CC BY
204
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1:579.253].083.1:577.21.08
Л.В. Миронова, М.В. Афанасьев, Е.А. Басов, Л.Я. Урбанович, С.В. Балахонов
ретроспективный макрорестрикционный анализ штаммов vibrio
CHOLERAE ELTOR, изолированных при эпидемических осложнениях
на дальнем востоке россии
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
На основании макрорестрикционного анализа геномной ДНК V. cholerae eltor с использованием эндонуклеаз NotI и SfiI проведено ретроспективное исследование клональной структуры 24 изолированных при эпидемических осложнениях на Дальнем Востоке России штаммов холерного вибриона. Установлено, что клональные по данным амплификационного профилирования токсигенные штаммы (n = 23) характеризуются вариабельностью NotI/SfiI-генерируемых профилей рестрикции. Изолированные в период вспышки в г Южно-Сахалинске V. cholerae eltor дифференцируются на 4 пульсотипа с одним доминирующим, выявленным у 76,5% штаммов. Для изоля-тов из Приморского края характерен индивидуальный NotI/ SfiI-профиль рестрикции. Нетоксигенный штамм на основании структуры PFGE-паттерна образует отдельную от токсигенных линию дендрограммы.
Показана эффективность применения макрорестрикционного анализа для углубленной характеристики популяционной структуры V. cholerae и выяснения молекулярно-эпидемиологических закономерностей территориального распространения отдельных клонов возбудителя.
Ключевые слова: Vibrio cholerae; макрорестрикционный анализ; PFGE; эндонуклеаза NotI, эндонуклеаза SfiJ; молекулярно-эпидемиологический анализ
В основе дифференциации микроорганизмов на молекулярно-генетическом уровне лежат структурные особенности специфических участков их генома. Характеристика этих участков позволяет получить информацию о гетерогенности популяции, выявить внутривидовые и межштаммовые различия микроорганизмов. При этом исследуемые локусы в зависимости от типа, локализации в геноме, вероятности и скорости изменчивости могут служить маркерами для типирования при проведении филогенетического или молекулярно-эпидемиологического анализа.
В молекулярной эпидемиологии в качестве одного из подходов к типированию возбудителей инфекционных болезней, выяснению степени их генетического родства и эпидемиологических взаимосвязей применяется исследование специфических сайтов рестрикции геномной ДНК микроорганизмов - макрорестрикционное картирование с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле - PFGE-типирование (PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis) [10, 22]. PFGE-типирование осуществляется на основании сопоставления паттернов рестрикции, полученных при обработке редкощепящими эндонуклеазами иммобилизованной в агарозных блоках ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов [10, 22]. Метод молекулярного типирования с использованием пульс-электрофореза, несмотря на сложность выполнения и необходимость строгой стандартизации протокола для межлабораторного сопоставления, характеризуется рядом преимуществ, таких как высокая дискриминирующая способность, возможность биоинформационного анализа результатов, корреляция их с эпидемиологическими данными, что дает основание рассматривать его в качестве эффективного инструмента молекулярного типирования микроорганизмов [22].
Для стандартизации процедуры PFGE-типирова-ния сетью PulseNet, USA разработаны протоколы макроре-
стрикционного анализа ряда патогенов, в том числе Ye -rsinia pestis, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus и др. [21]. Типирование V. cholerae (в соответствии со стандартным протоколом) предусматривает гидролиз хромосомной ДНК ферментами NotI и SfiI, при использовании которых формируются паттерны рестрикции с достаточным числом фрагментов, обеспечивающим возможность интерпретации, сопоставления результатов и высокий уровень дискриминации тестируемых изолятов [9, 18]. Использование пульс-электрофореза для типирования V. cholerae показало эффективность при анализе эпидемических осложнений по холере, исследовании особенностей географической приуроченности штаммов определенных профилей, установлении направлений локального (в пределах эндемичных территорий) и глобального (трансграничного и трансконтинентального) распространения инфекции [8, 13, 14]. В частности, на основании исследования профилей рестрикции клинических изолятов с о. Гаити и сопоставления их с имеющимися в базе PulseNet пульсотипами штаммов V. cholerae на начальном этапе развития эпидемии было высказано предположение о вероятности заноса инфекции на территорию из Южной Азии [8, 15], охарактеризована клональная структура популяции холерного вибриона на о. Гаити, подтверждены данные эпидемиологического анализа заносного случая холеры в Канаду [11].
В Сибирь и на Дальний Восток в период 7-й пандемии холера неоднократно была занесена на отдельные территории с развитием в ряде случаев острых местных вспышек. В связи с этим представляют практический интерес возможность использования макрорестрикци-онного картирования ДНК для ретроспективной оценки клональной структуры популяции возбудителя и молекулярно-эпидемиологический анализ имевших место осложнений по холере в регионе.
