CC BY
91
© В. С. ДЕДКОВ, 2012
УДК 579.852.11:579.222]:577.152
В. С. Дедков
НОВАЯ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА М^С81, ОБРАЗУЮЩАЯ 5'-С(т5С)ППСС-3'. ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ К
М^Ю81-МЕТИЛИРОВАНИЮ
НПО "СибЭнзим", Новосибирск
Новая ДНК-метилаза M.BstC8I была определена в клеточном лизате Bacillus stearothermophilus С8, выращенной на агаре Лу-риа при 37°C. Метилирование ДНК бактериофагов X и T7 в сегменте 5'-G(m5C)NNGC-3' блокировало активность рестриктазы BstC8I. Специфичность M.BstC8l определяли, используя метилированную ею X ДНК, компьютерное моделирование и данные о чувствительности рестриктаз BstC8I, BsuRI, AjnI и PvuII к метилированию. Была показана чувствительность ряда рестриктаз к перекрыванию их сайтов узнавания новым видом метилирования. Результаты могут быть использованы для изучения метилирования ДНК.
Ключевые слова: ДНК-метилтрансфераза, компьютерное моделирование, определение специфичности, чувствительность к метилированию
ДНК-метилтрансферазы (ДНК-метилазы) переносят метильную группу с S-аденозилметионина (SAM) на основания ДНК. К этим ферментам относятся ци-тозин (С5)-ДНК-метилтрансферазы (эукариотиче-ские - КФ 2.1.1.37 и прокариотические - КФ 2.1.1.73), цитозин (М4)-ДНК-метилтрансферазы (КФ 2.1.1.113) и аденин (Мб)-ДНК-метилтрансферазы (КФ 2.1.1.72) [15]. Метилированные основания обозначают соответственно (m5C), (m4C) и (m6A). ДНК-метилазы
Рис. 1. Электрофореграмма расчетного (а) и экспериментального (б) расщепления исходной и М^Ю81-метилированной X ДНК рестриктазами BstC8I (узнает 5'-GCNлNGG-3'), BsuRI (5'-ЩлсС-3'), AjnI (5'-лcCWGG-3') и РуиП (5'-CAGлCTG-3').
1 (а, б) - исходная ДНК; 2 (а) - ДНК с заменами G(C=>N)NN(G=>N С для расщепления Б§Ю81, БйиЫ, Руи1 и с заменами CNNG(C=>N) для Л)п1; 2 (б) - ДНК + МВЮ81.
отличаются специфичностью к нуклеотидной последовательности, в которой находится метилируемое основание, а также и к атому самого основания. В системах рестрикции - модификации (РМ) бактерий ДНК-метилазы, метилируя узнаваемую последовательность ДНК, защищают ее от сопряженных эн-донуклеаз рестрикции (рестриктаз) [6].
Термофильная рестриктаза BstC8I и B. stearothermophilus C8 узнает последовательность 5'-GCNNGC-3'. Прототипом фермента является Cac8I из Clostridium acetobutylicum ABKn8 [7]. Рестриктазы BstC8I и Cac8I производятся для продажи. По данным REBASE (http://www.rebase.neb.com), РМ-система Cac8I клонирована. Указано, что ДНК-метилаза M.Cac8I образует (m5C) в последовательности 5'-GCNNGC-3'. Однако место метилирования не определено, и данные не опубликованы. Поэтому вполне актуально изучение специфичности ДНК-метилазы, сопряженной с рестриктазой BstC8I.
Для определения специфичности ДНК-метилазы M.BstC8I мы использовали принцип изменения видимой специфичности рестриктаз при метилировании ДНК [10], дополнив его компьютерным моделированием метилирования ДНК [1, 2]. Актуальным является также изучение чувствительности рестриктаз к перекрыванию их сайтов узнавания новым видом метилирования.
