CC BY
158
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.843.1:579.253].083.1
Миронова Л.В., Афанасьев М.В., Гольдапель Э.Г., Балахонов С.В. мультилокусное сиквенс-типирование штаммов VIBRIO CHOLERAE
разной эпидемической значимости
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 664047, г Иркутск
Проведено исследование аллельного полиморфизма генов «домашнего хозяйства» (dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, gmd) штаммов Vibrio cholerae разной эпидемической значимости (n = 41), изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока в период VII пандемии холеры. Установлено, что все токсигенные штаммы периода эпидемических осложнений независимо от времени и источника выделения характеризуются идентичным аллельным профилем и относятся к одному сиквенс-типу. Среди эпидемически неопасных изолятов выявлено 9 сиквенс-типов и кластеризация их на дендрограмме, ассоциированная с принадлежностью к серогруппе и, в ряде случаев, с территорией и временем выделения. Гетерогенность структуры генов «домашнего хозяйства», нетоксигенных V. cholera, обусловлена преимущественно синонимичными нуклеотидными заменами (Dn/Ds<1), что свидетельствует о преобладании на анализируемых участках генома холерного вибриона отрицательного отбора. Выявленные различия структуры генов «домашнего хозяйства» холерного вибриона разной эпидемической значимости могут свидетельствовать о разных направлениях эволюции этих групп штаммов.
Ключевые слова: Vibrio cholera; мультилокусное сиквенс-типирование, MLST; гены «домашнего хозяйства»; аллельный полиморфизм.
Исследование структуры комплекса генов жизнеобеспечения (гены «домашнего хозяйства», housekeeping genes) - мультилокусное сиквенс-типирование (Multilocus Sequence Typing - MLST) - широко применяется в молекулярно-эволюционном анализе для установления филогенетической истории и популяционной структуры микроорганизмов [1, 2]. Известно, что гены домашнего хозяйства характеризуются достаточно низкой скоростью накопления и закрепления мутаций, что снижает эффективность использования мультилокус-ного сиквенс-типирования в изучении эволюции моно-морфных патогенов и в эпидемиологическом анализе [2, 3]. Тем не менее для быстро эволюционирующих микроорганизмов этот подход оказывается информативным как в оценке эволюционных процессов, так и при выяснении закономерностей распространения возбудителей при эпидемических осложнениях [4, 5]. Кроме того, рассматривается эффективность применения MLST в крупномасштабных долгосрочных эпидемиологических исследованиях по изучению глобального распространения клонов возбудителей инфекционных заболеваний [6, 7]. В настоящее время для отдельных видов микроорганизмов разработаны универсальные схемы мульти-локусного сиквенс-типирования, определяющие набор оптимальных генетических локусов и условий секвени-рования, с формированием общедоступных баз данных на сетевых ресурсах, в частности http://www.mlst.net/, http://pubmlst.org/.
Для типирования V. cholerae по комплексу генов жизнеобеспечения используются различные подходы, позволяющие осуществлять с определенной эффективностью внутривидовую дифференциацию холерного вибриона. Так, для идентификации и дифференциации микроорганизмов рода Vibrio применяется анализ структуры 3 генов - pyrH, recA и rpoA [8]. Схема мультилокусного секвени-рования, включающая 26 генов «домашнего хозяйства», продемонстрировала высокую дискриминирующую спо-
собность при тестировании изолятов VI и VII пандемий холеры [9]. Выборка из наиболее информативных генетических мишеней указанной выше схемы использована S. Octavia и соавт. для молекулярного типирования и исследования генетического разнообразия клинических штаммов V. cholerae не О1/О139 [10]. Широкое применение получил предложенный Р. Garg и соавт. [11] вариант мультилокусного типирования, основанный на изучении структуры 9 генов V. cholerae - dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, gmd, rstA. Эффективность определения структуры полного набора указанных генов или комплекса из отдельных детерминант установлена при исследовании штаммов холерного вибриона разной эпидемической значимости [12], филогенетическом анализе предпандемич-ных и пандемичных клонов холерного вибриона [13].
Вместе с тем актуально исследование возможности дифференциации на основе MLST типичных вариантов возбудителя VII пандемии и его атипичных генетически измененных доминирующих в настоящее время в этиологии заболевания вариантов для выяснения их эволюционного родства и эпидемиологических закономерностей распространения, а также филогенетических взаимосвязей эпидемически опасных токсигенных клонов с нетоксигенными вибрионами эльтор.
С учетом изложенного цель исследования - мульти-локусное сиквенс-типирование штаммов холерного вибриона, изолированных в Сибири и на Дальнем Востоке на разных этапах VII пандемии холеры.
