CC BY
171
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.9-022-078:577.21.083
Миронова Л.В., Афанасьев М.В., Балахонов С.В. применение технологии пульс-электрофореэа в молекулярном типи-
ровании возбудителей особо опасных инфекций
Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Иркутский Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора), 664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, 78
Макрорестрикционный анализ ДНК микроорганизмов с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE-ти-пирование, пульс-электрофорез) используется в молекулярной биологии для изучения клональной структуры и типирования возбудителей инфекционных заболеваний. На основании сопоставления паттернов рестрикции ДНК осуществляется установление степени родства, определение эпидемиологических взаимосвязей исследуемых изолятов и изучение эволюционной истории патогенов. В обзоре представлен анализ результатов применения пульс-электрофореза в молекулярно-эпидемиологических исследованиях и изучении филогении возбудителей особо опасных инфекций - холеры и чумы. Продемонстрирована возможность характеристики генетической гетерогенности популяций Vibrio cholerae и Yersinia pestis, территориальных и эпидемиологических особенностей распространения изолятов разных пульсоти-пов, а также обсуждены проблемы и перспективы использования метода PFGE-типирования в системе эпидемиологического надзора за холерой и чумой в РФ.
Ключевые слова: гель-электрофорез в пульсирующем поле; пульс-электрофорез; молекулярное титрование; паттерны рестрикции; Vibrio cholerae; Yersinia pestis.
Общие сведения о методе гель-электрофореза в пульсирующем поле
Гель-электрофорез в пульсирующем поле (пульс-электрофорез; англ. Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE) - один из широко используемых в молекулярной биологии методов, позволяющих за счет периодически изменяющегося направления напряженности электрического поля, прилагаемого к агарозной пластине с нанесенными на нее образцами, разделять фрагменты ДНК большого размера (от нескольких сотен тыс.пар нуклео-тидов - т.п.н. - до нескольких млн п.н.) [1, 2].
Первые успешные исследования по фракционированию крупных молекул ДНК были проведены более 20 лет назад D. C. Schwartz и соавт. [2-4]. Авторы, изучая кариотип дрожжей Saccharomyces cerevisiae, предложили новый способ экстракции ДНК (с сохранением ее нативной структуры) и разделения молекул в специально сконструированной камере для электрофореза [3, 4].
В настоящее время метод пульс-электрофореза сохраняет свою актуальность и находит применение в различных фундаментальных и прикладных областях молекулярной биологии и генетики. В частности, пульс-электрофорез применяется для кариотипиро-вания низших эукариот [5, 6], геномного картирования бактерий, грибов, хромосом высших эукариот [7-9], анализа геномных библиотек [10], в таксономических исследованиях [11].
Одной из основных прикладных областей применения пульс-электрофореза является молекулярное типирование возбудителей инфекционных заболеваний человека бактериальной природы -PFGE-типирование или макрорестрикционный анализ ДНК [12, 13]. Этот подход основывается на сравнительном анализе паттернов рестрикции, полученных при обработке хромосомной ДНК микроорганизма редкощепящими эндонуклеазами. Сравнение рестрикционных паттернов позволяет определять степень родства исследуемых штаммов и на основании этого устанавливать вероятные источники, пути, факторы передачи и распространения инфекции, а также в ряде случаев проводить филогенетический анализ и реконструировать эволюционную историю патогена.
Собственно процедура молекулярного типирования с использованием пульс-электрофореза состоит из нескольких этапов. На первом этапе осуществляется подготовка препарата ДНК, заключающаяся в иммобилизации микробных клеток ис-
следуемого штамма с заданной концентрацией в блоки из легкоплавкой агарозы, что предотвращает фрагментацию молекул нуклеиновой кислоты. Далее агарозные блоки с иммобилизованными клетками подвергаются лизису с последующей отмывкой от клеточного дебриса [1, 12, 13].
На следующем этапе ДНК в агарозных блоках обрабатывается эндонуклеазами рестрикции. Выбор фермента для макрорестрик-ционного анализа основывается на структурных особенностях генома исследуемого микроорганизма, таких как наличие и частота встречаемости специфического сайта рестрикции, общий нуклеотидный состав [12]. Как правило, используются эндону-клеазы с сайтом узнавания 6 п.н. и более, при этом формируется до 30 фрагментов рестрикции в диапазоне от 20 до 600 т.п.н., что считается достаточным для проведения сравнительного анализа паттернов [12, 13]. Этап разделения полученных рестриктов выполняется в специальной камере, геометрия электродов которой позволяет менять вектор электрического поля. Программируемый процессор дает возможность настройки основных параметров электрофореза (угол между векторами электрического поля, интервал переключения, напряженность, общее время электрофореза) в зависимости от диапазона длин разделяемых фрагментов ДНК [12]. Существует ряд установок для проведения электрофореза в пульсирующем поле, различающихся по схеме расположения электродов в камере, параметрам электрического поля (гомогенное, негомогенное), размещению геля (горизонтальное, вертикальное) [2]. Наиболее широко в молекулярной биологии применяется система для пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field — CHEF), в которой электроды расположены по гек-согональному контуру и обеспечивается гомогенность электрического поля в каждой точке геля на протяжении всего процесса. Такая конструкция камеры обеспечивает высокое качество фракционирования фрагментов ДНК микроорганизмов [2, 14].