Материалы и методы
Материалы. В работе использовали рестриктазы производства НПО "СибЭнзим" (Новосибирск): Acc16I (гидролизует ДНК по 5'-TGCAGCA-3'), AccBlI (5'-GAGYRCC-3'), AccB7I (5'-CCANNNNANTGG-3'), AccBSI (5'-CCGCTC(-3/-3)-3'), Ajnl (5'-ACCWGG-3'), AluBI (5'-AGACT-3'), AluI (5'-AGACT-3'), ApaI (5'-GGGCCAC-3'), AspLEI (5'-GCGAC-3'), AspS9I (5'-GAGNCC-3'), AsuNHI (5'-GACTAGC-3'), BmtI (5'-GCTAGAC-3'), Bpu10I (5'-CCTNAGC(-5/-2)-3'), Bsc4I (5'-CCNNNNNANNGG-3'), Bse3DI (5'-GCAATG(2/0)-3'), Bsp1720I (5'-GCATNAGC-3'), BspFNI (5'-CGACG-3'), BstC8I (5'-GCNANGC-3'), BstH2I (5'-RGCGCAY-3'), BstHHI (5'-GCGAC-3'), BstMWI (5'-GCNNNNNANNGC-3'), BstSLI (5'-GKGCMAC-3'), BstVlI (5'-GCAGC(8/12)-3'), BstXI (5'-CCANNNNNANTGG-3'), BsuRI (5'-GGACC-3'), FauI (5'-CCCGC(4/6)-3'), HindIII (5'-AAAGCTT-3'), HspAI (5'-GACGC-3'), Mh1I (5'-GDGCHAC-3'), M1uI (5'-AACGCGT-3'), Msp20I (5'-TGGACCA-3'), MspAlI (5'-CMGACKG-3'), NruI (5'-TCGACGA-3'), PceI (5'-AGGACCT-3'), PctI (5'-GAATGC(1/-1)-3'), PspOMI (5'-GAGGCCC-3'), PvuII (5'-CAGACTG-3'), SbfI (5' -CCTGCAAGG-3'), SphI (5'-GCATGAC-3') и Zsp2I (5'-ATGCAAT-3'); ДНК бактериофага X (dam-, dcm+) и ДНК бактериофага T7 того же НПО; ацети-лированный бычий сывороточный альбумин (BSA-Ac) "Biotech-nic GmbH" (Германия); лизоцим "Helicon" (Россия); триптон и дрожжевой экстракт "Organotechnie" (Франция); агарозу LE "Se-genetic" (Германия); S-аденозилметионин (SAM) - ГЕПТРАЛ для инъекций "Hospira" (Италия); соли и химикаты отечественного производства квалификации "х. ч.".
Штамм B. stearothermophilus C8, продуцент рестриктазы BstC8I, получен из коллекции культур микроорганизмов НПО
проводили электрофорез в 0,8% агарозе при 5 В/см в течение 2,5 ч по методике [4].
Моделирование метилирования ДНК, блокирующего узнавание рестриктазами метилированных сайтов, проводили так, как детально описано ранее [1, 2]. Для моделирования образования 5'^(т5С)МШС-3' при M.BstC8I-метилировании ДНК мы редактировали записи нуклеотидных последовательностей, заменяя в них все GCNNGC на GNNNNC. Т. е. для моделирования метилирования обеих цепей ДНК заменяли как метилируемое, так и комплементарное ему основание. Эту редакцию в дальнейшем обозначали G(C=>N)NN(G=>N)C. В сайтах, узнаваемых некоторыми рестриктазами, МВЮ81 могла метилировать разные цитозины. В этих случаях моделировали метилирование конкретного цитозина. Например, в сайтах, узнаваемых BstMWI (5'^СМШШКШС-3'), M.BstC8I могла метилировать как внутренний, так и внешний цитозин. Однако моделирование G(C=>N)NN(G=>N)C не различало это. Поэтому блокирование BstMWI при метилировании, например, внутреннего цитозина в ее сайте узнавания моделировали как G(C=>N)NNGCNNNGC + GCNNNGCNN(G=>N)C. При необходимости моделировали метилирование конкретных сайтов в последовательности ДНК.
Результаты и обсуждение В. stearothermophilus С8 - продуцент рестриктазы В8Ю81, вырастает достаточно быстро на питательном агаре при 55С. Мы, однако, культивировали этот штамм при 37С. Оказалось, что в клеточном лизате такой культуры повышена активность сопряженной ДНК-метилазы. Вероятно, при 37 С вегетативные клетки бациллы не успевали спорулировать. Оптимальные условия активности ДНК-метилазы определяли по блокированию расщепления рестриктазой В8Ю81 метилированной ДНК по методике [1, 2]. Затем, как описано в "Материалах и методах", метилировали ДНК фага X, на которой и определяли специфичность ДНК-метилазы. Для этого использовали рестриктазы, у которых изучена чувствительность к метилирова-
Таблица 1
Сравнение известных и новых данных о чувствительности рестриктаз к метилированию сайтов узнавания для определения
специфичности ДНК-метилазы M.BstC8I
"СибЭнзим", где хранится под номером 5М09. Культивирование штамма проводили в течение 20 ч при 37°C в чашке Петри на среде, содержащей 1,2% агара, 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl, 0,05% MgCl2 и 0,001% тиамин, pH 7,5.
