Genet. Evol. 2013. Vol. 13. P. 230-235.

12. Salmonella enterica diversity in central Californian coastal waterways / S.P. Walters, N. González-Escalona, I. Son, D.C. Melka, L.M. Sassoubre, A.B. Boehm // Appl. Environ. Microbiol. 2013. Vol.79. №14. P. 4199-4209. DOI: 10.1128/AEM.00930-13.

References

1. Genotipirovanie shtamma molochnokislyh bakterij metodom PCR-analiza/ T. V. Kuzne-cova, K. M. Kebekbaeva, G. T. Dzhakibaeva, A. E. Molzhigitova // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2016. №5. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/ view?id=25349 (data obrascheniya: 31.08.2019).

2. Identifikaciya Stenotrophomonas maltophilia s ispol'zovaniem metodov pryamogo sekveni-rovaniya 16s rRNK i MALDI-TOF mass-spektrometrii/ Yu. I. Ostankova, A. V. Semenov, E. V. Zue-va, M. A. Vashukova, A. A. Totolyan // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2017. T.2. №3. P. 165-170. DOI: 10.18821/0869-2084-2017-62-3-165-170.

3. Porin A. A. Vozbuditeli kampilobakteriozov // Infekciya i immunitet. 2016. T. 6. №3. P. 94.

4. Sovremennye podhody k genotipirovaniyu vozbuditelej osobo opasnyh infekcij / O. S. Bondareva, S. S. Savchenko, G. A. Tkachenko, A. I. Abueva, Yu. O. Muratova, V. A. Antonov // }pidemiologiya i infekcionnye bolezni. 2014. №1. P. 34-44.

5. Sravnitel'noe geneticheskoe tipirovanie izolyatov Staphylococcus aureus, vydelennyh s poverhnosti kozhi, iz nosovoj polosti i kishechnika u detej, stradayuschih atopicheskim dermatitom / A. P. Pikina, A. N. Shkoporov, E. V. Kulagina, E. V. Hohlova, A. V. Chaplin, N. N. Volodin, L. I. Kafarskaya, N. G. Korotkij, B. A. Efimov // Vestnik RAMN. 2016. T.71. №5. P. 367-374. DOI: 10.15690/vramn695.

6. Shpilevaya M. V., Obrazcova O. A., Chestkov A. V. Ispol'zovanie metodov genotipirovani-ya Neisseria gonorrhoeae// Vestnik dermatologii i venerologii. 2015. №6. P. 33-40.

7. }ffektivnyj metod geneticheskoj pasportizacii shtammov Bacillus subtilis - per-spektivnyh producentov biopreparatov/ V. P. Terleckij, V. I. Tyschenko, I. I. Novikova, I. V. Bojkova, S. D. Tyulebaev, I. Ya. Shahtamirov // Mikrobiologiya. 2016. T. 85. №1. P. 50-55. DOI: 10.7868/S0026365616010134.

8. Biotyping and genotyping (MLVA16) of Brucella abortus isolated from cattle in Brazil, 1977 to 2008 / S. Minharro, J.P. Silva, E.M. Dorneles, R.B. Pauletti, H. Neubauer, F. Melzer, F.P. Poester, M.G. Dasso, E.S. Pinheiro, P.M. Soares, R.L. Santos, M. Heinemann A.P. Lage // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. №12. DOI:10.1371/journal.pone.0081152.

***** ИЗВЕСТИЯ *****

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА: № 3 2019

НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

9. Comparison of five molecular subtyping methods for differentiation of Salmonella Kentucky isolates in Tunisia / Y. Turki, I. Mehri, I. Fhoula, A. Hassen, H. Ouzari // World J. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol .30. №1. P. 87-98. DOI: 10.1007/s11274-013-1414-1.

10. Detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria using surface-enhanced Raman spectroscopy / K. Wang , S. Li, M. Petersen, S. Wang, X. Lu // Nanomaterials (Basel). 2018. V.8. №10. pii: E762. DOI: 10.3390/nano8100762.

11. Lartigue, M.F. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for bacterial strain characterization // Infect. Genet. Evol. 2013. Vol. 13. P. 230-235.

12. Salmonella enterica diversity in central Californian coastal waterways / S.P. Walters, N. González-Escalona, I. Son, D.C. Melka, L.M. Sassoubre, A.B. Boehm // Appl. Environ. Microbiol. 2013. Vol.79. №14. P. 4199-4209. DOI: 10.1128/AEM.00930-13.

Информация об авторах Терлецкий Валерий Павлович, профессор кафедры естествознания и географии Ленинградского государственного университета им. А.С. Пушкина, Санкт-Петербург-Пушкин, Петербургское ш. 10, 196605, тел. 8 921 558 7957. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4043-3823 E-mail: valeriter@mail.ru. Новикова Оксана Борисовна, кандидат ветеринарных наук, заведующая отделом микробиологии, ВНИВИП - филиал ФНЦ ВНИТИП РАН, Санкт-Петербург-Ломоносов, ул. Черникова 48, 198412, тел. +7 (812)4220141. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0046-625X E-mail: ksuvet@mail.ru. Тыщенко Валентина Ивановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики, ВНИИГРЖ, г. Санкт-Петербург-Пушкин, 196625, тел. 8 921 558 7824. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4964-9938 E-mail: tinatvi@mail.ru.

Шинкаренко Лидия Александровна, кандидат сельскохозяйственных наук, заместитель директора по научной работе СГЦ «СКЗОСП», ул. Продольная 30, с. Обильное, Ставропольский край, 357812, тел. +7 (87951) 43-146. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4959-5415 E-mail: skzospzooteh@yandex.ru.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

УДК 591.111.05:636.93 DOI: 10.32786/2071-9485-2019-03-32

ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ КРОВИ СЕРЕБРИСТО-ЧЕРНОЙ ЛИСИЦЫ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

CHANGE IN BIOCHEMICAL BLOOD PARAMETERS OF THE SILVER-BLACK

FOX IN POSTNATAL ONTOGENESIS

Ю.А. Березина1, кандидат ветеринарных наук

О.Ю. Беспятых2, доктор биологических наук

А.Е. Кокорина1, кандидат биологических наук

1 2 1 Yu.A. Berezina , O.Yu. Bespyatykh , A.E. Kokorina

1ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М. Житкова», г. Киров, Россия 2ФГБОУ ВО «Вятский государственный университет», г. Киров, Россия

1Federal State Budget Scientific Institution « All-Russian Scientific Research Institute of Hunting and Animal Breeding named after prof. B.M. Zhitkov », Kirov, Russia 2Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Vyatka State University», Kirov, Russia

Дата поступления в редакцию 29.04.2019 Дата принятия к печати 16.08.2019

Received 29.04.2019 Submitted 16.08.2019

Описаны и проанализированы биохимические показатели крови серебристо-черной лисицы в постнатальном онтогенезе. Исследования проводили в зверохозяйстве «Вятка» (Кировская обл.). Зверей содержали в одинаковых условиях, кормили в соответствии с возрастом и физиологическим