CC BY
44
УДК 616.981.51
Н.И.Микшис, О.М.Кудрявцева, М.Ф.Болотникова, Л.В.Новикова, КХАЛопов, И.Г.Дроздов,
Т.Н.Щуковская, В.В.Фирстова, С.Н.Клюева
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ БАЦИЛЛЯРНЫХ ШТАММОВ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫЙ АНТИГЕН
СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В экспериментах на лабораторных животных изучены иммуногенные свойства бациллярных штаммов с клонированным геном ра%, детерминирующим синтез протективного антигена сибиреязвенного микроба. Проведена оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов в сравнении с коммерческим вакцинным препаратом В. атИгаш СТИ-1. Установлено, что однократная иммунизация дозой 5-107 спор тестированных бациллярных штаммов с клонированным геном ра% обеспечивает защиту морских свинок, сопоставимую с защитой, обусловленной введением той же дозы вакцины сибиреязвенной живой.
Живые сибиреязвенные вакцины, рекомендованные для иммунопрофилактики людей и сельскохозяйственных животных на территории Российской Федерации, получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов Bacillus anthracis. Молекулярные механизмы снижения вирулентности и сохранения протек-тивности аттенуированных культур стали понятны после установления плазмидной детерминации синтеза основных факторов патогенности и иммуноген-ности возбудителя сибирской язвы [4, 7]. Используемые в качестве вакцинных препаратов штаммы В. anthracis содержат в геноме репликон pXOl, кодирующий синтез экзотоксина бинарного действия, и лишены плазмиды рХ02, детерминирующей синтез капсулы. Экзотоксин возбудителя сибирской язвы состоит из протективного антигена, способного вызывать иммунную перестройку в организме восприимчивого животного и человека, а также отечного и летального факторов, образующих с протективным антигеном токсичные комплексы [3]. Живые сибиреязвенные вакцины создают длительный и напряженный иммунитет, но обладают относительно высоким уровнем реактогенности [5, 6]. Побочные эффекты связаны с воздействием на макроорганизм некоторых продуктов жизнедеятельности сибиреязвенного микроба, в первую очередь - отечного и летального токсинов. С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, синтезирующих только протективный антиген В. anthracis [1,2].
Ранее в результате генетического конструирования нами получены бациллярные штаммы с клонированным геном pag, стабильно продуцирующие биологически значимый антиген сибиреязвенного микроба. Целью настоящей работы явилось изучение иммуногенных свойств созданных рекомбинантных штаммов в сравнении с вакцинным препаратом В. anthracis СТИ-1.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использовали коммерческий препарат вакцины сибиреязвенной живой В. anthracis СТИ-1 (Киров), тест-заражающий штамм В. anthracis 2-я вакцина Ценковского (ГИСК им. Л.А.Тарасевича), штаммы с клонированным геном pag: В. anthracis СТИАТ pUBl ЮРА-1 и В. sub-tilis WB600 pUB 11ОРА-1.
Лабораторные животные. В работе использовали морских свинок весом от 300 до 350 г.
Приготовление спор рекомбинантных штаммов. Культуру исследуемых штаммов выращивали в течение 96 ч на скошенном агаре Хоттингера (pH 7,2) при 34 °С. После периода инкубации культуру смывали с поверхности агара дистиллированной водой. Биомассу, содержащую не менее 90 % жизнеспособных спор при подсчете в камере Горяе-ва, дважды отмывали дистиллированной водой, центрифугируя по 20 мин при скорости вращения 4000 об./мин. В споровую взвесь добавляли глицерин в соотношении объемов 1:2. Перед иммунизацией споры прогревали при 65 °С в течение 35 мин.