Клеточный лизат для изучения ДНК-метилазы получали по методу [8] с некоторыми модификациями. 3-5 мг клеток подвергали лизису в течение 30 мин при 22°C под действием 0,1 мл смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl (pH 8), 1 мМ ЭДТА, 1 мг/мл тритона Х-100 и 0,1 мг/мл лизоцима.
МВЮ81-метилирование субстратных ДНК проводили в реакционных смесях объемом 1 мл, содержащих 50 мкг/мл ДНК (фага I либо T7), 10 мМ SAM, 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9), 1 мМ ЭДТА, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл BSA-Ac и 0,1 мл лизата клеток при 55°C в течение 6 ч. Для определения метилирования отбирали пробы по 50 мкл, добавляли в них до 10 мМ ацетата магния, по 2,5 единицы активности BstC8I (10-кратный избыток) и инкубировали в течение 1 ч при 55°C. Затем добавляли по 10 мкл стоп-буфера, содержащего 0,25 М Na-ЭДТА (pH 8,5), 50% сахарозы, 0,01% бромфенолового синего и 0,01% рибонуклеазы. Пробы анализировали электрофорезом в 0,8% агарозе в трис-ацетатном буфере с 0,5 мг/л этидия бромида при напряжении 5 В/см в течение 70 мин по методике [4]. При отсутствии фрагментации ДНК добавляли (в смеси по 1 мл) по 0,05 мл 10% SDS и по 0,2 мл 3 М KCl. Инкубировали их в течение 10 мин при 65°C для получения прозрачного раствора, затем инкубировали их в течение 1 ч при 0°C. Осадки белка отделяли центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочные растворы отбирали и добавляли в них по 0,7 мл изопропанола. Полученные осадки ДНК промывали в этаноле, подсушивали и растворяли в 0,7 мл 10 мМ трис-HCl (pH 7,6), 1 мМ ЭДТА.
Блокирование рестриктаз при МВЮ81-метилировании выявляли путем гидролиза ДНК при 10-кратном избытке рестрик-таз в условиях, рекомендованных производителями. Для опыта использовали метилированную ДНК, а для контроля - исходную. В ячейки планшета, содержащие по 50 мкл смеси 50 мкг/мл ДНК в рестрикционном буфере с 0,1 мг/мл BSA-Ac, добавляли 12 единиц рестриктазы и инкубировали в течение 2 ч при оптимальной температуре. Затем добавляли по 10 мкл стоп-буфера и
Рестриктаза
Метилирование сайта узнавания*
Способ метилирования Расщепление сайта
Ссылка
BstC8I
BsuRI
BsuRI
AjnI
AjnI
AjnI
PvuII
PvuII
PvuII
PvuII
PvuII
5'-G(m5C)NNGC-3' 3'-CGNN(m5C)G-5' 5'-GG(m5C)C-3' 3'-C(m5C)GG-5' 5'-GG(m5C)Cngc-3' 3'-CCGGn(m5C)g-5' 5'-(m5C)CWGG-3' 3'-GGWC(m5C)-5' 5'-ggn(m5C)CWGG-3' 3'-c(m5c)nGGWCC-5' 5'-g(m5c)nngCCWGG-3' 3'-cgnn(m5c)GGWCC-5' 5'-CAG(m4C)TG-3' 3'-GT(m4C)GAC-5' 5'-CAG(m4C)TG-3'
3'-GTCGAC-5' 5'-CAG(m5C)TG-3' 3'-GT(m5C)GAC-5' 5'-CAG(m5C)TG-3'
3'-GTCGAC-5' 5'-CAG(m5C)TGgc-3' 3'-GTCGAC(m5c)g-5'
Сопряженная ДНК-метилаза Сопряженная ДНК-метилаза
M.BstC8I ДНК-метилаза Сопряженная ДНК-метилаза M.AspS9I ДНК-метилаза M.BstC8I ДНК-метилаза Сопряженная ДНК-метилаза Синтез M.AluI ДНК-метилаза Синтез M.BstC8I ДНК-метилаза
Нет
Да Нет
Да
Данная статья
[9]
Данная статья
[3] [2]
Данная статья [16] [13] [12] [12] Данная статья
Примечание. . * - выделен прописными буквами.
