CC BY
88
lyulozy. Belok i drugie tsennye produkty [Microbial synthesis based on cellulose. Protein and other valuable products]. Minsk, Nauka i tekhnika Publ., 1988, 216 p.
8. Rimareva L.V., Vorontsova N.N. Mikrobio-logicheskii kontrol' spirtovogo I fermentnogo pro-izvodstv [Microbiological control of alcohol and enzyme productions]. Moscow, Rossel'khoz akad-emiya Publ., 2005, 200 p.
9. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Biokonversiya lignotsellyuloznykh materialov [Bioconversion of lignocellulosic biomass]. Moscow, Izd-vo Moskovskogo universiteta Publ.,1995, 224 p.
10. Yarovenko V.L., Marinchenko V.A. Smirnov V.A. [et al.] Tekhnologiya spirta [Alcohol technology]. Moscow, Kolos Publ., 1999, 464 p.
11. Khol'kin Yu.I. Tekhnologiya gidroliznykh proizvodstv [Technology of wood-hydrolysis productions]. Moscow, Lesnaya promyshlennost' Publ., 1989, 496 p.
12. Tsukanov S.N., Budaeva V.V. Gidroter-mobaricheskii sposob polucheniya tsellyulozy i zot-
khodov zlakov [Hydrothermobaric process for pulp from crop residues]. Polzunovskii vestnik. -Polzunov Bulletin, 2011, no. 4-1, pp. 236-239.
13. Sharkov V.I., Sapotnitskii S.A., Dmitrieva O.A. Tekhnologiya gidroliznykh proizvodstv [Technology of wood-hydrolysis productions]. Moscow, Lesnaya promyshlennost' Publ., 1973, 408 p.
14. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lignocellulosic chemistry (2012) Bioenergy Research, no. 5, pp 1043-1066. Cited 65 times. doi: 10.1007/s12155-012-9208-0
15. Makarova E.I. Results of Miscanthus cellulose fermentation in the acetate buffer and in water medium. Chemistry for Sustainable Development, 2013, no. 2, pp. 209-214.
16. Pavlov I. N. A Setup for Studying the Bio-catalytic Conversion of Products from the Processing of Nonwood Raw Materials (2014) Catalysis in Industry, vol. 6, no. 4, pp 350-360. doi: 10.1134/S207005041404014X.
17. Somerville C. Feedstocks for lignocellulosic biofuels. Science, 2010, no. 329, pp. 790-792. Cited 431 times. doi: 10.1126/science.1189268.
Статья поступила в редакцию 09.12.2015 г.
УДК 504.064. 3:573.6. 504.064.2:574.21(282.256.341)
ПОИСК ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗ) СРЕДИ МИКРООРГАНИЗМОВ оз. БАЙКАЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЭКОЛОГИЧЕСКИХ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
1 9 9 ^
© Е.В. Верхозина1, В.А. Верхозина2, В.В. Верхотуров2, Е.В. Анганова3'4, Е.Д. Савилов3'4
1
Институт земной коры СО РАН,
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова 128, [email protected]
2 Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова 83, [email protected]
3 Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, 664049, г. Иркутск, м/р Юбилейный,100
4 Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека, 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3, [email protected]
Работа посвящена анализу многолетних исследований по поиску штаммов микроорганизмов-продуцентов ферментов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) (рестриктаз), выделенных из экосистемы оз. Байкал. Полученные результаты свидетельствуют, что бактерии-продуценты ферментов ЭР, известных ранее лишь теоретически, обнаруживаются в штаммах бактерий, выделенных из проб воды, взятых в антропогенных районах. В штаммах бактерий, выделенных из чистых участков озера, все обнаруженные нами рестриктазы являются хорошо известными. Акцентировано внимание на изучении спектра ферментов рестрикции при достаточной продуктивности и доступности для
биотехнологических разработок. Исследование бактериальных штаммов позволило выявить уникальные и редкие ферменты ЭР. Часть штаммов-продуцентов, выделенных из оз. Байкал с достаточной продуктивностью, используются для выделения ферментов, которые нашли свое применение в генно-инженерных и молекулярно-биологических работах.
