CC BY
70
УДК 579.843.1:579.253].083.1
Э.Г. Гольдапель, л.в. миронова, м.в. Афанасьев, C.B. Балахонов
АллЕльный полиморфизм генов «домашнего хозяйства» нетоксигенных штаммов vibrio cholerae, выделенных на территории
сибири и дальнего востока
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»
Роспотребнадзора, г. Иркутск
Проведен анализ структуры комплекса генов «домашнего хозяйства» нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae. Исследовано 20 изолятов, которые дифференцировались на девять сиквенс-типов, пять из которых -уникальных. Установлена кластеризация по принадлежности к серогруппе: в одну группу вошли все штаммы RO варианта холерного вибриона и один О139 серогруппы, в другую - все штаммы О1 серогруппы. В ряде случаев установлена связь сиквенс-типа с местом и временем выделения штаммов, однако объединение штаммов в наиболее распространенный сиквенс-тип, не зависело от пространственно-временных характеристик. Ключевые слова: Vibrio cholerae, аллельный полиморфизм, мультилокусное сиквенс-типирование
ALLELIC poLYMoRpHisM oF ATOxiGENIC VIBRio cHoLERAE sTRAiNs
of housekeeping genes isolated in siberia and far east
E.G. Goldapel, L.V. Mironova, M.V. Afanas'ev, S.V. Balakhonov
irkutsk antiplague research institute of siberia and Far east of rospotrebnadzor, irkutsk
There were atoxigenic Vibrio cholerae strains housekeeping genes analyzed. There were studied 20 isolates, in which nine sequence types have determined and five of which have described as unique. There were clustersformed as belonging to serogroup: first cluster includes RO-variantstrains and one O139 serogroup strain of V. cholerae, second - all O1 serogroup V. cholerae strains. There are sequence types associated with place and time isolation strains in some cases, although differentiation of the strains, which are formed the dominant sequence type strains group have no spatial and temporal characteristics associated.
Key words: Vibrio cholerae, allelic polymorphism, multi locus sequence typing
введение
Холера - особо опасное инфекционное заболевание, склонное к пандемическому распространению [4]. По данным ВОЗ ежегодно холерой заболевают от трех до пяти миллионов человек, с более чем 2 % (до 120 тыс.) летальных исходов [11]. За всю историю человечества известно о семи пандемиях, инфекционным агентом которых являлся холерный вибрион. Первые шесть пандемий, как принято считать, были обусловлены классическим биоваром V. cholerae, а последняя - биоваром эльтор холерного вибриона [2, 5]. Нехарактерная продолжительность во времени седьмой пандемии относительно предшествующих, географическая распространенность, способность возбудителя персистировать в определенных экологических нишах и существование его авирулентных вариантов определяет необходимость углубленного исследования особенностей Vibrio cholerae.
Эпидемиологические наблюдения за холерой, с точки зрения молекулярной эпидемиологии, были ограничены до начала 70-х годов в связи с отсутствием информативных методов типирования. Однако, последние десятилетия, характеризующиеся развитием ДНК-технологий, включающих методы типирования при помощи секвенирования, открыли новые возможности в изучении микроорганизмов [1, 3, 9, 12]. Один из таких методов - мультилокусное сиквенс-типирование
(MLST), впервые разработанный и описанный в 1998 г. M.C. J. Maiden et al. для исследования Neisseria meningitidis [7]. Данный метод, заключающийся в анализе нуклеотидных последовательностей нескольких «housekeeping» генов, ставший «преемником» мультилокусного энзим-электрофореза, был обозначен в работе M.V. Larsen как «золотой стандарт» в типировании многих видов микроорганизмов [6]. На этапах становления применения MLST в изучении V. cholerae использовались различные схемы, в том числе вариант, включающий определение структуры четырех генов «домашнего хозяйства» (mdh, hlyA, recA, dnaE) [3]. В настоящее время представлены более развернутые схемы MLST, но стандартной по-прежнему не существует [8, 10].
Цель работы: анализ структуры комплекса генов «домашнего хозяйства» нетоксигенных штаммов V. cholerae, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока.
материал и методы
В работе исследовано 20 нетоксигенных штаммов V. cholerae, изолированных в Сибири и на Дальнем Востоке в период эпидемиологического благополучия в разные годы седьмой пандемии, как из объектов окружающей среды - 19, так и из клинического материала - 1. Исследованные штаммы типичны по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, 15 из них характеризуются принадлежностью к V. cholerae
01 серогруппе, 1 - к V. cholerae О139 серогруппе и 4 штамма - к V. cholerae RO варианту.