Цель работы - анализ клональной структуры популяции V. cholerae eltor при эпидосложнениях по холере на Дальнем Востоке в 1999 г. на основании сопоставления пульсотипов изолированных штаммов и молекулярно-эпидемиологическая характеристика вспышки в Южно-Сахалинске.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. Проведено исследование 19 штаммов V. cholerae eltor, изолированных от людей (n = 11, в том числе 2 в заносных очагах и 9 в 3 из 5 зарегистрированных во время вспышки очагов) и из объектов окружающей среды (n = 8) в период эпидемических осложнений в Южно-Сахалинске в 1999 г. В качестве группы сравнения в исследование включено 5 штаммов V. cholerae eltor, выделенных в период зарегистрированных в том же году в Приморском крае (Владивосток, Уссурийск) заносных случаев и вспышки холеры. Указанные штаммы (n = 24) хранились в лиофилизированном состоянии в коллекции музея живых культур ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Дополнительно, для анализа стабильности PFGE-профилей V. cholerae, осуществляли выборочное тестирование тех же штаммов, хранящихся
в рабочей коллекции при комнатной температуре в 0,3% полужидком агаре Мартена (ПЖА) с пересевом один раз в год. Из рабочей коллекции в исследование включено 5 изолированных на вспышке в Южно-Сахалинске штаммов V. cholerae eltor, в том числе 2 от больных и 3 из объектов окружающей среды. В качестве контрольных при молекулярно-генетическом анализе по комплексу генов использовали штаммы V. cholerae eltor М878 и V. cholerae cholerae 569В, при постановке пульс-электрофореза - штамм Salmonella ser. Braenderup H98124.
Подготовка штаммов к исследованию. Лиофилизирован-ные культуры V. cholerae eltor после вскрытия ампул и растворения лиофилизата в 0,9% растворе NaCl высевались на пластинки щелочного казеиново-дрожжевого агара, рН 7,6 (КДА). Полученные таким образом агаровые культуры, а также хранящиеся в ПЖА культуры V. cholerae eltor подвергали однократному пассажу на среде накопления (1% пептонная вода) с последующим высевом на КДА. Исследуемые штаммы идентифицировали по комплексу стандартных бактериологических тестов в соответствии с МУ «Лабораторная диагностика холеры» [1].
Штамм Salmonella ser. Braenderup H98l24 культивировали на триптиказеино-соевом агаре (ТСА).
Экстракция ДНК для молекулярно-генетического анализа. Экстракцию ДНК осуществляли посредством лизиса клеток V. cholerae в растворе додецилсульфата натрия (6%) с последующей депротеинизацией смесью хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 24:1), осаждением этиловым спиртом (96%) и растворением полученной ДНК в ТЕ-буфере. Качество выделения ДНК оценивали электрофоретически в 0,9% агарозном геле, концентрацию - спектрофотометрически на NanoVue Plus ("GE Health Care", США). Для молекулярно-генетических исследований использовали 5-10 нг ДНК матрицы.
Молекулярно-генетический анализ V. cholerae eltor проводили для первичной характеристики клональной структуры исследуемых штаммов по комплексу биоварспецифических и ассоциированных с патогенностью генов. С этой целью осуществляли детекцию основных определяющих эпидемическую значимость холерного вибриона генов (ctxAB, tcpA), дополнительных ассоциированных с патогенностью детерминат (rstC, rstR, TLC), а также определение нуклеотидной последовательности отдельных генетических локусов (ctxB, область ctxA-zot). Наличие в геноме опе-рона генов холерного токсина (ctxAB), гена основной структурной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии (tcpA) определяли в мультиплексной ПЦР, гена rstC (в составе RS1 профага), токсинсвязанного криптического элемента (TLC) - в ПЦР с одной парой соответствующих праймеров. Выявление аллельного варианта генов ctxB, rstR осуществляли в аллельспецифической ПЦР и посредством определения нуклеотидной последовательности анализируемого участка генома (ген ctxB) [4, 16, 17]. Количество гептамерных повторов (5'-777TGAT-3') в ctxAB промоторной области (PctAB) определяли на основании секвенирования указанного участка генома холерного вибриона [4]. Результаты секвениро-
вания анализировали в программе VectorNTI v. 10.0 ("Invitrogen Corp.", США), генотип штаммов устанавливали по совокупности и структуре комплекса генов [4].
Гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE-типи-рование). Для типирования с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле исследуемые и контрольный штаммы культивировали на соответствующих питательных средах (КДА - для V. cholerae, ТСА - для Salmonella ser. Braenderup) в течение 18-20 ч. Бактериальные клетки иммобилизовали в ага-розных блоках посредством добавления к содержащей протеина-зу К (20 мг/мл) бактериальной взвеси (3,7-3,75 McF) 1% раствора агарозы SeaKemGold в соотношении 1:1. Лизис бактериальных клеток в агарозных блоках осуществляли в лизирующем растворе (50 мМ трис:50 мМ EDTA pH 8,0; 1% Sarcosyl) при температуре 54°С и интенсивности шуттелирования 80/мин в течение 1 ч, отмывку агарозных блоков - последовательно бидистиллированной водой и ТЕ-буфером при температуре 50 °С и интенсивности шуттелирования 100/мин. Затем ДНК V. cholerae в блоках подвергали рестрикции эндонуклеазами NotI (GC]GGCCGC) - 40 ед. и Sfil (GGCCNNNN^NGGCC) - 40 ед. («Fermentas», Литва), с последующим разделением рестриктов в 1% агарозном геле в системе для проведения гель-электрофореза в пульсирующем поле «CHEF Mapper XA System» («Bio-Rad», США) [18]. Для рестрикции ДНК Salmonella ser. Braenderup H98124 использовали 40 ед. Xbal (T]CTAGA). Результаты пульс-электрофореза визуализировали в гель-документирующей системе Gel Doc XR System («Bio-Rad», США) с применением программного обеспечения ImageLab 4.0.1. Графические файлы в формате *tif импортировали в сформированную базу данных программы BioNumerix 6.0 («Applied Maths», Бельгия), с использованием инструментов которой осуществляли идентификацию размеров полученных рестриктов в составе индивидуального паттерна каждого штамма на основании сопоставления их с размерным стандартом (XbaI-генерированным паттерном рестрикции ДНК штамма Salmonella ser. Braenderup H98124). Кластерный анализ результатов выполняли по алгоритму UPGMA c расчетом коэффициента сходства Dice, допустимым уровнем отклонения позиции фрагментов 1,5% (tolerance) и оптимизацией 0,5% [8]. Условное обозначение паттернов рестрикции ДНК осуществляли с учетом вида возбудителя (Vibrio cholerae - VC), используемого фермента рестрикции (NotI - N, Sfil - S) и порядкового номера PFGE-профиля в базе данных (1, 2 и т. д.). Дискриминирующую способность PFGE-типирования определяли на основании расчета индекса Хантера-Гастона [12].