Ключевые слова: ферменты; эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы); штаммы-продуценты; экологические исследования; молекулярная биология.
SEARCH OF STRAINS PRODUCERS OF RESTRICTION ENDONUCLEASES (RESTRICTION ENZYMES) AMONG THE MICROORGANISMS OF LAKE BAIKAL AND THEIR APPLICATION IN ENVIRONMENTAL AND BIOTECHNOLOGY RESEARCH
E.V. Verkhozina1, V.A. Verkhozina2, V.V. Verkhoturov2, E.V.Anganova3'4, E.D. Savilov3,4
1 Institute of the Earth's Crust, SB RAS,
128, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia, [email protected]
2 Irkutsk National Research Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected]
3 Irkutsk State Medical Academy of Postgraduate Education, 100, Yubileinyi Md., Irkutsk, 664049
4 Scientific Center of Family Health and Human Reproduction 3, Karl Marks St., Irkutsk, 664003, Russia, [email protected]
The work is dedicated to the search for strains producing enzymes mikroorganizmov-restriction endonucleases (RE) (restriction enzymes) among microorganisms Lake Baikal. The results suggest that bacteria-producing enzymes ER previously known only in theory, be found in the strains of bacteria isolated from water samples taken in the areas of anthropogenic. The strains of bacteria isolated from clean areas of the lake, we found all the restriction enzyme are well known. The attention is focused on the study of the spectrum of the restriction enzymes with sufficient efficiency and accessibility for biotechnological development. The study of bacterial strains revealed a unique and rare enzymes ER. Part producing strains isolated from the lake. Baikal is used for the isolation of enzymes which have found use in genetic engineering and molecular biology work. Keywords: enzymes; restriction endonucleases (restriction) strains-producers; environmental studies; molecular biology.
ВВЕДЕНИЕ
Эндонуклеазы рестрикции (ЭР) II типа (рестриктазы) - один из самых больших классов ферментов (более 3500), способных узнавать в двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность и расщеплять обе цепи ДНК внутри узнаваемой последовательности, используя в качестве кофактора ионы Mg2+.
Ферменты ЭР (рестриктазы) широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований в области биотехнологии, биоинженерии и молекулярной биологии [3, 10, 16]. В последние годы усилился интерес к изучению ДНК-метилтранс-фераз (метилаз, М), которые относятся к специфическим ферментам, способным метилировать в ДНК основания (аденин или цитозин) в узнаваемой нуклеотидной последовательности [18]. Исследование системы рестрикции-модификации впервые выявили существование в одной бактериальной клетке двух пар ДНК-
метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью [12].
Следует отметить, что разные ЭР используют различные механизмы для расщепления ДНК по двум цепям в зависимости от характера узнаваемой последовательности и наличия у них одного или двух каталитических центров [15]. У прокариот эти ферменты обычно входят в состав систем рестрикции-модификации, основной функцией которых является защита клетки от чужеродной ДНК [14].
Поиск новых штаммов-продуцентов ЭР (ре-стриктаз) для использования в биотехнологических разработках проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Водные микроорганизмы - перспективные продуценты ЭР, которые относительно плохо изучены, хотя среди них выявлены ферменты с новой специфичностью [7]. Среди микроорганизмов оз. Байкал впервые обнаружены и идентифицированы новые штаммы-продуцен-
ты рестриктаз, выделенные в районах антропогенного влияния [6, 8]. В штамме Arthromobacer sp., выделенном из почвенных образцов, обнаружена эндонуклеаза рестрикции Asi2561, расщепляющая последовательность нуклеотидов 5'-GATC-3' [13].
