CC BY
12КЛИНИЧЕСКАЯ МИКОЛОГИЯ
УДК 632.938: 617.713-002.828: 616.15: 616-089.819.843
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
ОСОБЕННОСТИ
ИНВАЗИВНОГО
АСПЕРГИЛЛЕЗА У
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ
ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ
ТРАНСПЛАНТАЦИИ
АЛЛОГЕННЫХ
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ
СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Фролова Е.В. (зав. лаб.)*, 2Шадривова О.В. (аспирант), Филиппова Л.В. (н.с.), ^чеваткина А.Е. (ст.н.с.), 3Волкова А.Г. (пульмонолог), 3Попова М.О. (гематолог), 3Зубаровская Л.С. (зав.отд.), 43юзгин И.С. (зав. отд.), 4Ружинская О.С. (врач-гематолог), Ъорзова Ю.В. (зав. клиникой), 2Хостелиди С.Н. (ассистент кафедры), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор), 2Климко H.H. (зав. кафедрой), 3Афанасьев Б.В. (директор)
ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова: 'НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и 2кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии; 3Институт детской гематологии и трансплантологии имени P.M. Горбачёвой ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова; Ленинградская областная клиническая больница, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2012
Инвазивный аспергиллез - тяжелая оппортунистическая инфекция, возникающая преимущественно у иммунокомпроме-тированных больных и характеризующаяся высокой летальностью. Нами изучены иммунологические особенности у 16 гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Установлено, что у данной группы пациентов инвазивный аспергиллез развился на фоне выраженного нарушения основных звеньев иммунной защиты.
Ключевые слова: аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), антифунгальная терапия, ге-мобластоз, иммунный ответ, инвазивный аспергиллез
Контактное лицо: Фролова Екатерина Васильевна Тел.: (812) 303-51-40
IMMUNOLOGICAL FEATURES OF INVASIVE ASPERGILLOSIS IN HEMATOLOGICAL PATIENTS AFTER HEMOPOIETIC STEM CELLS TRANSPLANTATION
Frolova E.V. (head of the laboratory)1, Shadrivova O.V. (postgraduate student)2, Filippova L.V. (scientific collaborator)1, Uchevatkina A.EJ(senior scientific collaborator), Volkova
A.G. (pulmonologist)3, Popova M.O. (hematologist)3, Zubarovskaya L.S.3(head of the department), Zjuzgin I.S. (head
of the department)4, Ruzhinskaya O.S. (hematologist)4, BorzovaY.V. (head of the clinic)1, Khostelidi S.N. (assistant lecturer of the chair)2, Bogomolova T.S. (head of the laboratory)1, Vasilyeva N.V. (director)1, Klimko N.N. (head of the chair)2, Afanasyev
B.V. (director)3
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov^Kashkin Research Institute of Medical Mycology and 2Chair of Clinical Mycology, Allergology and Immunology; 3Raisa Gorbacheva Memorial Institute of Children Hematology and Transplantation I.P.Pavlov State Medical University; Leningrad Regional Clinical Hospital, Saint-Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2012
The invasive aspergillosis is severe opportunistic infection which occurs mainly in immunocompromised patients and is characterized with high mortality. We studied the immunological features at the 16 hematological patients with invasive aspergillosis after hematopoietic stem cells transplantation. Invasive aspergillosis has been developed in these patients among pronounced changes of the major parts of the immune defense.
Key words: allo-HSCT, antifungal therapy, immune response, invasive aspergillosis, hematological malignancies
ВВЕДЕНИЕ
Инвазивный аспергиллез (ИА) является одной из основных причин летальности у пациентов со злокачественными новообразованиями системы крови. Летальность при различных клинических вариантах ИА варьирует от 36 до 90% [1]. Среди больных ИА в Санкт-Петербурге пациенты с гемобластозами составляют 86-90% [2]. Увеличение частоты развития ИА у гематологических больных в последние годы связано как с совершенствованием методов диагностики, так и с применением новых высокотехнологичных методов лечения, в том числе - аллогенной
■
трансплантации гемопоатических стволовых клеток. У этих пациентов ИА возникает в 5-26% случаев [3]. Частота ИА у реципиентов алло-ТГСК от НЬА-идентичного донора составляет 5-8%; от неродственного донора - 10-25%, при аутологичной ТГСК -0,5-2% [4].
