CC BY
22Тематический номер «Ветеринария» www.agroyug.ru
В.П. Терлецкий, доктор биологических наук,
Государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Ленинградской области «Ленинградский государственный университет им. А.С. Пушкина», (ГАОУ ВО ЛО ЛГУ им. А.С. Пушкина), Санкт-Петербург,
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных
животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»,
(ВНИИГРЖ), Россия, Санкт-Петербург;
О.Б. Новикова, кандидат ветеринарных наук,
ВНИВИП - филиал ФНЦ ВНИТИП РАН, Санкт-Петербург-Ломоносов;
В.И. Тыщенко, кандидат биологических наук,
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста», (ВНИИГРЖ), Россия, Санкт-Петербург
ГЕНОТИПИРОБАНИЕ КАК МЕТОД В ПРЕВЕНТИВНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ
Актуальность исследований по разработке и использованию высокоэффективного метода генотипирования штаммов микроорганизмов-патогенов сельскохозяйственной птицы заключается в необходимости быстро находить пути распространения, а также выявлять источники инфекции [1]. Циркулирование возбудителей во внешней среде приводят к периодическим вспышкам заболеваний. Проблема отягощается тем фактом, что на птицефабриках птица находится в условиях, благоприятствующих передаче микроорганизмов между особями (скученность содержания, запыленность помещений и т.д.). Кроме того, биологические особенности домашних кур современных промышленных кроссов предрасполагают к более тяжелому течению многих инфекционных заболеваний и существенному отходу птицы на птицефабриках и снижению рентабельности отрасли в целом. Бактериальные болезни занимают существенное место в патологии птиц. Их следует рассматривать не только как проблему ветеринарную, но и как медико-экологическую, так как птицы могут быть носителями в кишечнике патогенных для людей микроорганизмов, основными из которых являются сальмонеллы, кампилобактерии, шигеллы, клостри-дии и другие.
Анаэробная энтеротоксемия, вызываемая Грам-положительной бактерией С. рerfringence у птиц в настоящее время является экономической проблемой особой важности, особенно в связи с повсеместной тенденцией к отказу от использования в промышленном птицеводстве стимули рующих рост антибиотиков и противококцидийных препаратов, дававших возможность некоторого контроля клостридиозов [2]. Ис-пол ьзова ние современ ных методов геноти пирован ия позволяет ответить на вопросы эпизоотологического плана, в частности, каким путем происходит передача возбудителя и где находится источник инфекции [3; 5]. Эти сведения необходимы для предотвращения новых вспышек заболевания. Генотипирование используется также при определении эффективности вакцинопро-филактики при использовании живых вакцин (сравниваются генотипы выделенных изолятов бактерий у птицы с клиническими признаками заболевания с генотипом вакцинного штамма).
Генотипирование изолятов С. рег1гтдепсе позволит выяснять пути распространения и идентифицировать источники этой инфекции, что, несомненно облегчит планирование профилактических мероприятий, направленных на недопущение возникновения новых очагов инфекции. Полное совпадение всех фрагментов ДНК (генетический профиль, «штрих-код») у сравниваемых бактериальных изолятов при генотипиро-вании подтверждает передачу инфекции от одного
объекта (особи) другому объекту (особи). Случайное совпадение всех фрагментов ДНК маловероятно, так как эпизоотологически неродственные изоляты практически всегда имеют существенные генетические различия, выявляемые по числу и распределению фрагментов ДНК.
К числу современных и широко используемых методов генотипирования относятся секвенирование по отдельным локусам (MLST - multilocus sequence typing) и метод учета количества тандемных повторов в геноме (VNTr - variable number tandem repeats, [7]). К сожалению, использование секвенирования все-еще остается сложной задачей для ветеринарных лабораторий, так как требуется дорогостоящее оборудование и расходные материалы, кроме того, секвенирование часто не дает должного разрешения при генотипировании микроорганизмов [б], второй способ основывается на амплификации большого числа повторяющихся элементов, что также технически сложно. Часто используют метод генотипирования, основанный на разделении больших фрагментов ДНК (пульс-гель электрофорез). Этот способ дает хорошее разрешение, но необходимо использование специализированного оборудования, кроме того, этот анализ требует нескольких дней [7].