Заключительный этап предусматривает визуализацию, регистрацию результатов пульс-электрофореза с использованием видеодокументирующих систем, оснащенных соответствующим программным обеспечением. Идентификация размеров рестрик-тов в индивидуальном паттерне каждого штамма осуществляется на основании сопоставления их с рекомендованным PulseNet размерным стандартом (Xbal-генерированным паттерном рестрикции ДНК штамма Salmonella serovar Braenderup H98124) или ДНК фага ламбда [12, 13, 15]. Для выяснения степени генетического родства исследуемых штаммов проводится основанный на сравнении рестрикционных профилей кластерный анализ с расчетом коэффициента сходства Dice [12]. Известно, что различия профилей рестрикции изолятов определяются генетическими событиями, такими, как делеции или инсерции протяженных участков генома, или точечные замены в сайтах узнавания рестриктазы. При этом необходимо учитывать, что одно генетическое событие, особенно затрагивающее сайт рестрикции (например, точечная замена нуклеотида), может вызвать большие изменения паттерна, чем несколько генетических изменений, происходящих в других участках генома, которые могут остаться невыявленными [13].
Для определения взаимосвязи исследуемых изолятов при интерпретации результатов используются критерии, предложенные F.C. Tenover и соавт. [16], в соответствии с которыми штаммы, электрофоретические паттерны которых отличаются 2-3 фрагментами, обозначаются как близкородственные (англ. «closely related»). В случае отличия профилей по 4-6 фрагментам штаммы относятся к возможно родственным (англ. «possibly related»), а при отличии по 7 фрагментам и более - к различным или несвя-
занным (англ. «different/unrelated»). При этом отличия на 2-3, 4-6, 7 фрагментов и более соотносятся с одним, двумя, тремя и более генетическими событиями соответственно. Однако существуют и другие точки зрения на порядок интерпретации результатов. Так, A. van Belkum и соавт. [13] рекомендуют обозначать штаммы с абсолютно идентичными профилями рестрикции как «неразличимые» (англ. indistinguishable), штаммы, имеющие до четырех отличий - как относящиеся к родственным субтипам. T.J. Barrett и соавт. [17] к одному кластеру рекомендуют относить штаммы, демонстрирующие неразличимые профили рестрикции, более вариабельные изоляты могут быть объединены при условии, что вспышка продолжается длительное время и имеет место контактный путь передачи инфекции. Очевидно, что при интерпретации данных следует учитывать множество других факторов, таких как биологические особенности исследуемого микроорганизма, длительность вспышки, результаты эпидемиологического анализа. В случае недостаточной эффективности внутривидовой дифференциации штаммов и проблем с интерпретацией результатов при использовании одного фермента рестрикции рекомендуется применить дополнительные эндонуклеазы (что может способствовать повышению дискриминирующей способности PFGE) либо дополнить анализ другими методами молекулярно-генетического типирования [13, 18].
В целом процедура молекулярного типирования с использованием пульс-электрофореза достаточно продолжительна (2-3 дня), требует применения высококачественных реактивов, строгого соблюдения стандартных протоколов исследования на каждом этапе для обеспечения возможности внутри- и межлабораторного сопоставления результатов. В международном масштабе исследования возбудителей бактериальных инфекций методом пульс-электрофореза организуются посредством глобальной международной лабораторной сети PulseNet [15]. Разработанные стандартные протоколы пробоподготовки для разных видов микроорганизмов, рекомендованные эндонуклеазы рестрикции, программы электрофореза, алгоритмы анализа и интерпретации полученных электрофоретических паттернов, использование общих контрольных и стандартных штаммов, а также система обмена и хранения полученной информации позволяют осуществлять глобальный мониторинг за возбудителями инфекционных болезней и проводить сравнительный анализ результатов.
Таким образом, метод молекулярного типирования микроорганизмов с использованием пульс-электрофореза, несмотря на отдельные ограничения (сложность и длительность постановки, необходимость строгой стандартизации протокола, высокие требования к квалификации специалистов, существование нетипируемых штаммов, отсутствие связи между размерами и распределением рестрикционных фрагментов в паттерне с их нуклеотидной последовательностью), характеризуется рядом преимуществ, таких как высокая дискриминирующая способность, возможность биоинформационного анализа результатов, корреляция их с эпидемиологическими данными, что дает основание рассматривать его в качестве эффективного инструмента молекулярного типирования микроорганизмов [19, 20], в том числе и возбудителей особо опасных инфекций.