Результаты и обсуждение
В августе-сентябре 1999 г. на Дальнем Востоке России в Южно-Сахалинске и Владивостоке зарегистрированы эпидемические осложнения по холере [5, б]. В Южно-Сахалинске один случай заболевания (легкое течение) и случай вибрионосительства были диагностированы в на-
Таблица 1
фенотипические свойства и молекулярно-генетический портрет исследуемых штаммов V cholerae eltor
Условия хранения штаммов Место и время выделения штаммов Эпид. ситуация Объект выделения Количество штамм-мов Фенотипические свойства Генотип
серо-группа серовар биовар ctxAB ctxB rstR elt rstR clas TLC tbr rstC tcpA elt
Лиофи- Южно- Заносный Человек 1 О1 Огава Эль-Тор - - - - - - - -
лизиро- Сахалинск, очаг
ванные 1999 г. 1 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
Вспышка Человек 9 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
ООС 8 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
Примор- Заносный Человек 2 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
ский край, очаг
1999 г. Вспышка Человек 2 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
ООС 1 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
ПЖА Южно- Вспышка Человек 2 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
Сахалинск, ООС 2 О1 M Эль-Тор + ctxBl + + - 4 + +
1999 г. 1 О1
Эль-Тор - - + - - - + +
Рис. 1. PFGE-паттерны штаммов V.cholerae eltor:
2—6- NotI-генерируемые паттерны рестрикции ДНК V.cholerae eltor;
8-12 - SfiI-генерируемые паттерны рестрикции ДНК V.cholerae eltor;
2, 8 - V.cholerae eltor И1299; 3, 9 - V.cholerae eltor И1303; 4, 10 -
V.cholerae eltor И1300; 5,11 - V.cholerae eltor И1333; 6, 12 - V.cholerae eltor И1345; 1, 7, 13 - ДНК Salmonella ser. Braenderup H98124, рестрицированная XbaI (размерный стандарт).
чале августа у вернувшихся из КНР туристов. Развившаяся позднее острая местная вспышка холеры протекала c 23 августа по 11 сентября с регистрацией 11 больных, 11 вибрионосителей и обнаружением 14 токсигенных штаммов V. cholerae eltor в объектах окружающей среды. Эпидемиологическое расследование позволило выявить 5 очагов инфекции, 4 из которых оказались множественными [6].
Выборочное исследование изолированных в период указанных эпидемических осложнений штаммов холерного вибриона (n = 19), а также взятых в качестве группы сравнения выделенных на вспышке
в Приморье в 1999 г. штаммов (n = 5) показало однородность их основных фенотипических свойств: все изоляты относятся к О1 серологической группе, серо-варианту Огава, биовару эльтор (табл. 1). При типи-ровании бактериофагами Дрожевкиной-Арутюнова подавляющее большинство исследуемых штаммов (n = 24) лизируется только фагом 5 и соответственно не укладывается в схему фаготипирования, V. cholerae eltor от вибриононосителя отнесен к 13-му фаготипу.
Молекулярно-генетический анализ показал, что практически все хранящиеся в лиофилизированном состоянии исследованные штаммы V cholerae eltor (23 из 24 - 95,8%) содержат в геноме основные детерминанты патогенности - гены ctxAB и tcpA. Исключение составляет лишь изолированный от вибриононоси-теля в заносном очаге штамм, не содержащий указанных генов и соответственно охарактеризованный как эпидемически неопасный. Генотипирование по комплексу ассоциированных с патогенностью генов выявило клональность эпидемически опасных изолятов V. cholerae eltor. Все штаммы несут ген субъединицы В холерного токсина классического типа (с цитозином в 115 и 203 позиции гена), содержат элемент профага RSI - ген rstC, классическую и Эль-Тор аллели гена-репрессора rstR, четыре ToxR- связывающих повтора в РсйАВ-области, лишены токсинсвязанного критического элемента TLC, являющегося спутником СТХ-профага (см. табл. 1). С учетом этих данных исследуемые эпидемически опасные изоляты характеризуются как атипичные варианты вибриона Эль-Тор и относятся к одному генотипу - ctxB1+rstREl+rstRCl+rstC+TLC'tbr4, обозначенному как генотип II [4].
Что касается взятых в исследование V. cholerae el-tor из рабочей коллекции, то 4 из 5 штаммов принадлежат к тому же генотипу, что и хранящиеся в лиофи-
Рис. 2. Дендрограмма, построенная по алгоритму UPGMA на основании сопоставления АМ-генерируемых профилей рестрикции
штаммов V. ^о1егае еЫог.