Поиск штаммов-продуцентов ферментов с новой специфичностью, определенными физико-химическими свойствами и с большим выходом биомассы - важное направление биотехнологии и энзимологии, имеющее прикладное значение [12]. Очевидно, что актуальным также является изучение параметров биосинтеза этих ферментов в природных условиях. Несмотря на то, что распределение рестриктаз в зависимости от выявляемых групп таксонов бактерий является очень слабо изученным, состав ЭР в природных источниках является одним из важнейших параметров, характеризующих экологические особенности популяций бактерий.
Цель данной работы - анализ многолетних исследований по поиску и идентификации новых наиболее перспективных штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), выделенных из различных экологических ниш оз. Байкал и применение полученных результатов в биотехнологии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Отбор проб воды и их посев. Пробы воды из экосистемы оз. Байкал отбирали с разных глубинных горизонтов водной толщи (до 1200 м) в чистых фоновых районах и в прибрежных районах, испытывающих антропогенное влияние. Пробы засевали методом глубинного посева. В качестве питательной среды использовали среду LB [17], т.е. 1% триптон ("Organotechme", Франция), 0,5% дрожжевой экстракт ("Огдапо-technie", Франция), 0,5% №С1, 0,05%, МдС12 и 0,001% тиамин. Культивирование бактерий проводили при температуре 25 °С в течение 48 ч. Выросшие колонии расчищали и отсевали в пробирки на агаризованную среду LB, инкубировали 20 ч при 25 °С. Для скрининга рестриктаз бактерии пересевали на другую чашку Петри с питательным агаром и выращивали ночь при 25 °С. Колонии, в которых обнаруживали ре-стриктазную активность, рассевали штрихом для получения клонов и их последующего исследования. Медленно растущие культуры выращивали 2-е сут при 30 °С.
Условия культивирования и наработка биомассы. Свежую культуру (100 мл посевного материала) засевали в колбу с питательным агаром на 500 мл. Выращивали при 30 °С со встряхиванием 130 об/мин в течение 12 ч. Затем 10 мл ночной культуры вносили в другую колбу с бульоном и продолжали выращивание.
Для исследования культуры отбирали пробы по 4 мл с интервалом 2 ч. Оптическую плотность определяли на фотоэлектроколориметре (КФК-ХЛ 4.2) в кювете толщиной 1 см. Клетки из 1 мл среды осаждали за 3 мин в микроцентрифуге Туре - 320. Супернатант отбирали, а осадок замораживали при -20 оС для последующего определения в нем удельной активности ре-стриктазы. Культивировали в течение 24 ч. Для наработки биомассы использовали 400 мл ночной культуры для засева 4 л бульона. Наработку проводили в ферментере Ы^егт 1601 ^КВ, Швеция) при 30 оС, аэрация 4 л/мин, перемешивание 200 об/мин. Рост контролировали по оптической плотности. При замедлении роста осаждали клетки при 8000 об/мин в роторе JA-10 при 4500 за 20 мин на центрифуге J-21 C ("Beckman", США). Биомассу хранили при -20 оС.
Выделение ферментов ЭР и их определение. Поиск рестриктаз в штаммах бактерий проводили после экспозиции 12 ч при 22 °С. Наличие ЭР определяли, как описано ранее, с некоторыми модификациями [1, 9]. Электрофорез ДНК проводили 1,5 ч при 150 V в горизонтальной пластине геля 1% агарозы, имевшего 4 ряда по 48 ячеек. Электродный буфер (рН 8,0) содержал (г/л): трис - 10,8; Н3ВО3 - 5,5; ЭТДА -0,93; этидиумбромид - 0,001. Гель фотографировали под ультрафиолетом через красный светофильтр на пленку «Микрат-Н» фотоаппаратом «Зенит-Е». Колонии микроорганизмов, лизаты которых специфически фрагментирова-ли ДНК, рассевали на агаризованной среде для последующего изучения чистых культур.