Определение иммуногенности бациллярных штаммов. Определение иммуногенности штаммов проводили согласно п. 12.7.8. регламента производства вакцины сибиреязвенной живой № 831-98 (от 25 декабря 1998 г.). Споровой взвесью каждого штамма иммунизировали по 20 морских свинок. Иммунизирующую дозу (5-107 спор) вводили однократно подкожно в объеме 0,2 мл. Контрольной группе (также 20 особей) проводили инъекции 0,2 мл физиологического раствора. Через 21 день всех иммунизированных и контрольных животных заражали подкожно, в объеме 0,2 мл, споровой взвесью тест-заражающего штамма В. атЬгаиз 2-я вакцина Ценковского. Заражение проводили 4 дозами: 110 - МО5 КОЕ - для иммунизированных и 1 • 105 — ЫО2 КОЕ - для интактных. На каждую дозу использовали по 5 морских свинок. После заражения наблюдали 10 дней и подсчитывали ЛД50 тест-штамма по формуле Кербера. Индексы иммунитета определяли как соотношение ЛД50 тест-штамма для иммунизированных животных к ЛД5о тест-штамма для интактных животных.
Определение титра антител к протективному антигену. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных определяли с помощью иммуноферментного анализа. Забор крови проводили в различные сроки из ушной вены иммунизированных морских свинок (по 3 животных на каждый штамм). В качестве антигена использовали препарат протективного антигена, выделенный и очищенный из рекомбинантного штамма. В каждый ряд 96-луночного планшета вносили по 100 мкл сывороток и титровали в 2-кратных разведениях. После стандартных этапов инкубации с
антигеном и меченными пероксидазой видоспеци-фическйми антителами (Sigma) проводили обработку субстратом ABTS (2,2 -azino-bis(3-ethilbenzthiazo-line-6-siilfonic acid)) и результаты регистрировали спектрофотометрически с помощью Multiskan Plus Version 2.01 при длине волны 405 нм.
Результаты и обсуждение
Рекомбинантные штаммы с клонированным геном pag, полученные в результате трансформационной передачи гибридной плазмиды pUBl 10РА-1 в реципиенты В. anthracis СТИАТ и В. subtilis WB600, предварительно тестировали на стабильность гетерогенного репликона in vitro и in vivo и экспрессию клонированного гена in vitro. Для иммунологического исследования отобраны клоны, стабильно наследующие приобретенную информацию и обладающие высоким уровнем секреции биологически значимого протективного антигена. Иммунологическую эффективность сконструированных штаммов сравнивали с лиофилизированным коммерческим препаратом В. anthracis СТИ-1.
Установлено, что в поствакцинальный период от специфического инфекционного процесса пало 7 (35 %) морских свинок, иммунизированных коммерческим препаратом В. anthracis СТИ-1. В группах, иммунизированных рекомбинантными штаммами, летальности лабораторных животных не отмечено. Данный факт свидетельствует о меньшей остаточной вирулентности полученных генно-инженерных штаммов в. сравнении с вакцинным препаратом В. anthracis СТИ-1.
Через 21 день после иммунизации осуществляли заражение тест-культурой В. anthracis 2-я вакцина Ценковского. Заражающий штамм вводили подкожно в возрастающих дозах, различающихся для вакцинированных и интактных морских свинок. Значение ЛД50 тест-штамма в отношении неиммунизиро-ванных животных составило 1,3-103 спор (таблица). Рекомбинатные культуры обеспечивали одинаковый уровень защиты - 3,2-107 спор тест-штамма. Коммерческий вакцинный препарат защищал морских свинок несколько эффективнее (ЛД50 тест-заража-ющей культуры - 210 спор), но, как отмечалось выше, обладал остаточной вирулентностью. Обнаруженная разница в уровнях защиты контрольного препарата и сконструированных бациллярных штаммов может быть связана с техническими особенностями подготовки спор в лабораторных условиях или с отсутствием в рекомбинантных штаммах генов из состава p'XOl, кодирующих дополнительные факторы иммуногенности, например, отечный и летальный факторы. Выяснение этих обстоятельств послужит предметом дальнейших исследований. Индексы иммунитета, представляющие собой соотношение показателей ЛД50 тест-штамма для иммунизированных и интактных животных, составили 24615 для обоих рекомбинантных штаммов. Согласно основным требованиям' к сибиреязвенным вакцинам, значение индекса иммунитета вакцинного штамма должно быть не менее 2ß000. Таким образом, однократная иммунизация дозой 5-107 спор тестированных бациллярных штаммов с клонированным геном pag обеспечивает защиту] морских свинок, адекватную защите при вак-цинаций коммерческим препаратом В. anthracis СТИ-1.!