Рис. 3. Дендрограмма, построенная по алгоритму ОТ^МА на основании сопоставления ^/-генерируемых профилей рестрикции
штаммов V. ско1егае еНог.
лизированном состоянии изоляты. Для одного штамма установлена утрата в процессе хранения и пассажа на питательных средах ряда тестируемых генов (генотип ctxB-rstREl+rstRCl-rstС+TLC-tbr).
При макрорестрикционном исследовании геномной ДНК 24 хранящихся в лиофилизированном состоянии штаммов V. ско1егае еНог с использованием эндону-клеазы ИоП установлено формирование паттернов, состоящих из 22-24 визуализируемых в геле фрагментов рестрикции в диапазоне размеров от 28,8 до 398,4 т.п.н. (рис. 1). Кластерный анализ Ло£/-генерируемых паттернов показал дифференциацию штаммов на 2 отдельные линии в зависимости от эпидемической опасности (рис. 2): одна линия включает все изолированные при эпидос-ложнениях с1хАВ+ V ско1егае еНог, другая - один неток-сигенный штамм, выделенный в Южно-Сахалинске в заносном очаге. Большинство токсигенных изолятов из Южно-Сахалинска группируются в кластер из 3 пуль-сотипов: УСШ (14 штаммов), УСШ (1 штамм), УСШ (2 штамма). Один, дистанцированный от указанного кластера пульсотип (УСШ), входит отдельной ветвью в линию токсигенных штаммов. Профиль рестрикции ДНК штаммов доминирующего пульсотипа УСШ представлен набором из 23 фрагментов в анализируемом диапазоне размеров. Вариабельность PFGE-профилей вспышечных штаммов обусловлена изменением состава паттерна (формирование дополнительного фрагмента - УСШ или отсутствие одного из фрагментов - УСЮ). Все исследуемые штаммы из Приморского края характеризуются идентичным паттерном (УСШ), сходным с доминирующим пульсотипом штаммов из Южно-Сахалинска по количеству рестриктов, но отличающимся существенным сдвигом размера фрагмента, мигрирующего в геле на уровне 398,4 т.п.н. (см. рис. 1). Указанные различия обусловливают формирование на дендрограмме изолятами из Приморья отдельной
группы в составе линии токсигенных штаммов. Дискриминирующая способность (индекс Хантера-Гастона) PFGE-типирования при использовании эндонуклеазы Лой для данной выборки составляет 0,631.
Гидролиз ДНК лиофилизированных штаммов эн-донуклеазой SfiI приводит к формированию паттернов из 27, 28 фрагментов в диапазоне размеров от 28,8 до 668,9 т.п.н. (см. рис. 1). На дендрограмме, построенной по результатам сопоставления SfiI-генерируемых профилей рестрикции, также прослеживается дифференциация на дистанцированные линии токсигенных штаммов и нетоксигенного V. скокгае еЮ (рис. 3). Токсигенные V. ско1егае еЫог формируют 4 пульсотипа, в том числе один доминирующий (VCS1), включающий 15 штаммов. Различия PFGE-профилей с&АВ+-штаммов обусловлены формированием дополнительного фрагмента (VCS2) или отсутствием одного из фрагментов рестрикции в структуре паттерна (VCS3) по сравнению с доминирующим пульсотипом. Следует отметить, что в отличие от результатов кластерного анализа Жо£/-генерируемых профилей (где подавляющее большинство с/хАВ+-штаммов из Южно-Сахалинска (17 из 18) объединено в отдельную группу филогенетического дерева, а штаммы из Приморья формируют обособленный пульсотип), при рестрикции SfiI два выделенных на вспышке в Южно-Сахалинске клинических изолята имеют идентичный с изолятами из Приморья профиль и соответственно относятся к одному пульсотипу (VCS3). Индекс Хантера-Гастона при типи-ровании с использованием SfiI составляет 0,546.