Известно, что у гематологических больных развитию ИА предшествуют иммунодефицитные состояния, возникновению которых способствует цитоста-тическая или иммуносупрессивная терапия. К ним относят дефекты фагоцитарной функции макрофагов, стероид-индуцированное подавление киллерной активности макрофагов и нейтропению, вызванную высокодозной цитостатической химиотерапией [5]. Кроме того, риск развития ИА у реципиентов ТГСК связан с типом донора, наличием реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и, в меньшей степени, - с нейтропенией [6]. Клинические формы ИА, тяжесть течения заболевания и эффективность антимикотической терапии зависят не только от особенностей течения фонового заболевания, но и от состояния иммунной системы больного, врожденной или приобретенной резистентности против микотической инфекции [7].
Оценка основных иммунологических изменений у больных ИА после алло-ТГСК может в дальнейшем иметь диагностическое и прогностическое значение, помочь в разработке новых стратегий лечения [8]. Вместе с тем, иммунологические особенности ИА у гематологических пациентов после алло-ТГСК изучены недостаточно.
Цель исследования - оценить иммунологические особенности ИА у гематологических больных после алло-ТГСК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включили 16 гематологических пациентов (медиана возраста - 28 лет) - 10 мужчин и 6 женщин, у которых ИА развился после алло-ТГСК. В период, предшествующий возникновению ИА, у 94% больных более 10-ти дней отмечали нейтропению, у 62% - лимфоцитопению. На момент постановки диагноза ИА у 43% пациентов была зафиксирована сопутствующая бактериальная инфекция и у 18% - цитомегаловирусная инфекция. Из клинических проявлений у большинства больных (87%) отмечали лихорадку, рефрактерную к антибиотикам широкого спектра действия. Кровохарканье наблюдали в 18% случаев. Все пациенты получали иммуносупрессив-ную терапию (такролимус, циклофосфан, метотрек-сат, препараты микофеноловой кислоты) для профилактики или лечения РТПХ.
Всем больным выполняли фибробронхоскопию (ФБС) с взятием бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Лабораторная диагностика ИА включала микроскопическое и культуральное исследования. Образцы биосубстратов (мокрота, БАЛ) вносили в просветляющую жидкость (10% раствор КОН в 10% водном растворе глицерина) с добавлением флуоресциру-
ющего маркера (калькофлуор белый). Окрашенный препарат просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечали наличие септированных нитей мицелия, ветвящихся под углом -45°. Для определения галактоманнана в сыворотке крови и БАЛ использовали двойной иммуноферментый метод (EIA), зарегистрированный в Европе, «Platelia Aspergillus». Наличие галактоманнана оценивали спектрофото-метрически путем сравнения оптической плотности исследуемого материала и контрольного образца, содержащего 1 нг/мл галактомананна. Диагностически значимым считали индекс выше «0,5» в сыворотке крови и выше «1,0» — в БАЛ.
Проводили компьютерную томографию легких в режиме высокого разрешения, магнитно-резонансную томографию.
Для постановки диагноза ИА использовали клинические и лабораторные критерии, предлагаемые Европейской организацией по исследованию и лечению рака (EORTC/MSG, 2005 [9], 2008 [10]).
Иммунологическое исследование выполняли гематологическим пациентам алло-ТГСК через 2-4 недели от постановки диагноза ИА (медиана дней - 24). Период времени после алло-ТГСК до момента обследования составлял от 27 до 300 дней (медиана дней - 105). Группа сравнения состояла из 20 практически здоровых людей (медиана возраста - 29 лет). Состояние иммунореактивности оценивали по показателям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также факторов врожденной резистентности организма. Абсолютной лимфоцитопенией считали снижение абсолютного количества лимфоцитов крови менее 1,()-1()'7л, значимой нейтропенией - снижение абсолютного количества нейтрофилов крови < 0,5-109/л.
Субпопуляционный состав лимфоцитов определяли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител «DAKO». Кис-лороДзависимую бактерицидность нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте, фагоцитарную и киллерную активности - с использованием референтного штамма Candida albicans. Продукцию интерферона-у (ИФН-у) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) определяли в супернатантах клеток крови после 24-часовой индукции ФГА с применением коммерческих иммунофер-ментных тест-систем («Цитокин», «Вектор-Бест»). Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови оценивали нефелометрическим методом на анализаторе белков «Turbox plus». Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 6.0) с использованием непараметрической статистики - критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У всех включенных в исследование пациентов диагностировали «вероятный» ИА на основании
К Л И Н И ЧЕС К АЯ М И КОДОГИЯ
критериев ЕОЮГС/МБб, 2008.