12121212121212121212121212121212121212121212
Acc16l AccBII AccBSI Apal AspS9l AsuNHI Bmtl Bsc4l BspFNI BstC8l BstMWI BstVIl Faul Hindill Mlul Msp20l Peel Pctl PspOMI Sbfl Sphl Zsp2l
Рис. 2. Расчетный и экспериментальный электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X рестриктазами до и после метилирования
этой ДНК по 5'-G(m5C)NNGC-3'. 1 - исходная ДНК; 2 - ДНК с заменами G(C=>N)NN(G=>N)C при моделировании или ДНК + M.BtC8I в эксперименте. Рестриктазы: Acc16I (узнает 5'-TGCAGCA3'), AccBII (5'-GAGYRCC-3'), AccBSI (5'-CCGCTC(-3/-3)-3'), Apal (5'-GGGCCAC-3'), AspS9I (5'-GAGNCC-3'), AsuNHI (5'-GACTAGC-3'), Bmtl (5'-GCTAGAC-3'), Bsc4I (5'-CCNNNNNNNGG-3'), BspFNI (5'-CGACG-3'), BstC8I (5'-GCNANGC-3'), BstMWI (5'-GCNNNNNNNGC-3'), BstVlI (5'-GCAGC(8/12)-3'), FauI (5'-CCCGC(4/6)-3'), HindIII (5'-AAAGCTT-3'), MluI (5'-AACGCGT-3'), Msp20I (5'-TGGACCA-3'), PceI (5'-AGGACCT-3'), PctI (5'-GAATGC(1/-1)-3'), PspOMI (5'-GAGGCCC-3'), SbfI (5'-CCTGCAAGG-3'), SphI (5'-GCATGAC-3'), Zsp2I (5'-ATGCAAT-3').
нию. Путем моделирования определили, что МВЮ81 может метилировать некоторые сайты узнавания этих рестриктаз на ДНК фага X, что затем проверяли экспериментально. На рис. 1, а видно, что при моделировании BstC8I расщепляла исходную последовательность X ДНК по сайтам GCNNGC, но не расщепляла последовательность, в которой эти сайты редактированы G(C=>N)NN(G=>N)C (для BstC8I дорожки 1 и 2 соответственно). В эксперименте (рис. 1, б) BstC8I также не расщепляла метилированную ДНК. Сопряженную ДНК-метилазу назвали МВЮ81 в соответствии с номенклатурой [14]. МВЮ81 метилировала последовательность 5'-GCNNGC-3'. На X ДНК эта последовательность перекрывала некоторые сайты, узнаваемые рестриктазой BsuRI (узнает 5'-GGACC-3'). В результате при моделировании и в эксперименте BsuRI не расщепляла метилированную последовательность 5'-
GGCCNGC-3' (см. рис. 1, дорожки 1 и 2 для BsuRI). Известно, что BsuRI не расщепляет сайт 5'-GG(m5C) С-3', метилированный сопряженной ДНК-метилазой [9]. В сайте 5'-ОСгСС-3', узнаваемом В^, М^Ю81 могла метилировать только внутренний цитозин вне зависимости от того, какой цитозин она метилировала в своем сайте узнавания 5'-GCNNGC-3'. С помощью рестриктазы AjnI (узнает 5'-ACCWGG-3', прототип -EcoRII) показали, что M.BstC8I, однако, не образовывала 5'-GCNNG(m5C)-3' (см. рис. 1, дорожки 1 и 2 для AjnI). Сайты узнавания МВЮ81 и AjnI могут перекрываться только внешними цитозинами. Известно, что AjnI не расщепляет сайт 5'-(m5C)CWGG-3', метилированный по одной или обеим цепям [2, 3]. При моделировании AjnI не расщепляла сайты (0=>^ CNNG(C=>N)CWGG, но в эксперименте расщепляла сайты 5'-GCNNGCCWGG-3' в метилированной
w Ш
WM
мм • •
ÜB—
AccB7l AluI AluBI AspLEI BpuMI Bse3DIBspmOIBstC8IBstH2l BstHHI BstSLI BstXI HspAl Mhll MspAl Nrul
Рис. 3. Расчетный и экспериментальный электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага T7 рестриктазами до и после метилирования этой ДНК по 5'-G(m5C)NNGC-3'.