Материал и методы
Бактериальные штаммы. В работе проведено исследование 41 штамма V. cholerae, изолированного в Сибири и на Дальнем Востоке в разные периоды VII пандемии, в том числе 21 штамм от людей и из объектов окружающей среды при эпидемических осложнениях по холере (20 токсигенных и 1 - спонтанный мутант, утративший гены холерного токсина при пассажах на питательных средах), 20 - не содержащих детерминант холерного токсина, выделенных в разные годы из объектов окружающей среды региона (n = 19) и из клинического материала (n = 1). Среди эпидемически опасных штаммов V. cholerae eltor три характеризуются присутствием в геноме эльтор-специфического гена субъединицы B холерного токсина (ctxB3), 18 штаммов несут его классическую аллель (ctxBl), что определяет их принадлежность к атипичным генетически измененным вариантам вибриона эльтор (табл. 1). Атипичные штаммы V. cholerae eltor представлены 4 генотипами, определенными по комплексу биовар-специфических и ассоциированных с пато-генностью генов [14]. Дополнительно в исследование включен штамм холерного вибриона классического биовара V. cholerae cholerae 569B. Фенотипически таксономическую принадлежность штаммов к виду, биовару, серогруппе определяли по комплексу культурально-морфологических, биохимических, серологических и других тестов в соответствии с МУК «Лабораторная диагностика холеры», 2007 г.
Штаммы V. cholerae хранились в лиофилизированном состоянии в музее живых культур ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Экстракцию ДНК осуществляли посредством лизиса микробных клеток в растворе додецилсульфата натрия с последующей депротеинизацией смесью хлороформ-изоамиловый спирт и
Таблица 1
фенотипические и молекулярно-генетические свойства исследуемых штаммов V cholerae
Эпидемио- Место Количество Серо-группа Генотип
логическая ситуация выделения штамма Год Объект wb01/ wb0139 ctxAB генотип ctxB tbr1 TLC аллель rstR rstC ^А
Эпидемические
осложнения
Эпидемическое
благополучие
г. Омск
г. Новосибирск
г. Барнаул
г. Омск
г. Барнаул
г. Иркутск
г. Ачинск
Приморский край
г. Южно-Сахалинск
г. Иркутск
1972 Человек
1973 Человек
1994 Человек
1997
1999
2009-2010 2006
Приморский 2006-2008 край
г. Омск
2000 1973
Человек
Человек
ООС2 Человек
ООС
ООС ООС
ООС
ООС Человек
1 4
3 13
4 1 1 10
3 1
О1
RO О1
wb01
ctxB3 4 + rstR elt +
ctxB1 4
О1 wb01
О139 wb0139
Ro -
О1 wb01
wb01
rstR elt
rstR elt/ rstR clas
rstR elt
rstR elt/ rstR clas
rstR elt
Примечание. 1 - указано количество ToxR-связывающих повторов (ToxR-binding repeats - tbr) в ctxAB промоторной области; 2 - ООС - объекты окружающей среды; 3 - спонтанный мутант токсигенного штамма V. cholerae, утративший гены холерного токсина.
+
+
+
3
+
5
4
осаждением этиловым спиртом. Качество ДНК контролировали в 0,9% агарозном геле, концентрацию - спектрофотометрически на NanoVue Plus (GE Health Care, США). В ПЦР использовали 10 нг ДНК матрицы.
Мультилокусное секвенирование проводили по предложенной Р. Garg с соавт. схеме, включающей определение нуклеотид-ной последовательности девяти генов, в том числе 7 генов «домашнего хозяйства»: dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi; одного, ассоциированного с локусом серогруппоспецифичности - gmd, и одного, входящего в состав мобильного генетического элемента в геноме эпидемически опасных V. cholerae - rstA [11]. Известно, что одним из требований к выбору оптимальных мишеней для MLST считается присутствие гена у всех или у большинства представителей анализируемой популяции [1]. С учетом этого ген rstA, отсутствующий в геноме всех эпидемически не опасных штаммов выборки (см. табл. 1), был исключен из анализа.
Амплификацию генов dnaE, lap, pgm, cat проводили по программе, включающей стартовую денатурацию при 95°С - 5 мин, далее 25 циклов 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с и заключительную элонгацию 72°С - 5 мин. Для генов recA, chi, gmd, gyrB использовали температуру отжига праймеров 58°С.
Ампликоны после электрофоретической оценки качества и количества ДНК очищали ферментной смесью (10 Ед экзонукле-азы I и 1 Ед щелочной фосфатазы), количество ПЦР продукта для сиквесной реакции рассчитывали в зависимости от размера амплифицированного фрагмента гена. Определение нуклео-тидной последовательности анализируемых генов выполняли с прямого и обратного праймеров с использованием ABI Prism BigDye v.1.1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и ДНК-анализатора ABI Prism 3130 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США).
Сопоставление секвенированных фрагментов ДНК, определение консенсусных последовательностей генов для каждого
штамма выполняли с применением инструментов программы VectorNTI v. 10.0 (Invitrogen Corp., США). Число аллелей, индекс полиморфизма локусов, среднее число синонимичных/несинонимичных замен на синонимичный/несинонимичный сайт (синонимичных дистанций Ds, несинонимичных дистанций Dn) рассчитывали с использованием программы DNASequence-Polymorphism v. 5.10.01. Кластерный анализ результатов секве-нирования проводили по алгоритму «присоединения соседей» (neighbor joining) в программе Bionumerix 6.0 (Applied Maths, Бельгия).