PFGE-типирование V. cholerae
Первые исследования по PFGE-типированию V. cholerae были проведены в начале 90-х годов прошлого столетия отдельными группами авторов. Так, D.N. Cameron и соавт. [21] при анализе Notl-генерируемых макрорестрикционных профилей 180 изоля-тов V. cholerae О1 (из Юго-Восточной Азии, Африки, Латинской Америки и др.), принадлежащих к шести MLEE-типам и 27 рибо-типам, выявили 63 различных PFGE-паттерна, причем штаммы по макрорестрикционным профилям делились как внутри одного MLEE-типа, так и риботипа, что свидетельствовало о большей дискриминирующей способности PFGE-типирования по сравнению с другими методами. Кроме того, были установлены и географические особенности распределения PFGE-генотипов.
S. Mahalingam и соавт. [22] исследовали в PFGE штаммы V. cholerae eltor 01, выделенные на двух вспышках холеры и при спорадических случаях заболевания в Малайзии. При этом для рестрикции хромосомной ДНК использовали 2 фермента NotI и Sfil (выбор ферментов основывался на наличии специфических
сайтов рестрикции и нуклеотидном составе (мол. % ГЦ) геномной ДНК V. cholerae). В результате генерировались паттерны рестрикции из 13-24 фрагментов размером от 46 до 398 т.п.н. При сравнительном анализе было установлено, что профили рестрикции штаммов, выделенных в период вспышек, оказались сходными, но не идентичными, а для изолятов при спорадических случаях были характерны гетерогенные PFGE-профили. Результаты исследований позволили сделать заключение об эффективности PFGE в качестве метода молекулярного типирова-ния для проведения эпидемиологического анализа.
Позднее была проведена серия работ по оптимизации протокола PFGE-типирования и оценке возможности его использования для молекулярно-эпидемиологического типирования. Так, A. Dalsgaard и соавт. [23] при типировании штаммов холерного вибриона О139 из Таиланда и сопоставлении их рестрикци-онных профилей с профилями V. cholerae О139 серогруппы из других регионов осуществляли подбор оптимального для пульс-электрофореза фермента рестрикции. Сравнение генерируемых фрагментов рестрикции хромосомной ДНК при использовании 7 ферментов показало, что Xhol и Xbal обеспечивают формирование более 25 фрагментов размером менее 50 т.п.н.; Swal и Smal -30 фрагментов размером менее 150 т.п.н. и 25 фрагментов размером менее 100 т.п.н. Гидролиз ДНК ферментами Sfil и NotI приводит к образованию хорошо различимых фрагментов в диапазоне размеров менее 550 т.п.н. (более 30 фрагментов) и менее 440 т.п.н. (около 25 фрагментов), а CpoI - 25 хорошо дифференцированных фрагментов размером менее 550 т.п.н. и обеспечивает при этом хорошую дискриминацию тестируемых штаммов. На основании этих результатов авторы в качестве оптимального предложили использовать фермент CpoI. Однако в процессе дальнейших исследований A. Dalsgaard и соавт. [24], а также ряд других авторов [25-27] применяли протокол пульс-электрофореза с рестрикцией ДНК ферментом NotI, что обеспечило возможность хорошей дифференциации штаммов и сопоставимость результатов с эпидемиологическими данными. В частности, NotI-рестрикционное картирование штаммов V. cholerae Ol и 0139, изолированных в Гонконге в 1994-2002 гг., показало корреляцию результатов типирования с эпидемиологическими данными: на зарегистрированных в Гонконге вспышках холеры обнаруживались идентичные или сходные PFGE-профили, существенно отличающиеся от профилей других, эпидемиологически не связанных изолятов [28].
Вместе с тем отсутствие стандартизации отдельных этапов протокола PFGE-типирования V. cholerae, в том числе в отношении подготовки штаммов к исследованию, состава используемых растворов, параметров электрофореза препятствовало межлабораторному сопоставлению результатов типирования и установлению вероятных путей распространения инфекции.
С целью стандартизации метода Центром по контролю и профилактике заболеваемости США (CDC, США) и сетью PulseNet был разработан протокол PFGE-типирования V. cholerae [29, 30]. Из группы ферментов Sfil, NotI, ApaI, AscI, Xbal, BlnI, Spei в качестве наиболее эффективных определены SfiI и NotI, с использованием которых генерировалось достаточное число рестрик-тов и паттерны обеспечивали высокий уровень дискриминации штаммов, не затрудняя интерпретацию результатов.
В 2013 г. CDC на основании существующего ранее PulseNet протокола PFGE-типирования V. cholerae оформлена стандартная операционная процедура PFGE V. cholerae и V. parahaemo-lyticus, предназначенная для обеспечения возможности межлабораторного сопоставления результатов пульс-электрофореза, полученных участниками сети PulseNet [31].