Ранее нами был предложен и апробирован на ряде видов патогенов метод генотипирования, основанный на идее двойного расщепления и избирательного мечения фрагментов ДНК патогена - ДРИМ [4; 8]. Идея ДРИМ базируется на предположении, что возможно проведение расщепления геномной ДНК двумя ферментами рестрикции с одновременным мечением части фрагментов биотинилированным дезоксици-тозинтрифосфатом (Bio-dCTP). Избирательность достигается способностью фермента Taq-полимераза, традиционно используемой в полимеразной цепной реакции, проводить достройку усеченных 3-штрих концов рестрикционных фрагментов ДНК.
Цель работы заключалась в подборе условий для проведения генотипирования бактериальных изолятов C. perfringence и использовании этого метода для идентификации полевых изолятов этого патогенна.
Материалы и методы. Культура C. perfringence была выращена из птиц (гуси, индейки, перепелки и куры) трех регионов РФ. Было выращено и использовано в работе по генотипированию 7 изолятов. Поиск ферментов рестрикции проведится с использованием программы «in-silico», позволяющей предсказать число и размер фрагментов ДНК после реакции двойного расщепления. После подбора пар-кандидатов, дальнейший отбор будет основании дополнительных критериев, необходимых для успешного применения ферментов в реакции ДРИМ: совместимость в одном
ЭФФЕКТИВНОЕ №2 март
животноводство 2018
буфере, отсутствие «звездной» активности, высокая специфичность, низкая цена и коммерческая доступность. После всех этих этапов отбора ферменты были проверены на ДНК C. рег1гтдепсе и предложена оптимальная комбинация для использования при генотипировании полевых изолятов данного патогена.
В качестве первого фермента, дающего З'-усечен-ные концы, которые могут быть помечены биоти-ном с помощью фермента Taq-полимераза, использовали фермент SalI (G^TCGAC), имеющий 11 сайтов расщепления в геноме C. perfringence. Специфика расщепления требует внесения в реакцию дТТФ до конечной концентрации 2 мМ. Следующим нуклео-тидом достройки будет биотинилированная метка Bio-дЦТф. Фермент рестрикции SalI хорошо совместим с различными буферами, что позволяет использовать его в комбинации с другими ферментами, дающими тупые концы и позволяющими уменьшить размер фрагментов ДНК до приемлемой величины для разделения в агарозном геле. Эти фрагменты не метятся в реакции ДРИМ. Теоретически число фрагментов ДНК составит 22 (11х2).
В качестве второго фермента рестрикции в реакции ДРИМ при генотипировании изолятов C. perfringence были испытаны BsuRI (GG^CC, 1139 сайтов), Mph1103I (ATGCA^T, 782 сайта), HincII (GTY^RAC, 1005 сайтов). Эти же ферменты планируется использовать при работе с другими видами бактерий с целью выяснить возможности унификации практического протокола генотипирования. Анализ условий работы всех этих ферментов в комбинациях друг с другом позволил прийти к заключению, что, вероятно, оптимальной парой для совместной работы в реакции ДРИМ будут ферменты SalI и BsuRI при генотипировании C. perfringence. Оба фермента доступны из одного источника (Thermo Scientific/Fermentas), хорошо совместимы в одном буфере этой же фирмы - буфер О, высокоспецифичные и не дороги.
Использование генотипирования методом ДРИМ предполагает в качестве первого этапа работы выделение геномной ДНК. В связи с тем, что C. perfringence является Грам-положительным микроорганизмом, он имеет прочную клеточную стенку. Опыт работы с другими Грам-положительными бактериями предполагал сложную процедуру экстракции геномной ДНК, включающую обработку специальными ферментами, использование гуанидинтиоцианата и т.д. К счастью, в отношении C. perfringence было достаточным использование обычного детергента (цодецилсульфат натрия), никаких других ферментативных процедур для разрушения клеточной стенки не потребовалось. Вкратце, методика выделения ДНК сводилась к следующим лабораторным процедурам:
1) Центрифугирование жидкой культуры при 8000 rpm 5 минут.
2) Отмывка бактериального осадка в 1 ml TES (буфер 10 мМ NaCL, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис).
3) Суспендирование бактериального осадка в 400 мкл TES.
4) Внесение в суспензию 40 мкл 10% додецилсуль-фата натрия.
5) Инкубирование 60°C 15 минут.
6) Внесение равного объема смеси фенол-хлороформ, размешивание.