Результаты и обсуждение
Первичный анализ данных секвенирования генов «домашнего хозяйства» V. cholerae осуществляли отдельно по каждому локусу. В результате вариабельность нуклеотидной последовательности выявлена для всех исследуемых генов, количество идентифицированных аллелей генов составило от 3 до 10 (табл. 2). Наибольшей гетерогенностью структуры характеризуются гены recA, pgm и cat, насчитывающие по 10 аллельных вариантов с индексом полиморфизма 0,690. Максимальное количество полиморфных сайтов из указанных локусов определено в структуре гена cat (64 полиморфных сайта с 68 нуклеотидными заменами в них). Высококонсервативным для данной выборки оказался ген, детерминирующий продукцию GDP-маннозо-4,6-дегидратазы. Четыре штамма V cholerae RO варианта лишены этого гена, остальные на основании анализа нуклеотидного состава gmd распределены по 3 аллелям. Одна аллель - доминирующая, включающая 36 штаммов V. cholerae О1, вторая - представлена одним штаммом О1 серогруп-
Таблица 2
характеристика анализируемых генетических локусов V. cholerae
Коли- Размер Характеристика аллельного полиморфизма Характеристика нуклеотидных замен
Ген Кодируемый продукт чество штаммов, содержащих ген анализируемого фрагмента (п.о.) количество полиморфных сайтов количество н.з.1 количество аллелей индекс вариа-бель-ности количество синонимичных н.з. 2 среднее число н.з. на синонимичный сайт (Ds)2 количество не-синонимичных н.з. 2 среднее число н.з. на несинонимичный сайт (Dn)2 Dn/Ds
dnaE а-Субъединица ДНК-полимеразы III (DNA polymerase III alpha subunit) 39 406 20 21 6 0,611 19 0,03775 2 0,00049 0,0129
lap Лейциламино-пептидаза (leucyl aminopeptidase) 41 390 18 18 7 0,646 17 0,01730 1 0,00047 0,0272
recA Рекомбиназа А (recombinase A) 42 579 47 51 10 0,690 51 0,10287 0 0,00000 0,0000
pgm Фосфоглюкомутаза (рhosphoglucomutase) 42 554 19 20 10 0,690 17 0,03519 3 0,00055 0,0156
cat Каталаза (catalase) 42 490 64 68 10 0,690 61 0,06001 7 0,00102 0,0169
gyrB ДНК-гираза (DNA gyrase subunit B) 42 495 29 30 8 0,640 30 0,08050 0 0,00000 0,0000
chi Хитиназа (chitinase) 42 284 38 39 7 0,633 33 0,06425 6 0,00220 0,0342
gmd GDP-маннозо-4,6- дегидратаза 383 416 1 1 2(1)4 0,054 1 0,00057 0 0,00000 0,0000
(GDP-mannose 4,6-dehydratase)
Примечание. 1 - н.з. - нуклеотидная замена; 2 - показатели рассчитаны в программе DnaSP 5.10.01; 3 - в том числе штамм V. с^1егае 0139 И-16, характеризующийся специфичной аллелью гена gmd, идентичность которой с нуклеотидной последовательностью данного гена референсного штамма О1 серогруппы составляет 77%. Последовательность гена gmd указанного штамма исключена из дальнейшего комплексного анализа аллельного полиморфизма и нуклеотидных замен гена; 4 - в скобках указана аллель гена gmd штамма V. с^1егае 0139 И-16, исключенная из последующего анализа.
пы, содержащим одну синонимичную нуклеотидную замену. Уникальной аллелью гена gmd характеризуется штамм V cholerae О139 И-16, в структуре которой выявлено 135 полиморфных сайтов, дифференцирующих данную аллель от доминирующей. Анализ секвени-рованного участка гена gmd штамма V cholerae О139 И-16 с использованием программы BLAST (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показал 100% и 99% сходство его с фрагментами указанного гена штаммов V. cholerae О139 серогруппы №№ AS238 и SG20, размещенными в GenBank под регистрационными номерами AY297860.1 и AY297857.1 соответственно [11]. Существенные отличия структуры гена gmd штаммов О139 серогруппы от таковой V. cholerae О1, большой процент сходства его нуклеотидного состава с подобным геном E. coli обусловлены приобретением указанного локуса вибрионами О139 серогруппы посредством горизонтального переноса в составе серогруппоспецифического кластера генов wbf [11].
Необходимо отметить, что аллельный полиморфизм исследуемых локусов обусловлен неоднородностью их структуры преимущественно среди нетоксигенных V. cholerae, тогда как для токсигенных изолятов чаще всего свойственна гомологичность нуклеотидных последовательностей генов «домашнего хозяйства». Так, различия в группе токсигенных штаммов выявлены лишь по 3 ло-кусам между вибрионами классического и эльтор био-варов: 1) гену каталазы (несинонимичная замена в 655 позиции гена GCC ACC, приводящая к аминокислотному замещению Ala Thr, у штамма классического биовара в сравнении с биоваром эльтор); 2) гену рекомбиназы,
по структуре которого штамм классического биовара демонстрирует большее сходство с нетоксигенными V cholerae eltor и характеризуется наличием 19 синонимичных нуклеотидных замен на анализируемом участке в сравнении с токсигенными штаммами биовара эльтор; 3) гену хитиназы, структура которого у V. cholerae cholerae гомологична таковой нетоксигенных штаммов. Аллельный же профиль по комплексу тестируемых генов у всех токсигенных изолятов биовара эльтор оказался идентичным.