При комплексном анализе NotI/SfiI-генерwруемых профилей рестрикции прослеживаются основные закономерности топологии дендрограммы, выявленные для каждого фермента отдельно. Самостоятельная линия образована нетоксигенным штаммом, все токсигенные штаммы объединены в одну линию, включающую кластер из 4 пульсотипов выделенных в Южно-Сахалинске
PFGE_Notl_SFîl
s я s
s s
M 298 Vibrio cholerae eltor 01 1999 patient Y-Sakhalinsk
1-1300 Vibrio cholerae oltol 01 1999 patient Y-Sakhalinsk
I-Î301 Vihrio cholerae ' OI 1999 patient Y-Sakha linsk
1-1304 Vibrio chotÉrÉB glfai OI 1999 patient Y-Sakhalinsk
M 307 Vibrio chotufafi eitoi OI 1999 patient Y-Sakhalinsk
И 308 Vibrio rholOran allot 01 1999 patient Y-Sakhalinsk
1-1309 Vibrio cholerae i.'.'í'." OI 1999 patient Y-Sakhallnsk
1-131Q Vibrio chítlerae eltoi OI 1999 water V-Sak ha linsk
1-1311 Vibrio cholerae oltot OI 1999 water Y-Sakhalinsk
М312 Vibrio t l,!}'fjiHt} pltni OI 1999 silt Y-Sakhalinsk
1-1314 Vibrio cholerae ettei OI 1999 sewage Y-Sakhalinsk
1-1315 Vibrio cholerae dtOf OI 1999 fish Y-Sakhalinsk
1-1317 Vibrio cholerae ollar Q1 1999 sewage Y-Sakhalinsk
1-1318 Vibrio rholeran oltol OI 1999 water Y-Sakhalinsk
I-T313 Vibrio Ghalerae pilot OI 1999 sewage Y-Sakhalinsk
1-1 302 Vibrio cholerae ottoi 01 1999 patient Y-Sakhallnsk
1-1 303 Vibrio cholerae oltoi OI 1999 patient Y-Sakhalinsk
1-1305 Vibrio i '■< l'v' 1 ,¡i ' i >.", 'I OI 1999 patient Y-Sakhalinsk
1-1333 Vibrio cholerae eltot OI 1999 water Vladivostok
И 334 Vibrio cholerae eltoi 01 1999 patient Vladivostok
1-1335 Vibrio cholerae ollar 01 1999 patient Ussuriisk
1-1 340 Vibrio cholerae elloi OI 1999 patient Vladivostok
1-1345 Vibrio r.holctao oltol 01 1999 patient Vladivostok
1-1299 Vibtio cholerae nitor OI 1999 patient Y-Sakhalinsk
Рис. 4. Дендрограмма, построенная по алгоритму UPGMA на основании комплексного анализа NotI/SfiI-генерируемых профилей
рестрикции штаммов V. Ло1егае еНог.
штаммов V. cholerae eltor и отдельную ветвь, образованную штаммами из Приморского края (рис. 4).
Сопоставление результатов PFGE-типирования с данными эпидемиологического расследования осложнений по холере в Южно-Сахалинске показало, что V cholerae eltor доминирующего пульсотипа (VCNS1) обнаружены в материале от больного в заносном очаге, от больных и вибри-ононосителей в трех очагах, а также в объектах окружающей среды в период вспышки. Клинические штаммы с отличающимся от доминирующего профилем рестрикции ДНК (VCNS4) не демонстрируют привязки к определенному очагу инфекции: один из них выделен от больного в наиболее крупном очаге, зарегистрированном в пос. Дачный, другой - в географически отдаленном от первого очаге по ул. Деповской Южно-Сахалинска. При этом по результатам расследования между указанными очагами была установлена эпидемиологическая взаимосвязь. V. cholerae eltor с паттерном VCNS3 обнаружен в очаге пос. Октябрьский, где наряду с ним из клинического материала выделен и изолят доминирующего пульсоти-па (табл. 2).
Анализ динамики изоляции V. choleare eltor разных PFGE-профилей показал, что штаммы доминирующего пульсотипа выделялись на протяжении всего периода вспышки (с 1-й по 4-ю пятидневки)
с максимальным их количеством во 2-ю пятидневку вспышки (46,2% от общего количества штаммов доминирующего пульсотипа). Изоляты с отличающимся от доминирующего пульсотипом выделены в 1-ю, 2-ю
Таблица 2
Сопоставление результатов pFGE-типирования V cholerae eltor с данными эпидемиологического анализа
NotI/SfiI-профиль рестрикции Количество штаммов
Южно-Сахалинск Приморский край
заносный очаг вспышка заносный очаг вспышка
человек человек ООС человек человек ООС
очаг 1 1 очаг 2 | очаг 3
VCNS1 (VCN1/VCS1) 1 3 1 2 7
VCNS2 (VCN2/VCS2) 1
VCNS3 (VCN5/VCS1) 1
VCNS4 (VCN3/VCS3) 11
VCNS5 (VCN4/VCS3) 2 2 1
VCNS6 (VCN6/VCS4) 1
Таблица 3
Распределение штаммов V Ло1егае eltor различных PFGE-профилей по периодам вспышки холеры в южно-Сахалинске
Период вспышки
Профиль рестрикции Всего штаммов 23.08-27.08.1999 (количество штаммов/%) 28.08.01.09.1999 (количество штаммов/%) 02.09.06.09.1999 (количество штаммов/%) 07.09.11.09.1999 (количество штаммов/%)
Доминирующий (VCNS1) 13 1/7,7 6/46,2 3/23,1 3/23,1
Вариабельные 4 1/25 1/25 0 2/50
(VCNS2-4)
PFGE.Notl PFGENotl
1 2345678 9
и 4-ю пятидневки вспышки, при этом 50% указанных штаммов приходится на 4-ю пятидневку (табл. 3).
Следует отметить, что доминирующий паттерн определяется у штаммов независимо от объекта выделения, тогда как для вариабельных профилей прослеживается связь с источником изоляции возбудителя. Так, пульсо-типы VCNS3 и VCNS4 образованы клиническими изо-лятами, а к VCNS2 относится штамм из поверхностного водоема (см. рис. 4). При сопоставлении пульсотипа V. ^о1егае еНог с клиникой заболевания установлено, что штаммы измененных профилей выделены от больных с тяжелым (2 случая) и среднетяжелым (1 случай) течением холеры, а из 7 отнесенных к доминирующему пуль-сотипу клинических штаммов 5 (71,4%) изолированы от вибриононосителей и больных с легкой формой.