1 - исходная ДНК; 2 - ДНК с заменами G(C=>N)NN(G=>N)C при моделировании или ДНК + M.BtC8I в эксперименте. Рестриктазы: AccB7I (5'-CCANNNNANTGG-3'), AluI (5'-AGACT-3'), AluBI (5'-AGACT-3'), AspLEI (5'-GCGAC-3'), Bpu10I (5'-CCTNAGC(-5/-2)-3'), Bse3DI (5'-GCAATG(2/0)-3'),
Bsp1720I (5'-GCATNAGC-3'), BstC8I (5'-GCNANGC-3'), BstH2I (5'-RGCGCAY-3'), BstHHI (5'-GCGAC-3'), BstSLI (5'-GKGCMAC-3'), BstXI (5'-CCANNNNNANTGG-3'), HspAI (5'-GACGC-3'), Mh1I (5'-GDGCHAC-3'), MspAlI (5'-CMGACKG-3'), NruI (5'-TCGACGA-3').
ДНК. Следовательно, M.BstC8I не образовывала 5'-GCNNG(m5C)-3'. Она не образовывала и (m4C), что показали при помощи рестриктазы PvuII (см. рис. 1, дорожки 1 и 2 для PvuII). PvuII не расщепляет сайт 5'-CAG(m4C)TG-3', метилированный сопряженной ДНК-метилазой [16], а также сайт, метилированный таким же образом по одной цепи [13]. Однако PvuII расщепляет сайт 5'-CAG(m5C)TG-3' [12]. В эксперименте PvuII расщепляла метилированные последовательности 5'-CAGmCTGGC-3', которые выявило моделирование. Таким образом, M.BstC8I не образовывала 5'-G(m4C)NNGC-3', 5'-GCNNG(m4C)-3', а также 5'-GCNNG(m5C)-3', но образовывала 5'-G(m5C) NNGC-3', что блокировало активность рестриктаз BstC8I и BsuRI. На рис. 1 видно также, что перекрывающее метилирование достаточно полно блокировало BsuRI, из чего следует, что M.BstC8I метилиро-
вала обе цепи ДНК в своем сайте узнавания. В табл. 1 суммированы известные и полученные данные о чувствительности рестриктаз к метилированию, которые позволили определить специфичность новой ДНК-метилазы. Из полученных данных однозначно следует, что M.BstC8I образует 5'-G(m5C) NNGC-3' и относится к цитозин (С5)-ДНК-метилтрансферазам (КФ 2.1.1.73) [15].
Существенной характеристикой специфичности рестриктаз является их чувствительность к метилированию сайтов узнавания. Это свойство рестриктаз используют для изучения метилирования ДНК.
Чувствительность, однако, может соблюдаться только до определенного избытка активности рестриктазы, необходимой для расщепления обычного, не метилированного сайта. Для работы с ДНК нередко затруднительно воспроизвести результаты, полученные с использованием синтетических олигонуклеотидов. Новая ДНК-метилаза позволяет по-новому метилировать в ДНК сайты узнавания рестриктаз. Поэтому ДНК фагов X и T7, метилированные M.BstC8I, использовали для изучения чувствительности рестриктаз к метилированию. Для рестриктаз, сайты узнавания которых перекрываются с 5'-G(m5C)NNGC-3', моделировали расщепление канонических и редактированных G(C=>N) NN(G=>N)C последовательностей ДНК. На рис. 2 и 3 показан расчетный и экспериментальный гидролиз рестриктазами исходной и метилированной ДНК. Моделирование G(C=>N)NN(G=>N) C блокировало узнавание