Обнаруженные в значительном количестве в составе генов «домашнего хозяйства» нетоксигенных штаммов нуклеотидные полиморфизмы локализуются в основном в синонимичных сайтах (91,3% от общего количества замен) и, соответственно, не приводят к изменению структуры кодируемых белков. Тем не менее для ряда изолятов установлено наличие несинонимичных мутаций, большая часть из которых (13 из 18) обнаружена у V. cholerae RO-варианта. В частности, в геноме 4 исследуемых штаммов RO-варианта выявлено: 2 замены нуклеотидов (трансверсия A-C в 951 и транзиция G ^A в 1003 позициях) в структуре гена dnaE (у 3 штаммов); 3 несинонимичных нуклеотидных замены (G ^C в 860, G A в 862 и А^Т в 867 позициях) в гене cat (у 2 штаммов); 6 замен в гене chi (у 3 штаммов) и две - в гене pgm (у 2 штаммов). Часть этих полиморфизмов обнаруживается и у V. cholerae O1, наряду с уникальными, определяемыми только в геноме вибрионов О1 серогруппы, несинонимичными мутациями. Оценка соотношения числа синонимичных (Ds, синонимичная дистанция) и несинонимичных (Dn, несинонимичная дистанция) замен на
Таблица 3
Дифференцирующие по эпидемической значимости однонукле-отидные полиморфизмы в структуре анализируемых участков генов «домашнего хозяйства» V с^1егае
Ген Номер позиции гена референсного штамма1 Нуклеотид
токсигеннные штаммы нетоксигенные штаммы
dnaE 1194 T C
gyrB 705 A G
813 T C
966 A T
972 T A
1170 G T
pgm 849 T C
recA 420 A G
582 T G
585 C A
Примечание. 1 - в качестве референсного для анализа использовались нуклеотидные последовательности генов штамма V. Мегае еНог 16961 (ЫС002505).
соответствующий сайт (Dn/Ds < 1), тем не менее, свидетельствует о преобладании на анализируемых участках генома холерного вибриона отрицательного (очищающего) отбора, действию которого в меньшей степени,
как правило, подвергаются нейтральные синонимичные мутации, что в целом характерно для генов структурно-функциональных белков, в том числе и для генов «домашнего хозяйства» [15].
Следует отметить наличие в структуре некоторых генов «домашнего хозяйства» однонуклеотидных полиморфизмов, позволяющих дифференцировать изоляты V. cholerae по их эпидемической значимости. В частности, в нуклеотидной последовательности гена dnaE выявлена одна дифференцирующая нуклеотидная позиция, в которой у всех токсигенных штаммов присутствует ти-мин, у нетоксигенных - цитозин, в структуре гена gyrB -5 дифференцирующих (ассоциированных с эпидемической значимостью) однонуклеотидных полиморфизмов, гена pgm - одна замена и recA - три (табл. 3). Наличие таких замен нуклеотидов может быть свидетельством существования в эволюционной истории V. cholerae генетических событий, в результате которых произошла дивергенция на отдельные линии клонов разной эпидемической значимости. Однако для подтверждения заключения об ассоциированных с эпидемической значимостью заменах в генах «домашнего хозяйства» требуются дополнительные исследования с расширенной выборкой штаммов V. cholerae разных групп.
Определенные в процессе исследования нуклеотид-ные последовательности housekeeping генов выборочно депонированы в GenBank под регистрационными номерами JN571738, JN579649-55, JN591379-84, JN607476-80, JN622162, JN622163, KC290712-22, KC306672-93,
Seq_MLST
_____.?__?_.____ï____._?..
рн:—1
H
t4
569B Vibrio cholorao cholorao Ol pationt 1973
96-99-V Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray patient 1999
1-1181 Vibrio cholorao oltor Ol Novosibirsk pationt 1994
1-1185 Vibrio cholorao oltor Ol Omsk pationt 1994
1-1263 Vibrio cholorao oltor Ol Irkutsk patient 1997
1-1264 Vibrio cholorao oltor Ol Krasnoyarsky kray pationt 1997
1-1300 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region pationt 1999
1-1303 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region pationt 1999
1-1305 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region pationt 1999
1-1308 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region pationt 1999
1-1310 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region onvironmont 1999
1-1313 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region environment 1999
1-1315 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin region onvironmontal 1999
1-1319 Vibrio cholorao oltor Ol Sakhalin rogion onvironmont 1999
1-1333 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray environment 1999
1-1334 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray pationt 1999
1-1335 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray pationt 1999
1-1337 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray patient 1999
1-1345 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray pationt 1999
1-441 Vibrio cholorao oltor Ol Omsk pationt 1972
1-561 Vibrio cholorao oltor Ol Barnaul pationt 1973
I-574 Vibrio cholorao oltor Ol Novosibirsk pationt 1973
1-16 Vibrio cholorao 0139 Irkutsk environment 2006
4-06 Vibrio cholorao RO Irkutsk environmont 2006
1-1353 Vibrio cholorao RO Primorsky kray onvironmont 2000
1-1354 Vibrio cholorao RO Primorsky kray onvironmont 2000
1-1357 Vibrio cholorao RO Primorsky kray onvironmont 2000
1-1447 Vibrio cholorao oltor Ol Irkutsk onvironmont 2010
1-1452 Vibrio cholerao oltor Ol Irkutsk onvironmont 2010
103-07-C Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray environmont 2007
284-07-C Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2007
97-07-C Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray environmont 2007
1-1423 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2007
1-1431 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2008
1-1433 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2008
1-1434 Vibrio cholorao oltor Ol Irkutsk onvironmont 2009
1-1436 Vibrio cholorao oltor Ol Irkutsk environment 2009
1-721 Vibrio cholorao oltor Ol Omsk pationt 1973
150-06-V Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2006
151-06-V Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray environment 2006
99-06-V Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2006
1-1421 Vibrio cholorao oltor Ol Primorsky kray onvironmont 2007
Дендрограмма, построенная по алгоритму neighbor joining, на основании анализа нуклеотидных последовательностей комплекса
генов «домашнего хозяйства» 42 штаммов V. cholerae.