Выявленная вариабельность пульсотипов вспышеч-ных штаммов холерного вибриона послужила основанием для проведения исследований по изучению стабильности PFGE-профиля при хранении и пассаже штаммов на питательных средах. С этой целью определяли профили рестрикции 5 штаммов, хранящихся в рабочей коллекции на полужидком агаре при комнатной температуре в течение 12 лет с пересевом 1 раз в год. В результате типирования установлено, что у 3 из 5 штаммов в процессе хранения произошло спонтанное изменение ЛО//-генерируемого профиля рестрикции ДНК, при этом у двух идентифицируется утрата одного из фрагментов в области 104-138
-1300 Vibtio cholerae eltoi 01 1999 patient Y-Sakhalinsk
-1300_ povt Vibtio cholerae eltor Ol 1999 patient Y-Sakhalinsk
-1308 Vibrio cholcrae eltor Ol 1999 patient Y-Sakhalinsk
-1308 PGA '/::>■ ■<: choietae eltoi Ol 1999 patient Y-Sakhalinsk
-1310 Vibrio cholerae eltor 01 1999 water Y-Sakhalinsk
-1310povt Vibtio cholerae eltor Ol 1999 water Y-Sakhalinsk
-1312 Vibrio cholcrae oltor Ol 1999 silt Y-Sakhalinsk
-1312 PGA Vibrio choietae eltoi Ol 1999 silt Y-Sakhalinsk
-1312_povt Vihiio choietae eltoi 01 1999 silt Y-Sakhalinsk
-1315 Vibtio choterae eltor Ol 1999 fish Y-Sakhalinsk
-1310. .PGA Vibrio cholerae eltor Ol 1999 water Y-Sakhalinsk
-1315 PGA Vibrio cholerae eltor Ol 1999 fish Y-Sakhalinsk
-1300. .PGA Vibrio cholerae eltor 01 1999 patient Y-Sakhalinsk
Рис. 5. Результаты пульс-электрофореза штаммов V. cholerae eltor, хранящихся в лиофилизированном состоянии и на ПЖА:
а - дендрограмма, построенная по алгоритму UP-GMA на основании сопоставления NotI-генерируемых
профилей рестрикции штаммов V. cholerae eltor; б-NotI-генерируемые паттерны штаммов V.cholerae eltor: 2 - И1300 (лиофилизированнный); 3 - И1300 (ПЖА); 4 - И1310 (лиофилизированнный); 5 - И1310 (ПЖА); 7 -И1312 (лиофилизированнный); 8 - И1312 (ПЖА); 1, 6, 9 -ДНК Salmonella ser. Braenderup H98124, рестрицированная Xbal (размерный стандарт).
т.п.н. и у одного - формирование дополнительного фрагмента в области 78-107 т.п.н. в сравнении с исходным профилем (рис. 5). В случае утраты фрагмента профиль рестрикции ДНК измененной субкультуры штамма соответствует одному из установленных вариабельных профилей при исследовании лиофилизированных вспышеч-ных V. cholerae (пульсотип VCN2), что позволяет предполагать существование определенной направленности генетических перестроек, приводящих к формированию указанного профиля. Повторные исследования в пульс-электрофорезе отдельных штаммов показали воспроизводимость результатов типирования: во всех случаях при повторном анализе получены идентичные профили рестрикции, что дает основание судить об отсутствии влияния серии эксперимента на изменчивость PFGE-профиля (см. рис. 5).
Рестрикция ДНК хранящихся на ПЖА V. cholerae eltor эндонуклеазой Sfil выявила изменение профиля тех же штаммов: у 2 из них установлена утрата одного фрагмента рестрикции, у третьего - двух фрагментов.
Полученные результаты свидетельствуют о вероятности генетических модификаций штаммов холерного вибриона в процессе хранения и пассажей на питательных средах, приводящих к изменению профиля рестрикции их ДНК. Для установления типа генетических изменений (мутации, затрагивающие сайты рестрикции или происходящие за их пределами), а также условий, определяю-
щих вероятность этих событий, требуется проведение дополнительных экспериментальных исследований.
В целом проведенное комплексное исследование показало, что все анализируемые эпидемически опасные штаммы V. cholerae eltor характеризуются однородностью фенотипа и идентичностью генотипа, установленного на основании амплификационного профилирования. Вместе с тем РFGE-типирование выявило вариабельность генотипа изолированных при эпидемических осложнениях штаммов холерного вибриона как на разных территориях, так и в пределах одной вспышки. В частности, на отдельные группы по структуре паттернов рестрикции дифференцируются изоляты из Приморья и г. Южно-Сахалинска. В свою очередь, популяция изолированных в период вспышки в г. Южно-Сахалинске V. cholerae eltor, по данным РFGE-типирования, характеризуется гетерогенностью, заключающейся в незначительных различиях структуры паттернов рестрикции ДНК. При этом большая часть (76,5%) вспы-шечных изолятов принадлежит к одному, распространенному во всех анализируемых очагах вспышки, паттерну. Штаммы с отличающимися от доминирующего профилями рестрикции не обнаруживают привязки к определенному месту выделения, тогда как прослеживается связь типа паттерна с временем, объектом выделения штамма и тяжестью клинического течения заболевания. Подобная неоднородность клональной структуры эпидемически опасных V. cholerae установлена D. Talkington и соавт. при РFGE-типировании штаммов холерного вибриона, изолированных в различные временные периоды эпидемии на о. Гаити [19]. Авторы определили 11 паттернов рестрикции с одним доминирующим, к которому принадлежало более 82% исследуемых штаммов.