Определение таксономической принадлежности штаммов бактерий. Классификацию штаммов проводили по определителю Берги [2]. Содержание Г+Ц в ДНК определяли при помощи рестриктаз [9]. Колонии, в которых обнаруживали рестриктазную активность, рассевали штрихом для получения клонов, их последующего исследования и выявления перспективы использования при производстве ферментов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В ходе проведения работ (1991-2014 гг.) была создана коллекция микроорганизмов, выделенных из различных экологических ниш водного тела и донных отложений оз. Байкал. Сравнение состава микроорганизмов по наличию или отсутствию ферментов ЭР позволяет оценить изменение структуры и дает качественную индикацию влияния антропогенного загрязнения на бактериальную часть трофической цепи. Изолированность экосистемы Байкала обеспечивает благоприятные условия для образования новых видов микроорганизмов. Поскольку хорошо из-
вестно, что при прочих равных условиях, скорость эволюции вида обратно пропорциональна продолжительности генерации [11]. Очевидна целесообразность поиска эндемичных видов и, следовательно, продуцентов новых ферментов среди водных микроорганизмов, т.е. штаммов, выделенных из пелагиали и донных отложений оз. Байкал.
В ходе скрининга нами было проверено более 2500 штаммов бактерий из коллекции водных микроорганизмов на наличие в них ЭР. Продуценты рестриктаз, известные ранее лишь теоретически, были обнаружены в районах антропогенного влияния. В штаммах бактерий, выделенных из чистых участков озера, все обнаруженные нами рестриктазы являются хорошо известными. Так, например, штамм бактерий Flavobacterium aquatile - продуцент рестриктазы FauI - был выделен из воды оз. Байкал в районе пос. Листвянка. Штамм бактерии A. calcoaceticus - продуцент рестриктазы AcaI - был выявлен в районе г. Бай-кальска. Вид Acinetobacter calcoaceticus менее изучен, но продуцентов ферментов, способных расщеплять ДНК по последовательности CCA(N)5 TGG, до наших исследований в нем не обнаруживали. Штамм Bacillus sphaericus - продуцент рестриктазы BsiI, которая является новым ферментом среди рестриктаз, был выделен из этого же района [4, 8]. В истоке р. Ангары выделен штамм бактерии Curtobacterium citrium, продуцент CciNI, который является изошизоме-ром Notl. Позже при изучении микроорганизмов водного происхождения нами обнаружен штамм Sporosarcina sp. 9D, являющийся продуцентом рестриктазы, названной Sse 91 согласно общепринятой номенклатуре [19]. Выявленная эндо-нуклеаза рестрикции Sse9D является истинным изошизомером рестриктаз Tsp 5091, выделяемой из штамма Thermus sp. 509 [20]. В отличие от прототипа, этот фермент работает при температуре 55 оС и инактивируется при 65 оС в течение 20 мин, что позволяет по окончанию обработки ДНК рестриктазой просто прогреть инкубационную смесь, а не проводить дополнительную фенольную экстракцию в том случае, если продукты гидролиза необходимо использовать для дальнейших экспериментов. Важной особенностью этого фермента является его способность образовывать продукты гидролиза с 5'-вы-ступающими липкими концами, комплементарными липким концам, образующимся при гидролизе ДНК рестриктазами EcoRI (5-GAATTC-3') и AcsI (5-RAATTY-3'), где R-A или G ; Y-T или C [6].
Выделенные рестриктазы Fau1 (сайт узнавания 5'-CCCGC(4/6)-3' и Bsi1 (5'-CTCGTG(5/1)-3'), Sse91 (5'-AATT-3') являются уникальными из байкальской коллекции. Выделенные штаммы микроорганизмов перспективны в плане получе-
ния ферментных препаратов. Зарегистрированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов культура Flavobacterium aquatil B-1 (ВКПМ-4724) и штамм Acinetobacter calcoaceticus B-7 (ВКПМ В- 4721).
Таким образом, изучение спектра ферментов рестрикции бактериальных штаммов позволило выявить наличие уникальных (FanI и AcaI, Sse9I), а также весьма редких, нетипичных для водных экосистем ферментов (BsiI, CciNI), и использовать эти ферменты в биотехнологических разработках (табл. 1).