При анализе фоновых заболеваний выявили, что острым лейкозом страдало более половины обследованных лиц (63%), среди них преобладали больные острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) - 38%. Пациенты с острым лимфобластным лейкозом составили 25%, Хронический лейкоз, включая хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) и хронический лимфо-лейкоз (ХЛЛ), диагностировали в 19% случаев. Несколько реже среди фоновых заболеваний наблюдали лимфому (12%) и миелодиспластический синдром (6%) (Рис. 1).
38%
Таблица 1.
Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов
13%
25%
56%
о Алпо-ТГСК/неродств ■ Алпо-ТГСК/родств
о Гапло-ТГСК
Рис. 2. Вид аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса исследуемой группы больных и лиц контрольной группы представлена в таблицах 1 и 2.
□ ОМЛ иОЛЛ сХМЛ оХЛЛ оМДС ш Лимфома Ходжкина и Неходжкмнская лимфома
Рис. 1. Фоновые заболевания гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Всем обследованным проводили алло-ТГСК: неродственную (алло-ТГСК/неродств) - в 56%, случаев, родственную (алло-ТГСК/родств) - в 31% и, реже, гаплоидентичную трансплантацию (гапло-ТГСК) - в 13% (Рис.2).
Несмотря на то, что всем реципиентам ТГСК проводили иммуносупрессивную терапию, реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ) наблюдали у большинства больных (94%).
Все пациенты получали антимикогическую терапию. Общая выживаемость в течение 3-х месяцев составила 81%, в течение 6-ти месяцев - 62%.
13%
Показатели Пациенты после алло-ТГСК (п=16) Контрольная группа (п=20) Р*
Медиана (25%-75%) Медиана (25%-75%)
Возраст(лет) 28 (16,0-43,0) 29 (24,0-34,0) 0,485
Лейкоциты (х107л) 4,70 (4,10-6,30) 5,90 (5,25-6,45) 0,130
Лимфоциты (%) 24,5 (7,2-40,5) 38,0 (34,5 -40,0) 0,074
Лимфоциты абс. (х107л) 1,44 (0,34-2,42) 2,16 (2,02-2,29) 0,056
Нейтрофилы (%) 65,54 (0,0-87,3) 51,0 (46,0-53,5) 0,435
Нейтрофилы абс. (х107л) 2,20 (1,88-3,80) 3,06 (2,70-3,37) 0,317
С03+(%) 78,0 (59,0-86,0) 67,5 (64,5-69,5) 0,374
С03+абс.(х107л) 1,167 (0,437^2,028) 1,443 (1,323-1,611) 0,098
СР4+(%) 27,0 (23,0-31,0) 41,0 (39,0-42,5) 0,003
С04+абс.(х107л) 0,464 (0,246-0,552) 0,868 (0,735-0,956) 0,000
С08+(%) 49,0 (33,0ч-59,0) 28,0 (26,0—29,0) 0,000
С08+абс.(х107л) 0,833 (0,300-1,562) 0,588 (0,532-0,629) 0,591
С020 (%) 10,0 (2,0-21,0) 15,0 (14,5-17,0) 0,049
СВ20+абс. (х107л) 0,163 (0,025-0,287) 0,325 (0,287—0,357) 0,005
С025+(%) 9,5 (8,0-И 1,0) 13,0 (12,0-14,0) 0,002
С025+абс.(х107л) 0,161 (0,132-0,260) 0,276 (0,237—0,314) 0,020
С016+(%) 10,0 (9,0ч-14,0) 11,0 (10,0—12,0) 0,950
С016+абс.(х107л) 0,15 (0,091-0,298) 0,220 (0,206-0,257) 0,215
ИРИ .:С04''С[)8 ) 0,50 (0,30-1,10) 1,49 (1,36—1,67) 0,000
Примечание. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25%н-75%), *-досто-верность различий с контрольной группой (р<0,05)
Количество лейкоцитов и нейтрофилов у гематологических больных на ранней стадии развития ИА не отличалось от показателей в контрольной группе, однако обнаружили снижение относительного и абсолютного числа лимфоцитов у 38% и 44% пациентов соответственно. Изменение способности предшественников лимфоцитов к дифференцировке в различные субпопуляции привело к достоверному снижению относительного и абсолютного числа Т-хелперов (СБ4+) и повышению относительного числа цитотоксических 'Г-лимфоцитов (СОК ) у больных ИА по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 1). Это подтверждено достоверными различиями в значениях иммунорегуляторных индексов между двумя группами. Также наблюдали снижение количества лимфоцитов с активационны-ми маркерами - рецепторами к ИА-2 (СБ25+) у больных ИА.