7) Центрифугирование 10 минут при 12000 об/мин, отбор верхней фазы и внесение равного объема изо-пропанола, плавное перемешивание.
8) Отмывка выпавшей ДНК в 1 мл 70% этанола.
9) Растворение осадка ДНК в in 50 мкл буфера TE (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН8,0).
10) Отмывка бактериального осадка в 1 ml TES.
11) Суспендирование бактериального осадка в 400 мкл TES.
12) Внесение в суспензию 40 мкл 10% додецил-сульфата натрия.
13) Инкубирование 60°С 15 минут.
14) Внесение равного объема смеси фенол-хлороформ, размешивание в течение 5 минут.
15) Центрифугирование 10 минут при 12000 грт, отбор верхней фазы и внесение равного объема изо-пропанола, плавное перемешивание.
16) Отмывка выпавшей ДНК в 1 мл 70% этанола.
17) Растворение осадка ДНК в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН8,0).
Результаты. По результатам генотипирования был выявлены уникальные изоляты, зарегистрированные под номерами 2, 3, 4, 5, 6/10 и 7, распределение фрагментов ДНК в которых были различными, т.е. изоляты представляли собой различные штаммы. Изоляты №6 и 10 являлись идентичными. Генетически близкими были изоляты № 5 и 6/10, у которых число различающихся фрагментов ДНК составило 2-4.
Изоляты № 2 и 3 выделялись из двенадцатиперстной кишки 2-х перепелок Ленинградской области, генетически изоляты были различными, что говорит об отсутствии передачи инфекции между особями. Изоляты №4 и 5 были выделены из двенадцатиперстной кишки 2-х индеек Ленинградской области и различие также свидетельствует об отсуствии перезаражения между особями. Изоляты № 6 и 10 были получены от бройлеров в Калининградской области в одно время из птичников 67 и 20, соответственно. Идентичность генетических профилей свидетельствует о циркулировании одного штамма в пределах разных птичников, т.е. о перезаражении. В то же время изолят 7 происходил из птичника 19 и он был генетически другим. Совпадение профилей может свидетельствовать о перезаражении кур одним и тем же щтаммом возбудителя не только в пределах одной области, но и между близкими (Северо-Запад РФ) областями.
Заключение. Генотипирование является эффективным инструментом, позволяющим решать эпизоото-логические вопросы, такие как идентификация путей распространения инфекции и нахождения источника патогенна во внешней среде.
Исследование выполнено при поддержке Государственного задания ФАНО номер ГЗ АААА-А18-118021590138-1 в части генотипирования и задания ФАНО 599.01.Х3017 0599-2014-0222 в части выращивания микроорганизма.
Литература:
к -
1. Добрина М. Н. Нужен постоянный контроль сальмонеллёза // Животноводство России.-2011.-№3.-С.11-13.
2. Новикова О.Б. Clostridium perfringence - эпидемиологически опасный микроорганизм, выделяемый от птиц // Птица и птицепродукты. -2015.-№ 6.-С.37-38.
3. Тапальский Д.В. Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипиче-ское и молекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2005.-№6.-С.88-93.
4. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Борисенкова А.Н., Белаш Д.Э., Яковлев А.Ф. Эффективный молекулярно-генетический метод идентификации штаммов сальмонелл и протея // Доклады РАСХН.-2013.-№5.-С.60-63.
5. Afshari A., Jamshidi A., Razmyar J., Rad M. Genotyping of Clostridium perfringens isolated from broiler meat in northeastern of Iran // Vet. Res. Forum.-2015.-Vol.6.- No4.- P.279-284.
6. Fakhr M.K., Nolan L.K., Logue C.M. Multilocus sequence typing lacks the discriminatory ability of pulsedfield gel electrophoresis for typing Salmonella enterica serovar Typhimurium // Journal of Clinical Microbiology.-2005.-Vol.43.-No.5.-P.2215-2219.
7. Ross T.L., Merz W.G., Farkosh M., Caroll K.C. Comparison of an automated repetitive sequence-based PCR microbial typing system to pulsed-field gel electrophoresis for analysis of outbreaks of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // J. Clin. Microbiol.-2005.-V.43.-P.5642-5647.
8. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., Niemann H. (2003) Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF) // Microbiol. Res.-Vol .158.-No.2.-P.135-142.