Часть штаммов-продуцентов, выделенных из оз. Байкал, используется для выделения ферментов, которые нашли свое применение в генно-инженерных работах в НПО «Вектор» и других объединениях (Авторское Свидетельство N. 16611212, N.16611213; N.1784642). Рестриктазы Aca 1, Bsi 1, Fan 1 производятся в НПО «Вектор» и НПО «Фермент».
Продолженные исследования по поиску ЭР (2005-2011 гг.) подтвердили, что исследуемые ферменты обнаруживаются в микроорганизмах, выделенных из проб воды в прибрежных районах п. Листвянка и г. Байкальска [5]. Полученные результаты встречаемости ферментов ЭР, обнаруженные в штаммах бактерий, выделенных из проб воды оз. Байкал в районах, испытывающих антропогенное влияние за период 2005-2011 гг., указывают на наличие рестриктазы HaeIII и XhoI, ClaI. Частота встречаемости остальных найденных ре-стриктаз составляет от 4 до 7%. Следует отметить, что указанные штаммы более продуктивны и являются перспективными в прикладном аспекте. В настоящее время ведутся их производственные испытания по достаточной продуктивности и доступности для биотехнологических разработок.
Результаты исследований спектра ЭР штаммов бактерий, выделенных из районов, где антропогенного влияния не выявлено, были обнаружены лишь в 0,2% случаев. ЭР в штаммах микроорганизмов, выделенных из скважины глубоководного бурения «Байкал-93» (возраста около 500 тыс. лет) и глубоководной части озера (пелагиали), являются хорошо известными, что подтверждает гипотезу о синтезе уникальных рестриктаз в микроорганизмах, выделенных в экологических нишах, испытывающих антропогенное влияния.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные многолетние исследования (1991-2014 гг.) с использованием методов молекулярной биологии в экологических задачах, дают возможность судить о качественном изменении микроорганизмов в
Таблица 1
Штаммы-продуценты уникальных рестриктаз
Район Год Вид Рестриктаза Сайт узнавания
Байкальск 1991 1991 Flavobacterium aquatil Acinetobacter calcoaceticus Fau I Aca I 5'-CCCGC-3' 5'-CCANTGG-3'
Листвянка 1995 1992 1998 Curtobacterium citreum Bacillus sphaericus Sporosarcina sp. 9D CciN I Bsi I Ssr9 I 5'-GCGGCCGC-3' 5'-CTCGNG-3' 5'-AATT-3'
Таблица 2
Частота встречаемости ЭР, выявленных в штаммах бактерий, выделенных из проб воды оз. Байкал в районах антропогенного влияния 2005-2014 гг.
Прототип Сайт узнавания % Таксономическая принадлежность бактерий
HaeIII 5'-GGCC-3' 14 Haemophilus sp.
ClaI 5'-ATCGAT-3' 9 Caryophano sp.
PstI 5'-CTGCAG-3' 4 Providencia sp.
Bpu10I 5'-CCTNAGC-3' 5 Bacillus sp.
Sau96I 5'-GGNCC-3' 7 Staphylococcus sp.
MboI 5'-GATC-3' 7 Moraxella sp.
EcoRII 5'-CCWGG-3' 5 Escherichia coli
XhoII 5'-RGATCY-3' 4 Xanthomonas sp.
BalI 5'-TGGCCA-3' 4 Brevibacterium sp.
XhoI 5'-CTCGAG-3' 9 Xanthomonas sp.
EcoRV 5'-GATATC-3' 4 Escherichia coli
BamHI 5'-GGATCC-3' 4 Bacillus sp.
прибрежной части оз. Байкал, находящейся под антропогенным влиянием. Штаммы-продуценты абсолютно нового и ряда уникальных ферментов рестрикции выделены в прибрежных районах, испытывающих антропогенное влияние. Этот факт дает возможность судить об изменении качества воды в прибрежной части оз. Байкал на ранней стадии.