Выполненные на основании стандартного протокола исследования показали возможность установления источников, путей и факторов распространения холерного вибриона при эпидемических осложнениях, характеристики клональной структуры популяции V. cholerae, выявления вероятных направлений заноса возбудителя на территорию. В частности, при выяснении причин вспышки холеры на о-ве Гаити первоначальное заключение о вероятности заноса инфекции с территории Южной Азии сделано по данным PFGE-типирования. Было установлено, что паттерны рестрикции 14 исследуемых клинических изолятов с о-ва Гаити идентичны друг другу и соответствуют имеющемуся в базе данных PulseNet PFGE-паттерну KZGN11.0092/KZGS12.0088, который обнаруживали в Южной Азии и на других территориях
[32, 33]. На основании исследования рестрикционных профилей V. cholerae подтверждены результаты эпидемиологического расследования заноса холеры в Канаду с о-ва Гаити [34], проведена оценка динамики структуры популяции холерного вибриона во время эпидемии на о-ве Гаити и показана вариабельность PFGE-паттернов (11 генотипов с одним доминирующим, выявленным более чем у 80% штаммов), не демонстрирующая определенных закономерностей изменения во времени [35].
K.H. Keddy и соавт. [36] показана клональная гетерогенность изолятов, выделенных в Африке при эпидемических осложнениях в различные временные периоды, что согласуется с результатами других методов молекулярного типирования. Интересен факт подтверждения (с использованием комплекса молекулярно-генетических методов, в том числе анализа «мобилома» и макро-рестрикционного картирования) заносного происхождения случая холеры в Африке. При исследовании V. cholerae от больного, вернувшегося в Африку из Индии в 2010 г., H. Ismail и соавт. [37] установили наряду с присутствием в геноме данного изолята ну-клеотидной последовательности субъединицы В холерного токсина седьмого генотипа (ctxB7), аллели tcpAC'RS принадлежность его к уникальному PFGE-паттерну, не обнаруживаемому ранее в популяции африканских штаммов холерного вибриона, что свидетельствует об определенной территориальной приуроченности V. cholerae разных пульсотипов и доказывает перспективность применения метода при установлении направлений заноса возбудителя. Территориальные особенности макрорестрикцион-ного профиля V. cholerae продемонстрированы также при исследовании репрезентативной выборки изолятов холерного вибриона, выделенных в Занзибаре в 2009 г. [38].
В ряде случаев PFGE-типирование V. cholerae оказывается информативным и при изучении эволюционных изменений возбудителя холеры. Так, комплексный молекулярно-генетический анализ изолированных в 2006-2011 гг. в г. Дакка (Бангладеш) эпидемических штаммов показал, что обнаруживаемые с 2008 г. изоляты холерного вибриона с геном субъединицы В холерного токсина генотипа 7 (ctxB7) характеризуются клональностью NotI-генерируемых профилей [39], тогда как выделенные на этой же территории в 2011-2012 гг. V. cholerae eltor содержат прототипный эльтор-специфический ген ctxB (ctxB3) и формируют отдельный PFGE-паттерн, идентичный паттернам ранее циркулирующих в Бангладеш типичных штаммов этиологического агента седьмой пандемии холеры, что послужило основанием для заключения о быстрой смене глобальных тенденций эволюции и распространения холеры [40].
Таким образом, PFGE-типирование холерного вибриона с соблюдением стандартного протокола исследования способствует выяснению эпидемиологических закономерностей осложнений по холере, характеризует клональную структуру возбудителя и особенности географического распространения отдельных клонов, а в ряде случае оказывается эффективным и при изучении эволюционных процессов, лежащих в основе формирования новых вариантов патогена.
pFGE-типирование Y. pestis
Исследования генома Y. pestis методом пульс-электорфореза начались в 90-е годы прошлого столетия. Первоначально данный подход использовался для определения структурных особенностей генома Y. pestis [41]. Авторами было проанализировано 16 редкощепящих эндонуклеаз рестрикции: NotI, Sfil, SgrAI, PacI, AscI, AvrII, Spel, BssHII, SmaI, NheI, XbaI, DraI, KspI, SfiuI, SspI и ApaI, из которых только четыре - NotI, SpeI, AscI и SfiI - обеспечивали достаточное разрешение фрагментов при электрофорезе. При этом наилучшие результаты демонстрировала эндонуклеаза SpeI, поскольку в случае использования других ферментов наблюдалось большее количество высоко- и/или низкомолекулярных фрагментов, разделение которых в применяемых условиях электрофореза было затруднено. При анализе рестрикционных паттернов исследованных штаммов был определен размер генома возбудителя чумы, идентифицированы фрагменты, ассоциированные с изменением фенотипа. Несмотря на то что исследуемая выборка ограничивалась 16 штаммами, часть из которых являлась лабораторными производными штамма Y. pestis KIM, авторам удалось провести сравнение паттернов рестрикции штаммов разных биоваров и показать соответствие профиля рестрикции био-
вару и высказать предположение об эволюции и глобальном распространении возбудителя чумы в мире. Так, большое сходство паттернов рестрикции штаммов биовара orientalis, выделенных на о-ве Ява и территории Северной Америки, рассматривалось как подтверждение гипотезы о заносе чумы из Индокитая на Североамериканский континент в процессе третьей пандемии. Так же о соответствии рестрикционного профиля биовару и фенотипиче-ским свойствам возбудителя упоминалось в работе A. Rakin и J. Heesmann [42]. Для рестрикции авторами использовались эндо-нуклеазы I-Ceul и Blnl. Получаемые при использовании данных ферментов рестрикционные паттерны соотносились с биоваром исследуемого штамма и Pgm+^фенотипом. Поскольку I-CeuI осуществляет специфический гидролиз бактериальной ДНК по 25-нуклеотидному сайту, локализованному в гене рибосомальной РНК rrl, разрешающая способность метода PFGE с ее использованием не превышает такового для риботипирования.