ДНК выделяли раствором додецилсульфата натрия с дальнейшей депротеинизацией смесью хлороформ -изоамиловый спирт и осаждением этиловым спиртом. Концентрация ДНК определялась на спектрофотометре NanoVue Plus (GE Health Care, США).
Для мультилокусного секвенирования использована схема Garg Р. с соавт., включающая определение нуклеотидной последовательности генов «домашнего хозяйства»: dnaE, lap, recA, pgm, gyгВ, cat, chi, gmd, rstA [8].
Для амплификации указанных генов использовалось две программы: 1 - для генов dnaE, lap, pgm, cat, rstA; 2 - для генов recA, chi, gmd, gyr.
Программа 1:
Стартовая денатурация 95 °С - 5 мин
Денатурация 94 °С - 30 с
Отжиг праймеров 60°С - 30 с 25 циклов
Элонгация 72 °С - 30 с
Заключительная элонгация 72 °С - 5 мин.
Программа 2: отличалась от первой температурой отжига праймеров, которая составила 58 °С.
Ампликоны перед сиквенсной реакцией обрабатывались щелочной фосфатазой (1 Ед) и экзонуклеазой I (10 Ед) «Fermentas» (Литва).
Секвенирование анализируемых генов осуществлялось с использованием набора ABI Prism BigDye v.1.1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit («Applied Biosystems», США) на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Полученные нуклеотидные последовательности анализировались в программе VectorNTI v. 10.0 (Invitrogen Corp., USA). Для статистического анализа фрагментов генов применялась программа DNASe-quencePolymorphism v. 5.10.01 (Universität de Barcelona, Spain) и Bionumerix 6.0 (Applied Maths, Бельгия).
результаты и обсуждение
При проведении кластерного анализа по структуре гена dnaE выявлено пять аллелей. Уникальным генотипом обладают штаммы V. cholerae И-1353 (выделен в Приморском крае в 2000 году) и V. cholerae RO 4-06 (изолирован в Иркутской области в 2006 г.). Количество полиморфных сайтов в структуре анализируемого участка - 19 с 20 мутациями. Анализ мутаций показал, что 18 относится к синонимичным, 2 - к несинонимичным. Индекс полиморфизма составил 0,58.
По структуре гена lap исследуемые штаммы распределились на восемь генотипов. У одного штамма (V. cholerae 4-06) отсутствовал ген, у трех -уникальные аллели (V. cholerae И-1353, V. cholerae И-16, V. cholerae И-1421). Обособленным генотипом характеризовались изоляты из Приморского края, образовавшие два генотипа, к одному относятся выделенные в 2000 г., а к другому - в 2006 г. Количество полиморфных сайтов совпадает с количеством замен и составляет 18 (17 синонимичных и 1 несинонимичная). Индекс полиморфизма составил 0,81.
При кластерном анализе данных секвенирования гена gyrB выявлено семь генотипов, пять из которых уникальны (штаммы V. cholerae И-1353, V. cholerae
И-16, V. cholerae И-1421, V. cholerae 4-06, V. cholerae 99-06-В). Количество синонимичных замен 24, в 23 полиморфных сайтах. Индекс полиморфизма - 0,58.
По структуре гена chi выявлено шесть генотипов, в числе которых четыре уникальных - штаммы V. cholerae И-1353, V. cholerae И-16, V. cholerae И-1421, V. cholerae 4-06. Количество полиморфных сайтов 38 с 39 мутациями, из которых 33 синонимичные и 6 несинонимичные. Индекс полиморфизма 0,51.
Единственным наиболее консервативным в ряду исследуемых генов оказался ген gmd. В один генотип вошли 14 штаммов, принадлежащие к О1 серогруппе, штамм V. cholerae И-1421 отличается лишь одним нуклеотидом от указанных выше. У штаммов RO отсутствовал данный ген. Уникальный генотип выявлен у V. cholerae O139 серогруппы И-16, который характеризуется наличием 135 полиморфных сайтов. Полиморфизм данного гена подтвердился при сопоставлении нуклеотидных последовательностей в международной базе данных Genbank. Сходство составило 100 % и 99 % с депонированными фрагментами штаммов, той же серогруппы, под регистрационными номерами AS238 и SG20 соответственно. Индекс полиморфизма - 0,24.