Сиквенс-типы исследуемых штаммов V. cholerae
Сиквенс-тип (ST) Аллельный профиль1 dnaE; lap; recA; pgm; cat; gyrB; chi; gmd Вид, биовар, серогруппа штаммов Количество штаммов Наличие гена холерного токсина Генотип холерного токсина
ST 1 1; 1; 1; 1; 1; 1; 1; 1 V. cholerae eltor O1 21 + ctxB3 ctxB1
ST 2 1; 1; 2; 1; 2; 1; 2; 1 V. cholerae cholerae O1 1 + ctxB1
ST 3 2; 2; 3; 2; 3; 2; 2; 1 V. cholerae eltor O1 9 - -
ST 4 2; 2; 3; 3; 3; 2; 2; 1 V. cholerae eltor O1 2 - -
ST 5 3; 3; 4; 4; 4; 2; 2; 1 V. cholerae eltor O1 2 - -
ST 6 х2; 3; 5; 6; 9; 3; 2; 1 V. cholerae eltor O1 1 - -
ST 7 4; 4; 7; 7; 5; 7; 6; x V. cholerae RO 2 - -
ST 8 5; 5; 6; 5; 10; 6; 5; x V. cholerae RO 1 - -
ST 9 6; x; 8; 8; 6; 5; 3; x V. cholerae RO 1 - -
ST 10 x; 7; 10; 9; 8; 8; 7; 3 V. cholerae O139 1 - -
ST 11 x; 6; 9; 10; 7; 4; 4; 2 V. cholerae eltor O1 1 - -
Примечание. 1 - номера аллелей обозначены в порядке частоты встречаемо сти в данной выборке; х - отсутствие гена в штаммах данного сиквенс-типа.
KC311931-38, KF381325-27, KF421814-17, KF476604-15, KF498628-31, KF500058-65, KF540041-46.
Комплексный филогенетический анализ осуществляли на основании установления эволюционных дистанций между нуклеотидными последовательностями генов «домашнего хозяйства» V. cholerae с использованием алгоритма neighbor joining. В качестве внешней группы при построении дендрограммы выбран штамм холерного вибриона классического биовара - V. cholerae cholerae 569B.
Анализ топологии дендрограммы показал, что все исследуемые штаммы распределились на 2 отдельные линии: одна образована штаммом V. cholerae классического биовара (условно обозначенная как линия «classical», n = 1), другая (обозначенная как линия «eltor») включает все остальные исследованные штаммы (n = 41) (см. рисунок).
Линия «eltor» дифференцируется на 2 группы. Первая группа - монофилетическая, к ней относятся все эпидемически опасные штаммы вибриона эльтор (в том числе и спонтанный мутант, лишенный генов холерного токсина), у которых установлен идентичный аллельный профиль по восьми тестируемым генам (табл. 4). При этом нуклеотидные последовательности генов «домашнего хозяйства» этих штаммов полностью гомологичны таковым референс-штамма V. cholerae eltor № 16961 (NC002505). Результаты анализа свидетельствуют о принадлежности всех эпидемически опасных штаммов VII пандемии к одному сиквенс-типу, обозначенному ST 1, независимо от времени (разные этапы VII пандемии), территории и объекта изоляции, а также вариабельности структуры основных генетических детерминант пато-генности, в частности, генотипа холерного токсина.
Вторая группа линии «eltor» дистанцирована от первой и включает все взятые в исследование нетоксиген-
Таблица 4 ные штаммы. Эта группа делится на 2 ветви, при этом одна представлена уникальным сиквенс-типом (8Т11), вторая объединяет 2 кластера генотипов. Один крупный кластер образован 14 нетоксигенными вибрионами О1 серогруппы. Основная подгруппа в составе этого кластера включает доминирующий среди нетоксигенных штаммов сиквенс-тип (8Т3), характерный для 45% взятых в исследование с1хЛВ~ штаммов. Указанный сиквенс-тип объединяет изоляты, выделенные в разные годы на разных территориях региона (Иркутск, Омск, Приморский край) как из объектов окружающей среды, так и из клинического материала (от вибриононоси-теля). Практически идентичный с описанным выше сиквенс-тип (отличающийся от доминирующего лишь аллелью гена pgm) включает 2 изолированных в Иркутске в 2010 г. штамма (8Т4). В отдельную подгруппу указанного кластера входят 3 штамма, изолированные в 2006 г. в Приморском крае (Владивосток): 2 из них характеризуются идентичным сиквенс-типом (8Т5), третий -сходным с первыми двумя (8Т6).