Еще одним вариантом изучения структурных особенностей генома Y. pestis является применение метода PFGE для физического разделения внехромосомных репликонов - плазмид с целью их последующего выделения и изучения [43].
A. Guiyoule и соавт. [44] при анализе 28 штаммов Y. pestis, изолированных на Мадагаскаре из клинического и полевого материала, использовали PFGE в сочетании с риботипированием в качестве дополнительного инструмента, позволившего установить, что вариабельность Y. pestis в природных очагах о-ва Мадагаскар является результатом генетической изменчивости возбудителя, а не результатом многократных заносов инфекции на территорию острова. При этом методика пульс-электрофореза за счет использования соответствующих эндонуклеаз рестрикции продемонстрировала большую дискриминирующую способность по сравнению с риботипированием: в структуре основного риботипа В было выявлено 8 пульсотипов, риботипы R и Q включали два и один пульсотип соответственно.
В течение последнего десятилетия пульс-электрофорез применялся для исследования генетической гетерогенности возбудителя чумы в природных очагах на разных континентах [45-48]. При помощи этого метода была охарактеризована клональная структура возбудителя в очагах, связь определенных пульсоти-пов с местом выделения штамма. На ограниченных, локальных выборках метод демонстрировал высокую разрешающую способность, превосходя такие традиционные методы генотипиро-вания чумы, как анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов IS100 и IS2S5.
В то же время данный метод не совсем подходит для изучения эволюции и распространения Y. pestis в мире с использованием глобальных коллекций, поскольку отмечалось сходство ре-стрикционных паттернов изолятов, выделенных в географически удаленных и не связанных между собой очагах [45]. Данный феномен объяснялся тем, что механизмы генетической изменчивости возбудителя чумы достаточно ограничены и реализуются по одинаковым принципам вне зависимости от места и времени выделения штамма.
Не до конца разрешенной остается и проблема стабильности и воспроизводимости методики PFGE. Так, в исследовании A. Guiyoule и соавт. было обнаружено, что субклоны, полученные из изолированных колоний одного штамма, имеют разные рестрикционные паттерны [49]. В связи с этим авторами была поставлена под сомнение возможность использования пульс-электрофореза для эпидемиологического расследования случаев чумы. В то же время в ряде последующих работ [46, 48] при проверке субклонов одного и того же штамма наблюдались идентичные результаты, а потенциальная возможность появления различий объяснялась нестандартными условиями хранения и многократным пассированием штаммов. Кроме того, описан успешный опыт применения PFGE при эпидемиологическом расследовании случая чумы у человека [50].
В 2006 г. CDC и PulseNet предложен унифицированный протокол PFGE-типирования Y. pestis, содержащий исчерпывающую информацию о порядке и последовательности выполнения исследования, необходимых реактивах и оборудовании, рекомендуемых рестриктазах, программах электрофоретического разделения для разных PFGE-систем [51].
Таким образом, методику пульс-электрофореза можно рассматривать как эффективный инструмент для определения осо-
бенностей проникновения и распространения возбудителя чумы на ограниченной территории (особенно в сочетании с другими методами анализа), эпидемиологического анализа случаев спорадической и групповой заболеваемости чумой, изучения территориальных особенностей распространения штаммов чумы в природном очаге, напряженности эпизоотического процесса и исследования структурных особенностей генома Y. pestis.
Заключение
Разработанный более двух десятилетий назад метод ма-крорестрикционного анализа ДНК с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле сохраняет свою актуальность в качестве эффективного инструмента молекулярного ти-пирования микроорганизмов, несмотря на интенсивное развитие и внедрение в практику в последние годы технологий высокопроизводительного секвенирования геномов. Возможности пульс-электрофореза, заключающиеся в анализе профиля рестрикции полного генома патогенов, позволяют идентифицировать различные генетические модификации (как в сайтах рестрикции, так и за их пределами при условии существенных перестроек -протяженные делеции/инсерции), приводящие к изменению PFGE-паттерна, что обеспечивает внутривидовую дифференциацию изолятов с достаточно высоким уровнем дискриминации. При этом в отличие от подходов, направленных на определение полной нуклеотидной последовательности ДНК, PFGE дает общее представление о структуре генома исследуемого микроорганизма на основании его макрорестрикционного профиля, что определяет значимость данного метода в качестве одного из стартовых в схеме молекулярного типирования изолированной культуры. Эффективность применения пульс-электрофореза обусловлена и наличием разработанных международных стандартных протоколов исследования для целого ряда возбудителей инфекционных заболеваний, в т.ч. особо опасных (холера, чума), существованием доступных компьютерных программ для анализа результатов. Установленная различными группами исследователей корреляция результатов PFGE-типирования с эпидемиологическими данными, пространственно-географическими характеристиками изолятов, свидетельствует о целесообразности его применения для выяснения родства штаммов в рамках оперативного и ретроспективного анализа при расследовании обусловленных возбудителями особо опасных инфекций эпидемических осложнений, изучении структуры популяции циркулирующих в поверхностных водоемах штаммов холерного вибриона и обнаруживаемых в природных очагах чумы Y рestis.