Особое внимание стоит уделить аллельной вариабельности генов pgm, recA, cat, lap поскольку для них характерен наибольший индекс полиморфизма в данной выборке 0,84; 0,7; 0,7; 0,81 соответственно. Сопоставление результатов кластерного анализа по структуре генов recA и cat показало идентичность распределения штаммов по генотипам для того и другого локуса. По указанным генам штаммы дифференцируются на восемь генотипов, с одним доминирующим, включающим 11 изолятов.
Ген rstA, входящий в состав мобильных генетических элементов, ассоциированных с патогенностью холерного вибриона (профаги CTX и RS1), по результатам ПЦР отсутствует в геноме всех исследованных штаммов, что стало основанием для исключения его из схемы типирования.
Анализ комплекса семи «housekeeping» генов показал, что исследуемые штаммы дифференцируются на девять сиквенс-типов. При этом прослеживаются те же закономерности кластеризации штаммов, что и по отдельным локусам. Так, уникальным сиквенс-типом обладают пять штаммов V. cholerae (4-06, И-16, И-1353, И-1421, 99-06-В). Кроме того, отдельные сиквенс-типы образуют два штамма, выделенные из поверхностных водоемов Приморского края в 2000 г. (V. cholerae И-1354, V. cholerae И-1357), два штамма из того же региона 2006 г. (150-06-В, 151-06-В) и два изолята, выделенные в г. Иркутске в 2010 г. (V. cholerae И-1447, V. cholerae И-1452). Индекс Хантера-Гастона в целом по выборке составил 0,79 (рис. 1).
заключение
В результате мультилокусного сиквенс-типирования нетоксигенных штаммов V. cholerae, изолированных из поверхностных водоемов на фоне эпидемиологического благополучия в разные периоды седьмой пандемии установлен полиморфизм структуры их «housekeeping» генов (табл. 1).
ч
t1
1-15 Vibrio chc erao Q139lrkutsK environment 200B
4-06 Vibrio choleras RO Irhulsk environment 2006
1-1 ИЗ Vibrio chalarse RO Primorsky Kray envlronmant 2000
1-1354 Vibrio cholerae RO Prjmarsky kiay environment 2000
1.135? Vibrio cholerae RO Primorshy kray environment 2000
1-1447 Vibrio chalaran ollar OI Irkutsk environment 2010
I-1452 Vibrio cholerao ellor OI Irfculsk environment 2010
103-07-С Vibrio choleras CltOf OI Primorsky kray environment 2007
204-07-С Vibrio cholerao ellor OI Prlmorsfcy kray environment 2007
Э7-07-С Vibrio cholerae etlor OI Primorsky kray environment 2007
1-1423 Vibrio cholerao etlor 01 Primorsky kray environment 2007
1-1431 Vibrio cholerao tí'.tor OI Primorsky kray environment 2008
И 433 vibno cholerao ellor OI Primorsky kray environment 200S
1-1434 Vibrio cholerae ellor OI Jrkutsk environment 2009
1-1436 Vibrio cholerae ellor OI rkutsk environment 2009
1-721 Vibrio cholerae ellor OI Omsk palien! 1973
150-06-V Vibrio cholerae ellor OI Primorsky kray environment 2006
151-06-V Vibrio cholerae ellor OI Primorsky kray environment 2006
ЭЭ-06-V Vibrio cholerao otíor 01 Pnmoreky kray environment 2006
1-142-1 Vibrio cholerao clIOr OI Primorsky kray environment 2007
Рис. 1. Дендрограмма, построенная по алгоритму neighbor joining, на основании анализа нуклеотидных последовательностей комплекса генов «домашнего хозяйства» 20 штаммов V. cholera.