всех сайтов рестриктаз, в которых оно перекрывало цитозины. Однако в эксперименте рестриктазы могли быть и нечувствительны к чужеродному метилированию. Кроме того, M.BstC8I могла метилировать различные цитозины сайта, узнаваемого конкретной рестриктазой. Иногда сайт узнавания перекрывали сразу два сайта метилирования. В результате экспериментальные электро-фореграммы отличались от расчетных. Поэтому для того чтобы определить чувствительность отдельной рестриктазы к метилированию конкретного цитози-на в ее сайте узнавания, мы моделировали его перекрывание метилированием 5'-G(m5C)NNGC-3', как описано в "Материала и методах". Этим методом изучали рестриктазы BspFNI (узнает 5'-CGCG-3'), BstMWI (5'-GCNNNNNNNGC-3'), BstV1I (5'-GCTGC-3') и Bsp1720I (5'-GCTNAGC-3'). Модели-
Таблица 2
Гидролиз рестриктазами сайтов узнавания, перекрытых M.BstC8I-метилированием 5'-G(m5C)NNGC-3'
Рестриктаза Метилирование сайта узнавания Гидролиз, % Рестриктаза Метилирование сайта узнавания Гидролиз, %
Acc16I 5'-TGCG(m5C)A-3' 3'-A(m5C)GCGT-5' 0 BstSLI 5'-GKG(m5C)MC-3' 3'-CMCGKG-5' 0
AccBII 5'-GGYR(m5C)C-3' 3'-CCRYGG-5' 0 BstV1I 5'-GCAG(m5C)-3' 3'-CGTCG-5' 100
AccB7I 5'-(m5C)CANNNNNTGG-3' 3'-GGTNNNNNACC-5' 80 BstV1I 5'-GCAGC-3' 3'-(m5C)GTCG-5' 100
AccBSI 5'-CCG(m5C)TC-3' 3'-GGCGAG-5' 100 BstXI 5'-(m5C)CANNNNNNTGG-3' 3'-GGTNNNNNNACC-5' 0
AluBI 5'-AG(m5C)T-3' 3'-TCGA-5' 100 BsuRI 5'-GG(m5C)C-3' 3'-CCGG-5' 0
AluI 5'-AG(m5C)T-3' 3'-TCGA-5' 0 FauI 5'-(m5C)CCGC-3' 3'-GGG(m5C)G-5' 0
Apal 5'-GGG(m5C)CC-3' 3'-CCCGGG-5' 0 HindIII 5'-AAG(m5C)TT-3' 3'-TTCGAA-5' 80
AspLEI 5'-GCG(m5C)-3' 3'-CGCG-5' 0 HspAI 5'-GCG(m5C)-3' 3'-CGCG-5' 100
AspS9I 5'-GGN(m5C)C-3' 3'-CCNGG-5' 0 Mh1I 5'-GDG(m5C)HC-3' 3'-CHCGDG-5' 0
AsuNHI 5'-G(m5C)TAGC-3' 3'-CGAT(m5C)G-5' 0 MluI 5'-ACG(m5C)GT-3' 3'-TG(m5C)GCA-5' 0
BmtI 5'-G(m5C)TAGC-3' 0 MluI 5'-ACG(m5C)GT-3' 50
3'-CGAT(m5C)G-5' 3'-TGCGCA-5'
Bpu10I 5'-CCTNAG(m5C)-3' 100 Msp20I 5'-TGG(m5C)CA-3' 0
3'-GGANTCG-5' 3'-ACCGGT-5'
Bsc4I 5'-(m5C)CNNNNNNNGG-3' 100 MspA1I 5'-CMG(m5C)KG-3' 100
3'-GGNNNNNNNCC-5' 3'-GKCGMC-5'
Bse3DI 5'-GCAATG-3' 100 NruI 5'-TCG(m5C)GA-3' 80
3'-(m5C)GTTAC-5' 3'-AGCGCT-5'
Bsp1720I 5'-GCTNAG(m5C)-3' 100 PceI 5'-AGG(m5C)CT-3' 0
3'-(m5C)GANTCG-5' 3'-TCCGGA-5'
Bsp1720I 5'-GCTNAG(m5C)-3' 100 PctI 5'-GAATG(m5C)-3' 100
3'-CGANTCG-5' 3'-CTTACG-5'
BspFNI 5'-(m5C)GCG-3' 3'-GCG(m5C)-5' 0 PspOMI 5'-GGG(m5C)CC-3' 3'-CCCGGG-5' 0
BspFNI 5'-CG(m5C)G-3' 3'-GCGC-5' 0 PvuII 5'-CAG(m5C)TG-3' 3'-GTCGAC-5' 100
BstC8I 5'-G(m5C)NNGC-3' 3'-CGNN(m5C)G-5' 0 SbfI 5'-CCTG(m5C)AGG-3' 3'-GGACGTC(m5C)-5' 0
BstH2I 5'-RGCG(m5C)Y-3' 3'-YCGCGR-5' 100 SphI 5'-G(m5C)ATGC-3' 3'-CGTA(m5C)G-5' 0
BstHHI 5'-GCG(m5C)-3' 3'-CGCG-5' 100 Zsp2I 5'-ATG(m5C)AT-3' 3'-TACGTA-5' 100