В работе впервые обнаружены и идентифицированы новые штаммы-продуценты ЭР, выделенные в районах антропогенного влияния, которые являются перспективными для решения различных научно-исследовательских и производственных задач. В штаммах бакте-
1. Белавин Н.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т. 24, в.1. С. 129-132.
2. Берги Д. Х. Краткий определитель бактерий Берги / под редакцией Д.Г. Хоулта / пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. М.: Мир, 1980. 444 с.
3. Бурьянов Я. И. Системы модификации и рестрикции ДНК как биологические факторы эволюции у микроорганизмов // Вопросы эволюции бактерий. Пущино, 1984. С. 117-124.
4. Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х., Куснер Ю.С.
рий, выделенных из чистых участков озера, ЭР обнаруживаются редко и являются хорошо известными. Полученные результаты дают основание полагать, что прибрежная часть оз. Байкал, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для появления новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции. Многолетними исследованиями подтверждено, что в микроорганизмах, выделенных из пелагиали озера, а также из кернов осадков (возрастом более 1000 лет, где отсутствовало антропогенное воздействие), т.е. экологически чистых районах экосистемы оз. Байкал, ЭР не обнаружены.
КИЙ СПИСОК
Микроорганизмы озер Байкал и Ньяса как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, № 4. С. 455-459.
5. Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х., Чернухин В.А. Разработка и апробация физико-химических методов в экологических исследованиях // Вода: химия и экология. 2014, № 3. С. 66-70.
6. Гончар Д.А., Дедков В.С., Верхозина В.А. Эндонуклеаза рестрикции Sse9I из штамма Sporosarcina sp. 9D, узнающая последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' // Молекулярная генетика.
1998. № 1. С. 32-34.
7. Дегтярев С.Х. Репин В.Е., Речкунова Н.И., Нетесова Н.А. Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции Vne I // Биоорганическая химия. 1987. Т. 13, № 3. С. 422-423.
8. Дедков В.С., Репин В.Е., Речкунова Н.И. Дегтярев С.Х., Верхозина В.А. Выявление штаммов- продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди водных микроорганизмов озера Байкал // Известия Сибирского отделения АН СССР. Сер. «Биол. науки». 1990. № 1. С. 35-37.
9. Дедков В. С., Дегтярев С.Х. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. 2004. № 4. С. 77-82.
10. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 443 с.
11. Оно С. Генетические механизмы прогрессивной эволюции / пер. с англ. под ред. Б.Н. Сидорова. М.: Мир, 1984. 96 С.
12. Свадьбина И.В., Железнякова Е.Н., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Bacillus species LU4-эффективный продуцент термостабильной сайт-специфической эндокуклеазы BspLU4I, изошизо-мера Aval // Биохимия. 2003. Т. 68, вып. 4. С. 529-536.
13. Ушакова Т. А., Пучкова Л.И., Гуторов В. В., Тотменина О.Д., Репин В.Е. Эндонуклеаза рестрикции Asi256l, узнающая и расщепляющая последовательность нуклеотидов 5-GATC-3 //
Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, № 1. С. 34-37.
14. Чернухин В.А., Голикова Л.Н., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Каширина Ю. Г., Нетесова Н.А., Дегтярев С. Х. ДНК-метилтранс-феразы M.BstF5I-2 и M.BstF5I-4 системы рестрикции-модификации Bst5I из Bacillus stearothermophilus F 5 // Биохимия. 2003. Т. 68, вып. 9. С. 1183-1192.
15. Юнусова А.К., Рогулин Е.А., Артюх Р. И., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Белок, кодируемый открытой рамкой считывания, расположенной рядом с геном никазы BspD6I, в комплексе с никазой образует эндоуклеазу рестрикции // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 7. С. 1002-1008.