Сравнение иммуногенности вакцинного препарата В. апШгаси СТИ-1 и рекомбинантных клонов с.гибридной плазмидой, содержащей pag ген (на модели морских свинок)
Название иммунизирующего штамма
ЛД50 тест-штамма
Индексы
иммунитета
В. anthracis СТИДТ pUBl ЮРА-1 В. subtilis WB600 pUBl ЮРА-1 В. anthracis СТИ-1 Физиологический раствор (контроль)
3,2■ 107 (1-106 — 7,9107) 24615
3,2-Ю7 (7,9-106 — 5-108) 24615
2-10* 153846
1,3 1 03 (2 1 02 - 6,3 1 0Ъ
Данный вывод подтвержден результатами им-муноферментного анализа. Нами были исследованы сыворотки от морских свинок, иммунизированных штаммом В. anthracis СТИДТ, содержащим гибридную плазмиду pUBl ЮРА-1, и коммерческим вакцинным препаратом В. anthrácis СТИ-1. Забор крови производили на 24, 28, 32-е и 36-е сутки, а также через 2; 3; 3,5 и 4 мес. после иммунизации. У животных, иммунизированных вакцинным препаратом, титр антител к протективному антигену с 24-го по 36-й день существенно не менялся и составлял, в зависимости от животного, 1:256; 1:512 и 1:4096. У морских свинок, иммунизированных рекомбинантным штаммом, отмечали динамику титра антител до 36-го дня' с максимальными значениями 1:512; 1:4096 и 1:16356. Забор крови, осуществленный в отдаленный срок, через 2 мес. после иммунизации, показал снижение титра антител, к протективному антигену до средних значений 1:1024 - для вакцинного штамма и 1:512 - для рекомбинантного. В дальнейшем титр антител к протективному антигену оставался в таком соотношении до 4 мес. наблюдения.
Таким образом, проведенные иммунологические исследования показали, что сконструированные нами бациллярные штаммы с клонированным геном pag являются перспективными для создания на их основе менее реактогенных и эффективных живых сибиреязвенных вакцин.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cohen S., Mendelson L., Altboum Z. et al. Н In-fect. Immun. - 2000. - Vol. 68. - P. 4549—4558. - 2. Ivins B., Welkos S. // Infect. Immun. - 1986. - Vol. 54. - P. 537-542. -3. Leppla ,S. // Sourcebook of bacterial protein toxins / Alouf J. and Freer J:, eds. - London: Academic Press, 1991. - P. 277-302. -5. Mikesell P., Ivins B., Ristroph J. // Infec. Immun. -1983. - Vol. 39. - P. 371-376. - 6. Stepanov A., Marinin L., Pomerantsev A. et al. II J. Biotechnol. - 1996. - Vol. 44. -, P. 155-160. -7. Turnbull P., Broster М., Carman J.etaX.II Infect. Immun. - 1986. - Vol. 52. - P. 356-363. - 8. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. // J. Gen. Microbiol. - 1986. -Vol. 132.-P. 557-559.
N.I.Mikshis, O.M.Kudryavtseva, M.F.Bolotnikova, L.V.Novikova, Yu.A.Popov, I.GrDrozdov, T.N.Shchukovskaya, V.V.Firstova; S.N.KIueva
Immunoiogic Efficiency of Genetically Constructed Bacillary
Strains Producing Bacillus anthracis Protective Antigen
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe"
Immunogenic properties of bacillary strains containing cloned pag gene that determines the synthesis of Bacillus anthracis protective antigen, were studied in the experiments with test animals. Immunologic efficacy of the recombinant strains was estimated as contrasted to the commercially available vaccine preparation of B. anthracis CT1-1. A single dose of 5-10 spores of the tested bacillary strains, containing the cloned pag gene, delivered to guinea pigs the level of protection comparable with that of an equal dose of the live anthrax vaccine.
' Поступила 09.07.05.