При анализе гуморального иммунного ответа выявили достоверное снижение количества
В-лимфоцитов (СБ20+) (табл.1) и уровней иммуноглобулинов всех исследованных классов (табл.2). Снижение содержания и установлено у 63%, - у 38% больных ИА.
Таблица 2.
Показатели функциональной активности нейтрофилов и лимфоцитов
Показатели Пациенты после алло-ТГСК (п=16) Контрольная группа (п=20) Р*
Медиана (25%-75%) Медиана (25%-75%)
НСТ сп. (%) 32,00 (18,00-69,00) 22,50 (20,00-29,50) 0,245
НСТ акт С%) 63,00 (45,00-77,00) 56,50 (51,00-60,50) 0,926
ФИ (%) 75,00 (70,00-83,00) 68,50 (66,00-73,50) 0,150
КК(%) 13,00 (10,00-19,00) 25,00 (23,50-28,50) 0,001
1дА (г/л) 0,46 (0,32-1,06) 1,78 (1,78-1,84) 0,001
1дМ (г/л) 0,64 (0,29-0,99) 1,16 (1,06-1,17) 0,000
1дй (г/л) 5,74 (3,68-12,38) 13,50 (12,95-14,83) 0,000
ИФН-у инд. (пг/л) 509,5 (66,5-1160,0) 749,0 (544,0-1258,0) 0,126
ИЛ-10 (пг/л) 23,0 (0,0-79,0) 333,0 (302,0-411,0) 0,000
Примечание. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25%н-75%),
*-достоверность различий с контрольной группой (р<0,05)
При оценке функциональной активности лимфо-идного звена иммунной системы у больных ИА не было достоверных различий в способности клеток крови к продукции ИФН-у, по сравнению с показателями в контрольной группе, но отмечали достоверное снижение выработки ИЛ-10.
При изучении функционального состояния ней-трофильного звена системы фагоцитирующих клеток показано достоверное снижение киллерной активности нейтрофилов при усилении продукции кислородзависимых микробоцидных радикалов у 54% больных ИА.
ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что врожденные и адаптивные иммунные механизмы необходимы для защиты организма от инфекции, и оптимальный иммунный ответ определяется балансом между эффекторными и регуляторными звеньями иммунной системы [11]. Т-хелперы 1-го типа продуцируют ИФН-у, стимулирующий антифунгальную активность фагоцитов, а Т-регуляторные клетки (Трег) вырабатывают ИЛ-10, который является мощным иммуносупрессив-ным цитокином, снижающим фагоцитоз, секрецию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-а (ФНО-а), ИЛ-1(3, ИЛ-6, ИЛ-12, и защитную функцию клеточно-опосредованного им-
мунитета. Однако считают, что в процессе развития иммунного ответа на внедрение инфекционных патогенов и в процессе развития РТПХ, повышение активности Трег клеток способствует разрешению воспалительного ответа, предотвращая чрезмерную активацию клеточного иммунного ответа, то есть возникает состояние толерантности [12]. Установлено, что у больных после алло-ТГСК участие в иммунном ответе на трансплантационные антигены и, как следствие, в отторжении трансплантата, принимают как эффекторные Т-лимфоциты, так и клетки врожденной иммунной системы [13]. Следовательно, необходимо было изучить особенности состояния всех звеньев иммунной системы у гематологических больных ИА после алло-ТГСК.
Впервые в отечественной литературе мы представляем результаты исследования иммунологических особенностей ИА у гематологических больных после алло-ТГСК. Нами выявлены иммунологические признаки развития РТПХ, которую, по клиническим данным, установили у 94% больных, включенных в исследование. Эти признаки сопровождались усилением дифференцировки Т-лимфоцитов в цитотоксическую субпопуляцию у 91% пациентов. При этом уровни продукции ИФН-у колебались в широком диапазоне на фоне низкой выработки ИЛ-10 у 90% больных, что отражает низкую активность Т-регулирующих лимфоцитов. Таким образом, снижение числа СВ4+ лимфоцитов, возможно, происходит именно за счет уменьшения числа Т- регулирующих клеток, которые, наряду с Т-хелперами 1-го типа, несут этот поверхностный маркер. Также установлены признаки эндогенного раздражения нейтрофилов - повышение продукции кислородзависимых микробоцидных радикалов при снижении их киллерной активности. Вероятно, это происходит за счет истощения кислороднезависимых факторов микробоцидности. Выявили снижение показателей гуморального иммунного ответа - снижение синтеза иммуноглобулинов классов А, М и С. Это согласуется с данными, полученными при моделировании экспериментальных грибковых инфекций. Показано, что защитные механизмы иммунного ответа приводятся в действие посредством тонкого равновесия между различными эффекторными клетками, обеспечивающими противогрибковую резистентность, и клетками, ограничивающими последствия, связанные с чрезмерной воспалительной реакцией. Низкий уровень РТПХ коррелировал с резистентностью макроорганизма к инфекции, что было обусловлено восстановлением уровня Т-лимфоцитов и повышением продукции ИЛ-10, вырабатываемого Трег после аллогенной трансплантации ГСК [14]. В работах, посвященных клиническим исследованиям, авторами показано, что для пациентов с ИА после алло-ТГСК, не имеющих нейтропении, характерна ассоциация хронического воспаления с персистиру-ющей инфекцией [15].