Обнаружение в период вспышки штаммов холерного вибриона с гетерогенными профилями рестрикции ДНК определяет необходимость установления генетического родства изолятов разных пульсотипов для выяснения эпидемиологических взаимосвязей. С этой целью применяются разработанные Е Tenovar и соавт. [20] критерии, в соответствии с которыми изоляты, отличающиеся на одно генетическое событие (что проявляется, как правило, в изменении двух-трех фрагментов в структуре паттерна), следует характеризовать как близкородственные и являющиеся частью одной вспышки. Вместе с тем подобные выводы рекомендуется делать с учетом эпидемиологических данных и особенностей биологии возбудителя [7].
Нами установлено, что различия в структуре профилей рестрикции штаммов на вспышке в Южно-Сахалинске оказались минимальными - выявлено изменение одного фрагмента, визуализируемого при данных условиях электрофореза, или размерный сдвиг фрагментов (сходство вариабельных профилей с доминирующим составляет 95,2-97,7% - для та и 98-98,1% - для fi7). Принимая во внимание продолжительность вспышки - 20 дней (4 инкубационных периода), а также молекулярно-биологические особенности V. cholerae (в частности, высокую пластичность генома), нельзя исключить вероятность данных генетических изменений возбудителя в период вспышки. Кроме того, известно, что как в эндемичных очагах, так и при вспышках заносного характера на неэндемичных территориях накопление эпидемического клона возбудителя до критической концентрации происходит, как правило, в определенных участках поверхностных водоемов [2, 3], где под воздействием условий среды обитания также высока вероятность модификаций генома V cholerae.
С учетом изложенного следует заключить, что преимущественное обнаружение в период вспышки в Южно-Сахалинске штаммов одного пульсотипа, при-
надлежность к этому же пульсотипу заносного токси-генного штамма, минимальные отличия вариабельных PFGE-профилей в сравнении с доминирующим, а также установленная способность V. cholerae к спонтанному изменению паттерна рестрикции свидетельствуют о клональном характере вспышки с вероятным формированием субклонов в результате генетических преобразований под воздействием факторов макроорганизма и условий окружающей среды при реализации водного или контактно-бытового путей передачи инфекции.
Таким образом, результаты проведенного исследования демонстрируют эффективность использования комплексного макрорестрикционного анализа для углубленной характеристики популяционной структуры V cholerae и выяснения молекулярно-эпидемиологических закономерностей территориального распространения отдельных клонов возбудителя.
Сведения об авторах:
Федеральное казенное учреждение здравоохранения Иркутский Ордена Трудового Красного Знаме-ни научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Рос-потребнадзора), 664047 Иркутск, ул. Трилиссера, 78.
Миронова Лилия Валерьевна - и.о. зав. лаб. холеры, канд. мед. наук, e-mail: mironova-lv@yandex.ru;
Афанасьев Максим Владимирович - ведущий научный сотрудник отдела эпидемиологии, канд. биол. наук;
Басов Евгений Александрович - мл. науч. сотр. лаб. холеры;
Урбанович Людмила Яковлевна - ст. науч. сотр. лаб. холеры, д-р мед. наук;
Балахонов Сергей Владимирович - директор института, д-р мед. наук, проф.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания МУК 4.2.2218-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.
2. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. Эволюция эпидемиологии холеры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006; 6: 63-71.
3. Мединский Г.М., Ломов Ю.М. Холера в СССР в период седьмой пандемии. Покровский В.И., ред., М.; 2000: 26-7.
4. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я. и др. Молекулярная генетика, 2012; 2: 13-20.
5. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 5: 26-31.
6. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П. и др. Журнал микробиологии, эпидемилогии и иммунобиологии. 2000; 5: 31-5.
7. Barrett T.J., Gerner-Smidt P., Swaminathan B. Foodborne Pathog. Dis. 2006; 3(1): 20-31.
8. Chin C.S, Sorenson J., Harns J.B. et al. N. Engl. J. Med. 2011; 364: 33-42.
9. Cooper K.L., Luey C.K., Bird M. et al. Foodborne Pathog. Dis. 2006; 3(1): 51-8.
10. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Infect. Genet. Evol. 2009; 9(4): 43040.
11. Gilmour M.W., Martel-Laferriere V., Lévesque S. et al. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(6): 1124-5.
12. HunterP.R., GastonM.A. J. Clin.Microbiol. 1988; 26(11): 2465-6.
13. Kam K.M., Luey C.K., Tsang Y.M. et al. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(10): 4502-11.
14. Keddy K.H., Nadan S., Govind C., Sturm A.W. J. Med. Microbiol. 2007; 56(12): 1644-50.
15. MMWR. 2010. 59(45): 174-9.
16. MoritaM., OhnishiM., Arakawa E. et al. Microbiol. Immunol. 2008; 52: 314-7.
17. Nusrin S., Khan G. Y., Bhuiyan N. A. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(12): 5854-6.
18. Rapid standard laboratory protocol for molecular subtyping of Vibrio cholerae by Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE). In: The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance. CDC, Pulsenet USA; 2006.
19. Talkington D, Bopp C., Tarr C. et al. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(11): 2122-29.
20. TenoverF.C., ArbeitR.D., GoeringR.V. et al. J. Clin. Microbiol. - 1995; 33(9): 2233-9.
21. The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance [Электронный ресурс]. URL:http//www.pulsenetinternational. org. (дата обращения: 15.12.2012).