Во второй кластер группы нетоксигенных V. ско1егаг входят все штаммы Я0 варианта и один О139 серогруппы. При этом идентичный сиквенс-тип в данном кластере установлен у 2 штаммов V. ско1ггаг Я0, изолированных в 2000 г. в Владивостоке (8Т7). Третий штамм V. ско1ггаг Я0 (выделенный в тот же период на той же территории) также входит в данный кластер, но характеризуется отличающимся сиквенс-типом (8Т8). Сходство сиквенс-типов установлено у V. ско1егае О139 И-16 и V. ско1егае Я0 4-06 (изоляты объединены одним внутренним узлом) - 8Т9 и 8Т10. Следует отметить, что указанные штаммы были выделены последовательно с интервалом 7 дней из воды реки Ангары в Иркутске в летний период 2006 г. Сходство последовательностей генов «домашнего хозяйства» позволяет судить о родстве этих изолятов и возможной трансформации вибриона О139 серогруппы при длительном пребывании в водоеме в Я0 форму.
В целом по результатам мультилокусного секвениро-вания генов «домашнего хозяйства» установлена четкая дифференциация V. ско1егае еНог на отдельные группы в зависимости от эпидемической значимости. Выявленные существенные различия структуры генов «домашнего хозяйства» холерного вибриона разной эпидемической значимости могут свидетельствовать о разных направлениях эволюции этих групп штаммов. При этом для нетоксигенного варианта вибриона эльтор характерны высокая генетическая гетерогенность популяции и кластеризация сиквенс-типов в зависимости от серогруппы. Следует отметить, что наблюдаемая взаимосвязь сиквенс-типа с серогруппой обусловлена не только особенностями нуклеотидной последовательности ассоциированного с локусом серогруппоспецифичности гена gmd, но и структурной организацией других исследованных генов. В ряде случаев при МЬ8Т-типировании нетоксигенных штаммов прослеживается связь аллель-ного профиля с территорией и временем изоляции, что определяет возможность применения метода, в том числе и для пространственно-временного анализа в системе эпидемиологического надзора при выяснении закономерностей обнаружения и распространения данных вариантов V. ско1егае.
Что касается эпидемически опасных вариантов V. cholerae eltor, то инвариабельность структуры их генов «домашнего хозяйства» дает основание отнести токсиген-ный вибрион эльтор к группе относительно эволюционно молодых патогенов и дополнительно свидетельствует о генетическом родстве типичных вибрионов эльтор начала VII пандемии и атипичных вариантов V. cholerae eltor с измененной структурой гена ctxB. При этом отсутствие вариабельности нуклеотидных последовательностей генов «домашнего хозяйства» не позволяет проводить анализ закономерностей распространения и эволюции этой группы штаммов, несмотря на достаточно большой временной диапазон изоляции включенных в выборку штаммов (1972-1999 гг.), и характеризует дискриминирующую способность генотипирования эпидемически опасных вибрионов эльтор по данной схеме как низкую. Поэтому актуален поиск новых оптимальных для типирования полиморфных ассоциированных с жизнедеятельностью микробной клетки генетических локусов или разработка схем, включающих одновременный анализ коровой части генома и отдельных вариабельных детерминант, комплексное изучение структуры которых обеспечит дифференциацию эпидемически опасных изолятов холерного вибриона эльтор для выяснения механизмов их эволюционной дивергенции и путей формирования новых клонов патогена, а также установления молекулярно-эпидемиологических закономерностей их распространения.
Сведения об авторах:
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт, 664047 г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Миронова Лилия Валерьевна - канд.мед.наук, и.о. зав. лабораторией холеры, e-mail: mironova-lv@yandex.ru Афанасьев Максим Владимирович (Afanas'ev Maxim Vladimirovich ) -вед. науч. сотр. отдела эпидемиологии, канд.биол.наук, e-mail: afanasev_max@mail.ru
Гольдапель Эдуард Геннадьевич (Gol'dapel' Eduard Gennad'evich ) - мл. науч. сотр. лаборатории холеры; e-mail: tapuz82@mail.ru
Балахонов Сергей Владимирович (Balakhonov Sergey Vladimirovich) - д-р мед.наук, профессор, директор института, e-mail: balakhonov.irk@mail.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Maiden M.C.J. Multilocus sequence typing of bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 2006; 60: 561-88.
2. van Belkum A., Tassios P.Т., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N. K. et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. J. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 3(3): 1-46.
3. Achtman M. Evolution, population structure, and phylogeography of genetically monomorphic bacterial pathogens. Annu. Rev. Microbiol. 2008; 62: 53-70.
4. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infect. Genet. Evol. 2009; 9(4): 430-40.