Таблица1
Анализируемые фрагменты генов
Ген Кодируемый продукт Размер секвенированного фрагмента, п.о. Количество генотипов
dnaE DNA polymerase III alpha subunit 406 5
lap leucyl aminopeptidase 390 6
recA recombinase A 579 8
pgm phosphoglucomutase 554 9
gyrB DNA gyrase subunit B 495 6
cat catalase 490 8
chi chitinase 284 6
gmd GDP-mannose 4,6-dehydratase 416 3
При этом кластеризация прослеживается по принадлежности штаммов к серогруппе. В один кластер вошли все штаммы V. cholerae RO варианта и один О139 серогруппы, в другой - все штаммы 01 серогруппы. В ряде случаев установлена связь сиквенс-типа штамма с местом и временем его выделения, вместе с тем, объединение штаммов, в наиболее рапространенный сиквенс-тип не зависело от пространственно-временных характеристик. Следует выделить четыре локуса (pgm, recA, cat, lap), по которым распределение генотипов штаммов отличалось от данных комплексного анализа, лишь на 1-2 аллельных профиля, а в случае гена pgm -совпадало с сиквенс-типами, определенными по совокупности генов. Поскольку единая схема MLST для V. cholerae до настоящего времени не определена, в перспективе возможно применение сокращенного варианта, используемой в данной работе схемы, включающую изучение структуры генов: dnaE, lap, recA, pgm, gyгВ, cat, chi, gmd, rstA.
литература
1. Achtman M. et al. Multilocus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica // PLoS
Pathog. - 2012. - Vol. 8. - N 6. - e1002776. doi: 10.1371/ journal.ppat.1002776
2. Bogard R.W., Davies B.W., Mekalanos J.J. MetR-regu-lated Vibrio cholerae metabolism is required for virulence // MBio. - 2012. - Vol. 3, N 5. - e00236-12. doi: 10.1128/ mBio.00236-12
3. Boonsilp S. et al. A single multilocus sequence typing (MLST) scheme for seven pathogenic Leptospira species // PLoS Negl. Trop. Dis. - 2013. - Vol. 7, N 1. -e1954. doi: 10.1371/journal.pntd.0001954
4. Byun R. et al. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio cholerae by sequence analysis of four housekeeping genes // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, N 3. - P. 1116-1124.
5. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholera // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol. 62, N 4. -P. 1301-1314.
6. Larsen M.V. et al. Multilocus sequence typing of total-genome-sequenced bacteria // J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50, N 4. - P. 1355-1361. doi: 10.1128/ JCM.06094-11
7. Maiden M.C. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within
populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, N 6. - P. 3140-3145.
8. Molecular epidemiology of O139 Vibrio cholerae: mutation, lateral gene transfer, and founder flush / Garg P. [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 9, N 7. - P. 810-814.
9. Moschioni M. et al. Sequence analysis of 96 genomic regions identifies distinct evolutionary lineages within CC156, the largest Streptococcus pneumoniae clonal complex in the MLST database // PLoS One. -2013. - Vol. 8, N 4. - e61003. doi: 10.1371/journal. pone.0061003.
10. Octavia S. [et al.] Population structure and evolution of non-O1/non-O139 Vibrio cholerae by multilocus sequence typing // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 6. - e65342. doi: 10.1371/journal.pone.0065342
11. World Health Organization. Cholera. 2012. Fact sheet N 107 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs107/ en/index.html.
12. Yeo M. et al. Multilocus sequence typing (MLST) for lineage assignment and high resolution diversity studies in Trypanosoma cruzi// PLoS Negl. Trop. Dis. - 2011. -Vol. 5, N 6. - e1049. doi: 10.1371/journal.pntd.0001049
сведения об авторах
Гольдапель Эдуард Геннадьевич - младший научный сотрудник лаборатории холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: tapuz82@mail.ru)
Миронова Лилия Валерьевна - кандидат медицинских наук, исполняющая обязанности заведующей лабораторией холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: mironova-lv@yandex.ru)
Афанасьев Максим Владимирович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела эпидемиологии ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: afanasev-max@mail.ru)
Балахонов Сергей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, директор ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел. (3952) 220-135).
information about the authors
Goldapel eduard Gennadievich - junior scientific officer of the laboratory of cholera of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Irkutsk, Trilissera str., 78, 664047; e-mail: tapuz82@mail.ru)
Mironova Uliya Valerievna - candidate of medical sciences, acting head of the laboratory of cholera of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Irkutsk, Trilissera str., 78, 664047; e-mail: mironova-lv@yandex.ru) afanasiev Maksim Vladimirovich - candidate of medical sciences, chief scientific officer of the department of epidemiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Irkutsk, Trilissera str., 78, 664047; e-mail: afa-nasev-max@mail.ru)
Balakhonovsergey Vladimirovich - doctor of medical sciences, MD, professor, director of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Irkutsk, Trilissera str., 78, 664047; tel. (3952) 220-135).