23. van Belkum A., Tassios P. T., Dijkshoorn L. et al. J. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 13 (Suppl. 3): 1-46.
Поступила 18.03.13
RETROSPECTIVE MACRORESTRICTIVE ANALYSIS OF THE VIBRIO CHOLERAE ELTOR STRAINS ISOLATED AT EPIDEMIC COMPLICATIONS IN THE FAR EAST OF RUSSIA
L. V. Mironova, M. V. Afanasev, E. A. Basov, L. Y. Urbanovich,
S. V. Balakhonov Irkutsk Antiplague Research Institute, Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Irkutsk, Russia
The retrospective study of the clonal structure of 24 Vibrio chol-erae eltor strains isolated at epidemic complications in the Far East of Russia was carried out on the basis of the macrorestrictive analysis of the genome DNA using NotI and Sfil endonucleases. It was found that clonal (by amplification profiling data) toxigenic strains (n = 23) were characterized by variability of NotI/ SfiI-generated restriction profiles. The V. cholerae eltor isolated in Yuzhno-Sakhalinsk outbreak were differentiated to four pulse-types with one dominating type detected in 76% of the strains. Individual restrictive NotI/SfiI-profile was characteristic for the isolates from Primorye Territory. A non-toxigenic strain formed a separate dendrogram line from the toxigenic strains on the basis of PFGE-pattern structure.
Efficiency of macrorestriction analysis application for the profound characteristic of the V. cholerae population structure and ascertainment of molecular-epidemiological regularities of territorial distribution of the separate V. cholerae clones was shown.
Key words: Vibrio cholerae, macrorestrictive analysis, PFGE, NotI endonuclease, Sfil endonuclease, molecular-epidemiological analysis
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.852.11:579.253].083.1:577.21.08
М.В. Афанасьев, Е.В. Кравец, З.Ф. Дугаржапова, В.Е. Такайшвили, В.С. Половинкина,
С.В. Балахонов
сравнительный мультилокусный vntr- и snp-анализ вакцинных штаммов bacillus anthracis
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Проведен сравнительный анализ VNTR- и SNP-генотипов четырех штаммов Bacillus anthracis, три из которых вакцинные, один — вирулентный. В процессе анализа установлено, что данные штаммы формировали четыре SNP-паттерна, полностью соотносящихся с VNTR-профилями. Обнаружено, что все исследуемые штаммы, кроме вакцинного B. anthracis СТИ-1, по SNP-профилю не могли быть отнесены к трем распространенным в мире глобальным генетическим линиям возбудителя сибирской язвы.
Ключевые слова: Bacillus anthracis; генотипирование; VNTR-анализ; SNP-анализ; эпидемиология сибирской язвы; сибиреязвенные вакцины
Сибирская язва относится к группе особо опасных инфекционных болезней, общих для человека и животных, с потенциальной возможностью использования возбудителя данного заболевания, Bacillus anthracis, для биотеррористических целей. Поэтому каждый случай заболевания людей и/или животных с подозрением на сибирскую язву требует особого внимания и эпидемиологического расследования, основанного на результатах лабораторного анализа. Лабораторное подтверждение диагноза сибирской язвы относится к ключевым факторам, определяющим необходимость проведения комплекса противоэпизоотических, противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на выявление путей и факторов передачи инфекции, локализацию и ликвидацию очага сибиреязвенной инфекции, а также предотвращение дальнейшего распространения возбудителя [6].
При лабораторном исследовании штаммов B. anthracis в качестве дополнительного метода применяется молекулярно-генетическое MLVA-типирование, позволяющее установить принадлежность выделенных культур возбудителя к определенному генотипу. Сравнительный анализ генотипов исследуемых штаммов не только открывает
возможность выявления или подтверждения предполагаемого источника инфекции, путей и факторов передачи, но и дает возможность значительно расширить объективные данные о биологических особенностях конкретного изо-лята возбудителя. Большое значение имеет возможность дифференциации с помощью генотипирования вакцинных штаммов, применяемых в клинической практике и ветеринарии, от полевых, в том числе и атипичных, при исследовании материала с подозрением на контаминацию возбудителем сибирской язвы, в случаях сибиреязвенных эпизоотий, а также для исключения случаев внутрилабора-торной контаминации исследуемых образцов.
В связи с вышеизложенным в последние годы как у нас в стране, так и за рубежом растет число публикаций, посвященных различным аспектам генотипирова-ния сибиреязвенного микроба [3—5, 7, 8, 11, 14], в том числе и вакцинных штаммов [5]. Однако в зарубежных работах встречается информация только об одном штамме российского происхождения — СТИ-1 [10]. Российские исследователи, изучившие генотипы 5 известных вакцинных штаммов [5], пришли к заключению, что использование данных о структуре VNTR-генотипов по 18 вариабельным локусам хромосомной локализации оказывается недостаточным для дифференциации вакцинных штаммов В. anthracis 55 ВНИИВВиМ и СТИ-1.
В представленной работе для расширенной молекулярно-генетической характеристики вакцинных штаммов с целью их идентификации и дифференциации нами был выполнен анализ вариабельности 15 VNTR-локусов [10, 15], а также изучены дополнительные генетические детерминанты и 12 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [14], для детекции которых впервые был применен новый методический подход и разработана система оригинальных олигонуклеотидных зондов.