5. Воронина О.Л., Кунда М.С., Дмитренко О.А., Лунин В.Г., Гинц-бург А.Л. Разработка схемы мультилокусного секвенирования Staphylococcus haemolyticus и ее применение для молекулярно-эпидемиологического анализа штаммов, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009-2011 гг. Журнал микроби-олщгии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 5: 62-7.
6. Sullivan Christopher B., Diggle M.A., Clarke S.C. Multilocus sequence typing. Data analysis in clinical microbiology and public health. Mol. biotechnol. 2005; 29: 245-54.
7. Jolley K.A., Maiden M.C.J. BIGSdb: Scalable analysis of bacterial genome variation at the population level. BMC Bioinformatics. 2010; 11: 595. Avaible at: http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/595.
8. Thompson C.C., Thompson F.L., Vicente A.C. Identification of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus by multilocus sequence analysis (MLSA). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008; 58: 617-21.
9. Salim A., Lan R., Reeves P.R. Vibrio cholerae pathogenic clones. Emerg. Infect. Dis. 2005; 11: 1758-60.
10. Octavia S., Salim A., Kurniawan J., Lam C., Leung Q., Ahsan S.net al. Population structure and evolution of Non-O1/Non-O139 vibrio cholerae by multilocus sequence typing. PLos One. 2013; 8 (6): 65342.
11. Garg P., Aydanian A., Smith D., Glenn M.J., Nair G.B., Stine O.C. Molecular epidemiology of O139 Vibrio cholerae: Mutation, lateral gene transfer, and founder flush. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(7): 81014.
12. Kotetishvili M., Stine O.C., Chen Y., Kreger A., Sulakvelidze A., Sozhamannan S., Morris J.G.J. multilocus sequence typing has better discriminatory ability for typing vibrio cholerae than does pulsed field gel electrophoresis and provides a measure of multilocus virulence gene profiles. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (55): 2191-96.
13. Осин А.В., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Смирнова Н.И. Разработка алгоритма MLST-типирования пандемических и предпан-демических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 107: 58-61.
14. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Кожевникова А.С., Половинкина В.С., Куликалова Е.С., Афанасьев М.В. Молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном районах России. Молекулекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 2: 13-20.
15. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2009.
Поступила 17.12.13
REFERENCES
1. Maiden M.C.J. Multilocus sequence typing of bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 2006; 60: 561-88.
2. van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N. K. et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. J. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 3(3): 1-46.
3. Achtman M. Evolution, population structure, and phylogeography of genetically monomorphic bacterial pathogens. Annu. Rev. Microbiol. 2008; 62: 53-70.
4. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infect. Genet. Evol. 2009; 9(4): 430-40.
5. Voronina O.L., Kunda M.S., Dmitrenko O.A., Lunin V.G., Gintsburg A.L. Development of Staphylococcus haemolyticus multilocus sequencing scheme and its use for molecular-epidemiologic analysis of strains isolated in hospitals in Russian Federation in 2009-2010. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 5: 62-7. (in Russia)
6. Sullivan Christopher B., Diggle M.A., Clarke S.C. Multilocus sequence typing. Data analysis in clinical microbiology and public health. Mol. biotechnol. 2005; 29: 245-54.
7. Jolley K.A., Maiden M.C.J. BIGSdb: Scalable analysis of bacterial genome variation at the population level. BMC Bioinformatics. 2010; 11: 595. Avaible at: http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/595.
8. Thompson C.C., Thompson F.L., Vicente A.C. Identification of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus by multilocus sequence analysis (MLSA). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008; 58: 617-21.
9. Salim A., Lan R., Reeves P.R. Vibrio cholerae pathogenic clones. Emerg.. Infect. Dis. 2005; 11: 1758-60.
10. Octavia S., Salim A., Kurniawan J., Lam C., Leung Q., Ahsan S.net al. Population structure and evolution of Non-O1/Non-O139 vibrio cholerae by multilocus sequence typing. PLos One. 2013; 8 (6): 65342.
11. Garg P., Aydanian A., Smith D., Glenn M.J., Nair G.B., Stine O.C. Molecular epidemiology of O139 Vibrio cholerae: Mutation, lateral gene transfer, and founder flush. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(7): 810-14.
12. Kotetishvili M., Stine O.C., Chen Y., Kreger A., Sulakvelidze A., Sozhamannan S., Morris J.G.J. multilocus sequence typing has better discriminatory ability for typing vibrio cholerae than does pulsed field gel electrophoresis and provides a measure of multilocus virulence gene profiles. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (55): 2191-96.