Вместе с тем в Российской Федерации ограничением для эффективного применения PFGE-типирования в системе эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями является отсутствие единой сети сбора, анализа результатов макрорестрикционного картирования, а также интеграции в международные базы данных для установления глобальных тенденций распространения патогенов. Что касается возбудителей особо опасных инфекций, то наряду с указанными проблемами очевидна необходимость адаптации существующих стандартных протоколов исследования с учетом национальных требований безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патоген-ности для внедрения технологии PFGE-типирования в систему надзора за данной группой инфекций в РФ.
Сведения об авторах:
Миронова Лилия Валерьевна - канд. мед. наук, и.о. зав. лабораторией холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Рос-потребнадзора, e-mail: mironova-lv@yandex.ru;
Афанасьев Максим Владимирович - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. отдела эпидемиологии ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Рос-потребнадзора, e-mail: afanasev_max@mail.ru;
Балахонов Сергей Владимирович - д-р мед.наук, проф., директор института, ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспот-ребнадзора, e-mail: balakhonov.irk@mail.ru.
ЛИТЕ РА Т У РА/REFERENCES
1. Herschleb J., Ananiev G., Schwartz D.S. Pulsed-field gel electrophoresis. Nat. Prot. 2007; 2 (3): 677-84.
2. Насонова Е.С. Пульс-электрофорез: теория метода, инструментальный арсенал и области применения. Цитология. 2008; 50 (11): 927-35.
Nasonova E.S. Pulse field gel electrophoresis: theory, instrument and application. Citologiya. 2008; 50 (11): 927-35. (in Russian)
3. Schwartz D. C., Saffran W., Welsh J., Haas R., Goldenberg M., Cantor C. R. New techniques for purifying large DNAs and studying their properties and packaging. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1982; 47: 189-95.
4. Schwartz D. C., Cantor C. R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 1984; 37: 67-75.
5. Beadle J., Wright M., McNeely L., Bennett J.W. Electrophoretic karyotype analysis in fungi. Adv. Appl. Microbiol. 2003; 53: 243-70.
6. Wieloch W. Chromosome visualisation in filamentous fungi. J. Microb. Methods. 2006; 67 (1): 1-8.
7. El-Osta Y.G., Hillier A.J., Dobos M. Construction of a combined physical and genetic map of the chromosome of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 and characterization of the rRNA operons. Microbiology. 2005; 151(3): 875-92.
8. Gemmill R.M., Bolin R., Albertsen H., Tomkins J.P., Wing R.A. Pulsed-field gel electrophoresis for long-range restriction mapping. Curr. Protoc. Hum. Genet. 2002; 5 (5.1).
9. Suga H., Ikeda S., Taga M., Kageyama K., Hyakumachi M. Electro-phoretic karyotyping and gene mapping of seven formaespeciales in Fusarium solani. Curr. Genet. 2002; 41 (4): 254-60.
10. Zhang H.B., Wing R.A. Physical mapping of the rice genome with BACs. Plant. Mol. Biol. 1997; 35 (1-2): 115-27.
11. Сидоренко А.В., Новик Г.И., Акимов В.Н. Использование методов геносистематики в классификации и идентификации бактерий рода Bifidobacterium. Микробиология. 2008; 7 (3): 293-302.
Sidorenko A.V., Novik G.I., Akimov V.N. Application of molecular methods to classification and identification of bacteria of the genus Bifidobacterium. Mikrobiologiya. 2008; 7 (3): 293-302. (in Russian)
12. Goering R.V. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infect. Gen. Evol. 2010; 10: 866-5.
13. van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N.K. et al. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM). Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 13 (3): 1-46.
14. Chu G., Gunderson K. Separation of large DNA by a variableangle contour-clamped homogeneous electric field apparatus. Anal. Biochem. 1991; 194 : 439-46.
15. The Interational Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance. Available at: http//www.pulsenetinternational. org (accessed 15 December 2012).
16. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., Swaminathan B. Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing. J. Clin. Microbiol. 1995; 33 (9): 2233-9.
17. Barrett T.J., Gerner-Smidt P., Swaminathan B. Interpretation of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns in Foodborne Disease Investigations and Surveillance. FoodbornePathog. Dis. 2006; 3 (1): 20-31.