Bst 5'-G(m5C)NNNNNNNGC-3' 0 BstSLI 5'-GKG(m5C)MC-3' 0
MWI 3'-CGNNNNNNNCG-5' 3'-CMCGKG-5'
Bst 5'-GCNNNNNNNG(m5C)-3' 50 BstV1I 5'-GCAG(m5C)-3' 100
рование на рис. 4 показало, что в ДНК фага X часть сайтов 5'-CGCG-3', узнаваемых BspFNI, может быть блокирована при Ы^Ю8!-метилировании в них обеих цепей 5'-g(m5C)GCGc-3'/3'-cGCG(m5C)g-5' (см. рис. 4, дорожка 2 для BspFNI - замены G(C=>N) GC(G=>N)C). В то же время M.BstC8I, перекрывая все возможные сайты узнавания BspFNI, может ме-
тилировать их и по одной цепи 5'-CG(m5C)Gngc-3' (см. рис. 4, дорожка 3 - замены G(C=>N)NN(G=>N) C). Последняя модель соответствовала эксперименту с BspFNI (см. рис. 2, дорожка 2), из чего следует, что оба метилирования блокировали активность BspFNI. Таким же методом определили, что BstMWI (узнает 5'-GCNNNNNNNGC-3') не расщепляла сай-
Рис. 4. Расчетный электрофорез ДНК фагов X (а) и Т7 (б) фраг-
ментированных рестриктазами при блокировании их сайтов узнавания в результате М^Ю81-метилирования в них разных цитозинов.
Дорожка 1 - исходные последовательности ДНК; дорожка 2 для BspFNI (узнает 5'-СОАСО-3') - замены 0(С=Ж)0С(0=Ж)С в ДНК и дорожка 3 - замены G(C=>N)NN(G=>N)C; дорожка 2 для BstMWI ^'^NNNN^N^^3') - замены G(C=>N)NNGCNNNGC +GCNNNGCNN(G=>N)C и дорожка 3 - замены G(C=>N)NN(G=>N) ^ дорожка 2 для BstV1I (5'-GCAGC(8/12)-3') - замены GCNN(G=>N) CAGC + GCTG(C=>N)NNGC и дорожка 3 - замены GCAG(C=>N)NNGC + GCNN(G=>N)CTGC; дорожка 2 для М1и1 (5'-AACGCGT-3') - замены GCAC(G=>N)(C=>N)GTGC и дорожка 3 - замены G(C=>N)NN(G=>N) C; дорожка 2 для Bsp1720I (5'-GCATNAGC-3') - замены GCNN(G=>N) CTNAG(C=>N)NNGC и дорожка 3 - замены G(C=>N)NN(G=>N)C.
ты, в которых по одной цепи метилирован внутренний цитозин 5'-G(m5C)NNgcNNNGC-3' (см. рис. 4, дорожка 2 для BstMWI) и частично расщепляла сайты, в которых метилирован внешний цитозин 5'-GCNNNNNNNG(m5C)nngc-3' (см. рис. 4, дорожка 3 для BstMWI). Частичность расщепления видна в эксперименте по уменьшенной интенсивности дополнительного верхнего фрагмента (см. рис. 2, дорожка 2 для BstMWI). BstVlI (узнает 5'-GCTGC-3') расщепляла метилированные сайты 5'-GCTG(m5C)nngc-3' (см. рис. 4, дорожка 2 для BstVlI) и 5'-GCAG(m5C) nngc-3 (см. рис. 4, дорожка 3 для BstVlI). MluI не расщепляла сайт 5'g(m5C)ACG(m5C)GTgc-3' (см. рис. 4, дорожка 2 для MluI), метилированный по обеим цепям, и частично расщепляла сайты 5'-ACG(m5C) GTgc-3 (см. рис. 4, дорожка 3 для MluI), метилированные по одной цепи. В ДНК фага T7 (см. рис. 3) Bsp1720I (узнает 5'-GCTNAGC-3') расщепляла сайт 5'-g(m5c)nnGCTNAG(m5C)nngc-3' (см. рис. 4, дорожка 2 для Bsp1720I), метилированный по обеим цепям, а также расщепляла сайты 5'-GCTNAG(m5C)nngc-3' (см. рис. 4, дорожка 3 для Bsp1720I), метилированные по одной цепи.