16. Янулайтис А. А. Ферменты рестрикции и их применение // Итоги науки и техники. Биотехнология. 1989. Т. 17. 202 с.
17. Bertani G. Studtes on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. 1951. J. Bactertol. 62. 293-300.
18. Dryden D.T.F., Cheng X., Blumenthal R.M. EdsIn S-adenosylmethioine-dependent methyl-transferases: structures and function // Wold Scentific Singapure. 1999. P. 283-340.
19. New England Biolabs: ratalog 1986-1987. Р. 116-117.
20. Roberts R.J., Macelis D. // Restriction endonucleases and their isolshizomes // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. Р. 3125-3137.
REFERENCES
1. Belavin N.A., Dedkov V.S., Degtjarev S.H Metod opredelenija jendonukleaz restrikcii v kolonijah bakterij //Prikladnaja biohimija i mikrobiologija. 1988. T.24., v.1. S. 129-132.
2. Bergi D. H. Kratkij opredelitel' bakterij Bergi /D. H. Bergi. Pod redakciej D. G. Houlta. Per. s angl. pod red. akad. RAN G.A. Zavarzina // M.: Mir.1980. 444 S.
3. Burjanov Ja. I. Sistemy modifikacii i restrikcii DNK kak biologicheskie faktory jevoljucii u mikroorganizmov //Voprosy jevoljucii bakterij. Pushhino. 1984. S. 117-124.
4. Verhozina V.A., Verhozina E.V., Gonchar D.A., Dedkov V.S., Degtjarev S.H., Kusner Ju. S. Mikroorganizmy ozer Bajkal i N'jasa kak indikatory antropogennogo vlijanija i perspektiva ih ispol'zovanija v biotehnologii. //Prikladnaja biohimija i mikrobiologija, 2004. T. 40. № 4. S.455-459.
5. Verhozina V.A., Verhozina E.V., Gonchar D.A., Dedkov V.S., Degtjarev S.H., Chernuhin V.A. Razrabotka i aprobacija fiziko-himicheskih metodov v jekologicheskih issledovanijah //Voda: himija i jekologija. 2014. № 3. s. 66-70.
6. Gonchar D.A., Dedkov V.S., Verhozina V.A. Jendonukleaza restrikcii Sse91 iz shtamma Spo-
rosarcina sp. 9D uznaet posledovatel'nost' 5'-AATT-3'. Molekuljarnaja genetika. 1998. №1.S. 32-34.
7. Degtjarev S.H. Repin V.E., Rechkunova N.I., Netesova N.A. Ustanovlenie specifichnosti jen-donukleazy restrikcii Vne I //Biorgan. Himija. 1987. T. 13. № 3. S. 422-423.
8. Dedkov V.S., Repin V.E., Rechkunova N.I. Degtjarev S.H., Verhozina V.A. Vyjavlenie shtammov-producentov jendonukleaz restrikcii sredi vodnyh mikroorganizmov ozera Bajkal. // Izv. Sib. Otd. AN SSSR, ser. "Biologich. nauki". 1990. №1. S. 35-37.
9. Dedkov V. S., Degtjarev S.H. Opredelenie soderzhanija G+C v DNK bakterij pri pomoshhi jendonukleaz restrikcii // Biotehnologija. 2004. № 4. S. 77-82.
10. Maniatis T., Frig Je., Sjembruk Dzh. Me-tody geneticheskoj inzhenerii. Molekuljarnoe kloni-rovanie. M. Mir. 1984. 443 s.
11. Ono S. Geneticheskie mehanizmy pro-gressivnoj jevoljucii (per. s angl. pod red B.N. Si-dorova). M. Mir 1984. 96 S.
12. Svad'bina I.V., Zheleznjakova E.N., Zhel-eznaja L.A., Matvienko N.I. Bacillus species LU4-jeffektivnyj producent termostabil'noj sajt-specifi-cheskoj jendokukleazy BspLU4I, izoshizomera AvaI //
Biohimija, 2003, tom 68, vyp. 4, s. 529-536.