18. Bosch T., de Neeling A.J., Schouls L.M., van der Zwaluw K.W., Kluytmans J.A., Grundmann H., Huijsdens X.W. PFGE diversity within the methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonal lineage ST398. BMC Microbiol. 2010; 10 (40): doi: 10.1186/1471-2180-10-40.
19. Singh A., Goering R.V., Simjee S., Foley S. L., Zervos M.J. Application of Molecular Techniques to the Study of Hospital Infection. Clin. Microb. Rev. 2006; 19 (3): 512-30.
20. Lukinmaa S., Nakari U.M., Eklund M., Siitonen A. Application of molecular genetic methods in diagnostics and epidemiology of food-borne bacterial pathogens. APMIS. 2004; 112 (11-12): 908-29.
21. Cameron D.N., Khambaty F.M., Wachsmuth I.K., Tauxe R.V., Barrett T.J. Molecular Characterization of Vibrio cholerae 01 Strains by Pulsed-Field Gel Electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 1994; 32 (7): 1685-90.
22. Mahalingam S., Cheong Y.M., Kan S., Yassin R.M., Vadivelu J., Pang T. Molecular epidemiologic analysis of vibrio cholerae 01 isolates by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 1994; 32 (12): 2975-9.
23. Dalsgaard A., Skov M.N., Serichantalergs O., Echeverria P. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and ribotyping for
subtyping of Vibrio cholerae 0139 isolated in Thailand. Epidemiol. Infect. 1996; 117: 51-8.
24. Dalsgaard A., Skov M.N., Serichantalergs O., Echeverria P., Meza R., Taylor D.N. Molecular Evolution of Vibrio cholera O1 strains isolated in Lima, Peru, from 1991 to 1995. J. Clin. Microbiol. 1997; 35 (5): 1151-6.
25. Evins G.M., Cameron D.N., Wells J.G., Greene K.D., Popovic T., Giono-Cerezo S. et al. The Emerging Diversity of the Electropho-retic Types of Vibrio cholerae in the Western Hemisphere. J. Infect. Dis. 1995; 172 (1): 173-9.
26. Albert M.J., Bhuiyan N.A., Talukder K.A., Faruque A.S., Nahar S., Faruque S.M. et al. Phenotypic and Genotypic Changes in Vibrio cholerae O139 Bengal. J. Clin. Microbiol. 1997; 35 (10): 2588-92.
27. Bag P.K., Maiti S., Sharma C., Ghosh A., Basu A., Mitra R. et al. Rapid spread of the new clone of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor in cholera endemic areas in India. Epidemiol Infect. 199; 121 (2): 245-51.
28. Kam K.M., Luey C.K., Tsang Y.M., Law C.P., Chu M.Y., Cheung T.L., Chiu A.W. Molecular subtyping of Vibrio cholerae O1 and O139 by pulsed-field gel electrophoresis in Hong Kong: correlation with epidemiological events from 1994 to 2000. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (10): 4502-11.
29. Rapid standard laboratory protocol for molecular subtyping of Vibrio choleraeby Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE). The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance. CDC, Pulsenet USA; 2006.
30. Cooper K.L., Luey C.K., Bird M., Terajima J., Nair G.B., Kam K.M. et al. Development and Validation of a PulseNet Standardized Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Subtyping of Vibrio cholerae. Foodborne Pathog. Dis. 2006; 3 (1): 51-8.
31. Standard operating procedure for PFGE of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus. Interational Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance. Pulsenet International. 2013. Available at: http://www.pulsenetinternational.org/assets/PulseNet/ uploads/pfge/PNL06_Vchol-VparahPFGEprotocol. pdf (accessed 22 January 2013).
32. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P., Charles R.C., JeanCharles R.R. et al. The Origin of the Haitian Cholera Outbreak Strain. N. Engl. J. Med 2011; 364: 33-4-2.
33. Morbidity and Mortality Weekly Report. CDC. 2010; 59(45): 174179. Available at: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/ mm5945a1.htm?s_cid=mm5945a1_w (accessed 22 January 2013).
34. Gilmour M.W, Martel-Laferriere V., Lévesque S., Gaudreau C., Bekal S., Nadon C., Bourgault A.M. Vibrio cholerae in traveler from Haiti to Canada. Emerg. Infect. Lts. 2011; 17 (6): 1124-5.
35. Talkington D., Bopp C., Tarr C., Parsons M.B., Dahourou G., Freeman M. et al. Characterization of Toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010-2011. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17 (11): 2122-9.
36. Keddy K.H., Nadan S., Govind C., Sturm A.W. Evidence for a clonally different origin of the two cholera epidemics of 2001-2002 and 1980-1987 in South Africa. J. Med. Microbiol. 2007; 56 (12): 1644-50.
37. Ismail H., Smith A.M., Archer B.N., Tau N.P., Sooka A., Thomas J. et al. Group for Enteric, Respiratory and Meningeal Disease Surveillance in South Africa (GERMS-SA). Case of imported Vibrio cholerae O1 from India to South Africa. J. Infect. Dev. Ctries. 2012; 6 (12): 897-900.