Полученные результаты по чувствительности ре-стриктаз к M.BstC8I-метилированию ДНК суммированы в табл. 2. Новые данные получены для рестриктаз-прототипов ApaI, FauI и MluI, и подтверждены данные REBASE для BpulOI, BstXI [10], HindIII [11], NruI, PvuII [12] и SphI. Также подтверждены данные для
прототипа AluI и его изошизомера AluBI, ранее полученные на синтетических олигонуклеотидах [5]. AluI и AluBI отличаются по чувствительности к метилированию. Подобные существенные различия в свойствах могут встречаться и у других изошизомеров, что делает изучение их чувствительности к метилированию достаточно актуальным. В данной работе получены новые данные для 29 известных изоширомеров. M.BstC8I метилировала сайты узнавания большинства рестриктаз по одной цепи из-за частичного перекрывания этих сайтов. Данные о чувствительности рестрик-таз к такому виду метилирования вполне могут быть использованы при изучении метилирования ДНК.
Сведения об авторе
Дедков Владимир Сергеевич - ст. науч. сотр., канд. биол. наук. Научно-производственное объединение "СибЭнзим", отдел микробиологии, e-mail:dedkov@ sibenzyme.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дедков В. С. // Молекул. генетика. - 2009. - № 3. - С. 3-8.
2. Дедков В. С. // Биотехнология. - 2009. - № 4. - С. 30-39.
3. Дедков В. С. // Биотехнология. - 2010. - № 2. - С. 36-40.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. - М., 1984.
5. Чернухин В. А., Болтенгаген А. А., Тарасова Г. В. и др. // Вестн. биотехнол. и физико-хим. биол. - 2007. - Т. 3, № 1. - С. 21-27.
6. Arber W, DussoixD. // J. Mol. Biol. - 1962. - Vol. 5. - P. 18-36.
7. AzeddougH, Reysset G. // FEMS Microbiol. Lett. - 1991. - Vol. 78.
- P. 153-156.
8. Godson G. N., SinsheimerR. L. // Biochim. Biophys. Acta. - 1967. -Vol. 142. - P. 476-488.
9. Gunthert U, StormK, BaldR. // Eur. J. Biochem. - 1978. - Vol. 90.
- P. 581-583.
10. NelsonM., Christ C, SchildkrautI. // Nuct. Acids Res. - 1984. - Vol. 12. - P. 5165-5173.
11. Nelson P. S., Papas T. S., Schweinfest C. W. // Nucl. Acids Res. -1993. - Vol. 21. - P. 681-686.
12. Rice M. R, Calvin-Koons M. D, Blumenthal R. M. // FASEB J. -1995. - Vol. 9. - P. A1400.
13. RiceM. R, BlumenthalR. M. // Nucl. Acids Res. - 2000. - Vol. 28.
- P. 3143-3150.
14. RobertsR. J., BelfortM., Bestor T. et al. // Nucl. Acids Res. - 2003.
- Vol. 31. - P. 1805-1812.
15. S-Adenosylmethionine-Dependent Methyltransferases: Structures and Functions / Eds X. Cheng, R. M. Blumenthal et al. - Singapore, 1999.
16. Tao T., Walter J., Brennan K. J. et al. // Nucl. Acids Res. - 1989. -Vol. 17. - P. 4161-4175.
Поступила 08.02.11
A NEW DNA METHYLTRANSFERASE M.BsC8I
FORMS 5'-G(M5C)NNGC-3'. STUDYING OF RESTRICTION ENDONUCLEASE SENSITIVITY TO M.Bs^I-METHYLATION
tf S. Dedkov
SibEnzyme, Ltd., Novosibirsk, Russia
Bacillus stearothermophilus C8 was grown up on the Luria agar at 37°C. A new DNA-methylase was determined in cellular lysate. The methylation of the DNAs of bacteriophages X and T7 in the region of 5'-G(m5C)NNGC-3' blocked the activity of Bs«8I. Specificity of M.BstС8I was analyzed on methylated X DNA. For this purpose, we used computer modeling and the data on the sensitivity of restrictases BstC8I, BsuRI, AjnI, and PvuII to methylation. The sensitivity of some restrictases to new methylation was studied. The results may be used for DNA methylation studying.
Key words: analysis of specificity, computer modeling, DNA-methyltransferase, methylation sensitivity