13. Osin A.V., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Smirnova N.I. Elaboration of the algorithm of MLST-typing of pandemic and pre-pandemic V. cholerae El Tor strains. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; 107: 58-61. (in Russian)
14. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Yu., Kozhevnikova
A.S., Polovinkina V.S., Kulikalova E.S., Afanas'ev M.V. Molecular genetic analysis of epidemic dangerous imported Vibrio cholerae El Tor strains isolated in Siberian and Far Eastern regions of Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2012; 2: 13-20. (in Russian) 15. Lukashov V.V. Molecular evolution and phylogenetic analysis. Moscow: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2009. (in Russian)
Received 17.12.13
MULTILOCUS SEQUENCE-TYPING OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS WITH VARIOUS EPIDEMIC IMPORTANCE
L. V. Mironova, M. V. Afanas'ev, E. G. Goldapel, and S. V. Balakhonov Irkutsk Antiplague Research institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russia
The allele polymorphism of the housekeeping genes (dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, gmd) from the Vibrio cholerae strains with
different epidemic importance (n = 41) isolated in Siberia and at the Far East during the cholera pandemic VII was tested. All toxigenic strains isolated at the period of epidemic complications irrespective of time and source of isolation were characterized by the identical allele profile and belonged to the same sequence-type. Nine sequence types were detected in non-epidemic isolates. The dendrogram clustering was associated with the serogroup and in some cases with the territory and time of isolation. The structure heterogeneity of the non-toxigenic V. cholerae housekeeping genes was in most cases caused by the synonymous nucleotide replacements (Dn/Ds < 1) indicating the prevalence of the negative V. cholerae at the analyzed genome sites. The revealed distinctions in the structure of housekeeping genes of the V. cholerae with different epidemic importance can be regarded as evidence of various evolutional directions in these strain groups.
Key words: Vibrio cholerae, multilocus sequence-typing, MLST, housekeeping gene, allele polymorphism.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.842.23:579.25].083.3
Бывалов А.А.1,2, Дудина Л.Г.1,2, Чернядьев А.В.1, Конышев И.В.1,2, Литвинец С.Г.1, Оводов Ю.С.2
иммунохимическая активность б-антигена YERSINIA pseudotuberculosis
'Вятский государственный университет, г. Киров; 2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар
Получена панель гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к иммунохимически неидентичным антигенным эпито-пам белковой природы, расположенным на наружной мембране Yersinia pseudotuberculosis. Показано, что идентифицированный ранее Б-антиген, активная иммунизация которым защищает от экспериментальной чумы лабораторных животных, выявляется моноклональными антителами к указанным белковым детерминантам, равно как и детерминантам О-боковых цепей липопо-лисахарида. Б-антиген представляет собой компонент наружной мембраны Y. pseudotuberculosis, экскретируемый в виде везикул (OMVs) бактериями при выращивании в жидкой питательной среде.
Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis; Б-антиген; липополисахарид; моноклональные антитела; антигенные эпи-топы.
Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза, одного из сапрозоонозных заболеваний, природные очаги которого существуют во многих регионах России, странах Европы, Америки, Азии. Возбудитель чумы - филогенетически относительно «молодой» вид рода Yersinia, дивергировавший от Y. pseudotuberculosis 1,5-20,0 тыс. лет назад. Микробы двух названных видов генетически (и иммунохимически) очень близки (более 90% гомологии хромосомной ДНК). Вместе с тем эво-люционно закрепленные приобретения бактерий новообразованного вида, в первую очередь, носительство крупной (pFra) и малой (pPla) плазмид, обусловили появление иной, гораздо более тяжелой инфекции - чумной, патогенез и эпидемиология которой резко отличаются от таковых псевдотуберкулеза [1]. Одним из основных направлений совершенствования системы специфической профилактики чумы является разработка молекулярной чумной вакцины, так как высокоэффективная живая вакцина на основе штамма EV характеризуется выраженной реактогенностью, а цельноклеточные инакти-вированные вакцины, полученные из бактерий Y. pestis, низкоиммуногенны [2].
Ранее нами в культуральной жидкости Y. pseudotu-
berculosis был идентифицирован антиген (Б-антиген), который в качестве иммунизирующего препарата способен защищать от экспериментальной чумы (но не псевдотуберкулеза) морских свинок и, по-видимому, обезьян [3, 4]. Вместе с тем было показано, что иммунохимиче-ская экспрессия Б-антигена в клетках чумного микроба, выращенных in vitro, относительно низка. Антиген состоит из полисахаридного, белкового и липидного компонентов, достаточно прочно связанных между собой, имеет поверхностную локализацию в микробной клетке, способен экскретироваться в питательную среду при глубинном выращивании Y. pseudotuberculosis, характеризуется достаточно высокой молекулярной массой, его биосинтез детерминируется хромосомной ДНК [3, 4].
В настоящей работе была предпринята попытка дальнейшего изучения природы Б-антигена, в первую очередь, его иммунохимической активности. Один из методических подходов в такого рода исследованиях -применение моноклональных антител (МКАт). Имеются сообщения о получении гибридом, продуцирующих МКАт различной специфичности к поверхностным полипептидам Y. pseudotuberculosis [5-7]. Ранее мы сообщали о получении набора гибридом, продуцирующих МКАт к липополисахариду (ЛПС) Y. pseudotuberculosis [8].
Цель настоящей работы состояла в изучении имму-нохимической активности Б-антигена как биологически активного поверхностного антигена Y. pseudotuberculosis с помощью панели моноклональных антител.
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. Штамм Y. pseudotuberculosis 1b получен из коллекции ФКУЗ РосНИИП-ЧИ «Микроб» (кат. № 474); вакцинный штамм Yersinia pestis EV получен из коллекции ООО «Агровет».
Бактерии Y. pseudotuberculosis выращивали в шуттелируе-мых колбах Эрленмейера с жидкой питательной средой на осно-