38. Naha A., Chowdhury G., Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Ley B. et al. Molecular characterization of high-level-cholera-toxin-producing ElTor variant vibrio cholerae strains in the zanzibar archipelago of tanzania. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (3): 1040-5.
39. Rashed S.M., Mannan S.B., Johura F.T., Islam M.T., Sadique A., Watanabe H. et al. Genetic characteristics of drug-resistant Vibrio cholerae 01 causing endemic cholera in Dhaka, 2006-2011. J. Med. Microb. 2012; 61: 1736-45.
40. Rashed S.M., Iqbal A., Mannan S.B., Islam T., Rashid M.U., Johura F.T. et al. Vibrio cholerae O1 El Tor and O139 Bengal Strains Carrying ctxBET, Bangladesh. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19 (10): 1713-5.
41. Lucier T.S., Brubaker R.R. Determination of genome size, macrorestriction pattern polymorphism, and nonpigmentation-specific deletion in Yersinapestis by pulsed-field gel electrophoresis. J. Bacteriol. 1992; 174: 2078-86.
42. Rakin A., Heesemann J. The established Yersinia pestis biovars are characterized by typical patterns of I-CeuI restriction fragment length polymorphism. Molekulyarnaya. Genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 1995; 3: 26-9.
43. Rajanna C., Revazishvili T., Rashid M.H., Chubinidze S., Bakanidze L., Tsanava S. et al. Characterization of pPCPl Plasmids in Yersinia pestis Strains Isolated from the Former Soviet Union. Int. J. Microb. 2010; 2010(760819): 9.
44. Guiyoule A., Rasoamanana B., Buchrieser C., Michel P., Chanteau S., Carniel E. Recent emergence of new variants of Yersinia pestisin Madagascar. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 2826-33.
45. Huang X.-Z., Chu M.C., Engelthaler D.M., Lindler L.E. Genotyp-ing of a homogeneous group of Yersinia pestis strains isolated in the United States. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 1164-73.
46. Revazishvili T., Rajanna C., Bakanidze L., Tsertsvadze N., Imnadze P., O'Connell K. Characterisation of Yersinia pestis isolates from natural foci of plague in the Republic of Georgia, and their relationship to Y pestis isolates from other countries. Clin. Microb. Infect. 2008; 14: 429-36.
47. Zhang Z., Hai R., Song Z., Xia L., Liang Y., Cai H. et al. Spatial Variation of Yersinia pestis from Yunnan Province of China. Am. J. Trop. Med Hyg. 2009; 81 (4): 714-7.
48. Barros M.P.S., Almeida A.M.P., Silveira-Filho V.M., Leal-Balbino T.C. Subtyping Brazilian Yersinia pestis strains by pulsed-field gel electrophoresis. Genet. Mol. Res. 2013; 12 (2): 1294-302.
49. Guiyoule A., Grimont F., Iteman I., Grimont P. A., Lefevre M., Carniel E. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains. J. Clin. Microbiol. 1994; 32 (3): 634-41.
50. Wong D., Wild M.A., Czarnecki L. A., Adem P., Eisen R.J., La-waczeck E.W. et al. Primary pneumonic plague contracted from a Mountain Lion Carcass. CID. 2009; 49: e33.
51. One-Day (24-28 h) Standardized Laboratory Protocol for Molecular Subtyping of Yersinia pestis by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Available at: http://www.pulsenetinternational.org/assets/ PulseNet/uploads/pfge/yersinia_Apr2006.pdf (accessed 15 December 2012).
Поступила 24.02.14 Received 24.02.14
APPLICATION OF PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS FOR MOLECULAR TYPING OF CAUSATIVE AGENTS OF ESPECIALLY DANGEROUS INFECTIONS
Mironova L. V., Afanasev M. V., Balakhonov S. V.
Antiplague Research Institute, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Irkutsk, Russia
The macro-restriction analysis of the microorganism DNA with the use of gel electrophoresis in pulsed field (PFGE typing, pulse electrophoresis) is applied in molecular biology to study the clonal structure and typing of causative agents of infectious diseases. Determining the degree of the relationship and definition of epidemiological interrelations of studied isolates, as well as studying the evolutionary history of pathogens, is performed by comparing DNA restriction patterns.
This review presents an analysis of the use of the pulse electrophoresis in molecular-epidemiological research and the study of phylogeny of especially dangerous infections, cholera, and plague. The possibility of genetic heterogeneity of the Vibrio cholerae and Yersinia pestis populations is demonstrated; territorial and epidemiological characteristics of the spread of different isolate pulso-types, problems and prospects of the PFGE typing method in the system of epidemiological surveillance of cholera and plague in Russia are discussed.
Key words: gel-electrophoresis in a pulsed-field; pulse electrophoresis; molecular typing; restriction patterns; Vibrio cholerae; Yersinia pestis.