13. Ushakova T. A., Puchkova L.I., Gutorov V.V., Totmenina O.D., Repin V.E. Jendonukleaza restrikcii Asi256I, uznajushhaja i rasshhepljajushhaja posledovatel'nost' nukleotidov 5-GATC-3 // Prik-ladnaja biohimija i mikrobiologija, 2008, tom 44, № 1, s. 34-37.
14. Chernuhin V.A., Golikova L.N., Gonchar D.A., Abdurashitov M.A., Kashirina Ju. G., Netesova N.A., Degtjarev S. H. DNK-metiltransferazy M.BstF5I-2 i M.BstF5I-4 sistemy restrikcii-modifikacii Bst5I iz Bacillus stearothermophilus F 5 // Biohimija, 2003, tom 68, vyp. 9, s. 1183-1192.
15. Junusova A.K., Rogulin E.A., Artjuh R. I., Zheleznaja L.A., Matvienko N.I. Belok, kodiruemyj otkrytoj ramkoj schityvanija, raspolozhennoj rjadom s genom nikazy BspD6I, v komplekse s nikazoj ob-
razuet jendoukleazu restrikcii //Biohimija, 2006, tom 71, vyp. 7, s. 1002-1008.
16. Janulajtis A. A. Fermenty restrikcii i ih primenenie // Itogi nauki i tehniki. Biotehnologija. T.17.Mju 1989. 202 S.
17. Bertani G. Studtes on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. 1951. J. Bactertol. 62. 293-300.
18. Dryden, D.T.F. Cheng X., Blumenthal R.M. EdsIn S-adenosylmethioine-dependent methy-transferases: structures and function. // Wold Scentific, Singapure 1999 // pp. 283-340.
19. New England Biolabs. - Catalog, 1987/1988 New England Biolab.- Catalog 1986-1987. rp. 116-117.
20. Roberts R.J., Macelis D. //Restriction en-donucleases and their isolshizomes. // Nucleic Acids Res. 1993. v. 21. rr. 3125-3137.
Статья поступила в редакцию 10.12.2015 г.
УДК 579.222; 579.6
БАКТЕРИИ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРЫ РОДА RHODOCOCCUS -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ БИОСУРФАКТАНТОВ
© Т.М. Льюнг1, И.А. Нечаева1, К.В. Петриков2, И.Ф. Пунтус2, О.Н. Понаморева1
1 Тульский государственный университет,
300012, Россия, г. Тула, пр. Ленина, 92, [email protected]
2 Институт физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Россия, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, д. 5, [email protected]
Исследована способность бактерий-нефтедеструкторов Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67, входящих в состав биопрепарата «МикроБак», продуцировать гликолипидные биосурфак-танты при росте на н-гексадекане в жидкой минеральной среде при 26 оС. Установлено, что эти микроорганизмы являются эффективными продуцентами биосурфактантов: через 6 сут культивирования поверхностное натяжение среды уменьшалось с 72 мН/м до 27 мН/м. Качественный анализ липидных компонентов, продуцируемых обоими штаммами микроорганизмов, методом тонкослойной хроматографии позволил идентифицировать основные гликолипидные биосурфак-танты - как сукциноилтрегалолипиды, так и трегалозомиколаты. Содержание трегалолипидов увеличивалось по мере роста клеток, наибольшее значение достигалось на поздней фазе экспоненциального роста бактерий: 305 мг/л - для X5, 280 мг/л - для S67, при этом индекс эмульгирования составил 55% и 40% соответственно.
Ключевые слова: биосурфактанты; трегалолипиды; Rhodococcus; бактерии-нефтедеструкторы.
OIL-DEGRADING MICROORGANISMS OF GENUS RHODOCOCCUS -POTENTIAL PRODUCERS OF BIOSURFACTANTS
T.M. Luong1, I.A. Nechaeva1, K.V. Petrikov2, I.F. Puntus2, O.N. Ponamoreva1