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКОЛОГИЯ
ВЫВОДЫ
1. И А развивается у гематологических пациентов после алло-ТГСК на фоне выраженного нарушения основных механизмов иммунного ответа.
2. Установили достоверное снижение относительного и абсолютного числа Т-хелперов ((!]>!• ) и выраженное усиление дифференцировки Т-лимфоцитов в цитотоксическую субпопуляцию (( Т)К) на фоне низкой продукции ИЛ-10.
3. Наблюдали снижение количества лимфоцитов с активационными маркерами - рецепторами к ИЛ-2 (СБ25+) у больных ИА.
4. Обнаружили изменения показателей гуморального иммунного ответа - снижение числа В-лимфоцитов и уровней lgG, и
5. Выявили снижение функциональной активности нейтрофилов - угнетение их киллерной способности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lopes da Silva R., Ribeiro P., Abreu N., et al. Early diagnosis of invasive aspergillosis in neutropenic patients. Comparison between serum galactomannan and polymerase chain reaction // Clin. Med. Insights: Oncology. - 2010. - №4. - P. 81-88.
2. Климко H.H., Хостелиди C.H., Борзова Ю.В. Внутрибольничный инвазивный аспергиллез у онкогематологических больных // Клиническая онкогематология. - 2011. - Т.4, №3. - С. 228-234.
3. Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. - М., 2008. - 204 с.
4. Cordonnier С., Ribaud P., Herbrecht R. Prognostic factors for death due to invasive aspergillosis after hematopoietic stem cell transplantation: A 1-year retrospective study of consecutive patients at French transplantation centers // Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42. - P. 955.
5. Hebart H., Bollinger C., Fisch P., et al. Analysis of T-cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematologic malignancies // Blood. - 2002. - Vol. 100, №13. - P. 4521-4528.
6. Marr K.A., Carter R.A., Boeckh M., et al. Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients: changes in epidemiology and risk factors // Blood. - 2002. - Vol. 100, №13. - P. 4358-4366.
7. RomaniL. Dendritic cells in Aspergillus infection and allergy // Aspergillus fumigatus and aspergillosis - Washington DC: ASM Press, 2009.
8. Baddley J.W., Andes D.R., Marr K.A., et al. Factors associated with mortality in transplant patients with invasive aspergillosis // Clin. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 50, №12. - P.1559-1567.
9. Блинов Н.П. Некоторые дефиниции, или определения в медицинской микологии// Проблемы медицинской микологии. - 2007. - Т.9, №4. - С. 12-18.
10. De Pauw В., Walsh T.J., Donnelly J.P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46, №12. - P. 1813-21.
11. Carvalho A., Cunha C., Bozza S., et al. Immunity and tolerance to fungi in hematopoietic transplantation: principles and perspectives // Front. Immunol. - 2012. - doi: 10.3389/fimmu.2012.00156.
12. Carvalho A., Cunha C., Carotti A., et al. Polymorphisms in Toll-like receptor genes and susceptibility to infections in allogeneic stem cell transplantation // Exp. Hematol. - 2009. - Vol. 37, №9. - P. 1022-1029.
13. Larosa D.F., Rahman A.H., Turka L.A. The innate immune system in allograft rejection and tolerance // J. Immunol. -2007. -Vol. 178. - P. 7503-7509.
14. Bozza S., RomaniL. A dendritic cell vaccine against invasive aspergillosis in allogeneic hematopoietic transplantation // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 3807-3814.
15. Ortega M., Rovira M., Filella X., et al. Prospective evaluation of procalcitonin in adults with non-neutropenic fever after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // Bone Marrow Transplant. - 2006. - Vol.37. - P. 499-502.
Поступила в редакцию журнала 19.09.2012
Рецензент: А.К. Мирзабалаева
