CC BY
32
наш взгляд, представляется исследование роли е^ Лих-детерминант в адаптивной резистентности В. рзеис1ота1Ш к антибиотикам различных классов и формировании стабильных фенотипов множественной лекарственной устойчивости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Adewoye L., Sutherland A., Srikumar R., Poole К. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. - P. 4308^312. - 2. Bas-sam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. // Anal. Biochem. - 1991. - Vol. 196. - P. 80. - 3.Chan Y.Y., Tan T.M., Ong Y.M., Chua K.L. // Antimicrob. Agents Chemo-ther. - 2004. - Vol. 48.-P. 1128-1135.-4.Currie B.J., Fisher D.A., Anstey N.M., Jacups S.P.//Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg. - 2000. - Vol. 94. - P. 301-304. - 5. Dance D.A. // Acta Trop. - 2000. - Vol. 74. - P. 115-119. - 6. Evans K., Adewoye L., Poole K. // J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 183. - P. 807-812. -7.Fleming J.T., Yao W.H., Sayler G.S. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 3698-3706. - 8. Ho P.L., Cheung Т.К., Yam W.C., Yuen K.Y. // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 50. - P. 723-726. -9.HoldenM.T., Titball R.W., Peacock S.J. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 14240-14245. - 10. Li X. Z., Poole K., Nikaido H. // Antimicrob. Agents Chemother. -2003. - Vol. 47. - P. 27-33. - 11. Moore A., DeShazer D., Reckseidler S., Weissman A., Woods D. E. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 465-470. -
12. Niumsup P., Wuthiekanun V. // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 50. - P. 445^155. - 13. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. // Microbiol. Rev. - 1996. -Vol. 60. - P. 575-608. - 14. Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. // Acta Trop. - 2000. - Vol.74. - P. 139-144. - 15. Wigfield S.M., Rigg G.P., Kavari M., Webb A.K., Matthews R.C., Burnie J.P.//J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 49. - P. 619-624.
I.B.Zakharova, D.V.Viktorov, O.A.Merinova, L.K.Merinova, V.B.Alekseyev
Differential Expression of Drug-Efflux Genes in Polyresistant Burkholderia pseudomallei Mutants
Volgograd Anti-Plague Research Institute
The method of reverse transcription followed by PCR amplification of the transcripts was used to comparatively study the expression of various types of efflux determinants in the original B. pseudomallei strain and its mutants highly resistant to different classes of antibiotics. In contrast to the wild-type strain, B. pseudomallei mutants 56770 SMR1 and 56770 SMR2 were characterized with enhanced expression levels of amrAB and bcrA sequences coding for RND and MFS families drug transporters, respectively.
Key words: Burkholderia pseudomallei, multiple resistance, differential gene expression.
Поступила 26.04.05.
УДК 616.981.51
О.М.Кудрявцева, Н.И.Микшис, Л.В.Новикова, М.Ф.Болотникова, ДЛЗ.Шулепов, Ю.А.Попов
СЕЛЕКЦИЯ СТАБИЛЬНЫХ И ЭФФЕКТИВНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА BACILLUS ANTHRACIS
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Для рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном pag, детерминирующим синтез про-тективного антигена сибиреязвенного микроба, изучена стабильность наследования генетической информации in vitro и in vivo. Отобраны стабильные клоны трансформантов с продукцией биологически значимого антигена выше уровня, определенного для исходных вакцинных штаммов. Бациллярные штаммы-продуценты авиру-лентны, вследствие отсутствия репликонов pXOl и рХ02, и синтезируют только протективный компонент токсина Bacillus anthracis.
Ключевые слова: В. anthracis, протективный антиген возбудителя сибирской язвы, генно-инженерные продуценты протективного антигена.
В геноме Bacillus anthracis - возбудителя сибирской язвы содержатся две высокомолекулярные плазмиды - pXOl и рХ02. Элиминация репликона рХ02, кодирующего синтез капсулы, приводит к авирулентности штамма. Плазмида pXOl детерминирует синтез бифункционального экзотоксина. При взаимодействии его компонентов, протеолити-чески активированного протективного антигена с отечным и летальным факторами, происходит образование токсичных комплексов, вызывающих специфическое повреждение тканей организма. Вне комплексов протективный антиген (ПА) безвреден и обладает высоким иммуногенным потенциалом. Для производства химических сибиреязвенных вакцин препарат ПА получают из токсина, продуцируемого в среду выращивания аттенуированными культурами В. anthracis. Но очевидно, что вакцин-
ные штаммы сибиреязвенного микроба, содержащие рХ01, а следовательно, гены синтеза отечного и летального факторов, не могут в полной мере отвечать возрастающим требованиям, предъявляемым к продуцентам биологически значимого антигена. Создание эффективных и безопасных продуцентов возможно путем клонирования гена pag, ответственного за синтез ПА, в штаммах гомо- и гетероло-гичных видов микроорганизмов [3, 5 ,6].
Ранее нами была сконструирована гибридная плазмида рИВ 110РА посредством встраивания участка рХ01, содержащего ген pag, в мультикопийный вектор рИВПО по сайтам рестрикции ВатН1 и селектирован ее вариант риВ110РА-1, обеспечивающий высокую продукцию ПА. Рекомбинантную ДНК с помощью электростимулируемой трансформации ввели в бесплазмидные реципиентные ба-
циллярные штаммы, характеризующиеся сниженной активностью протеолитических ферментов. Цель настоящего исследования: изучение стабильности полученных продуцентов и определение уровней продукции ПА рекомбинантными штаммами, несущими клонированный ген pag, в сравнении с исходными вакцинными культурами.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использованы вакцинные штаммы В. амкгаая СТИ-1 и В. апгкгаш 55, их бес-плазмидные производные В. агикгаЫз СТИДТ, В. аш-ИгаЫз 55ДТ, В. $иЬиШ \VB600, штаммы с клонированным геном pag - В. аШкгаЫя СТИДТ рЦВ1 ЮРА-1, В. апхкгаск 55ДТрЦВ110РА-1 и В. $иЬ-НШ \VB600 рЦВ1 ЮРА-1 (настоящее исследование).
Питательные среды, реактивы, лабораторные животные. В качестве питательных сред использовали бульон ВН1 («Б1^о», США), Ь-бульон и агар, в которые при необходимости добавляли канамицин (25 или 50 мкг/мл), а также оригинальную среду (Б-бульон), предложенную Т.РагсЬаив е? а1. [4]. Для тестирования штаммов В. аткгаыБ на продукцию ПА использовали среду следующего состава (мг/л): СаС12 *2Н20 - 14,7; 1У^504-7Н20 - 9,8; Мп804-Н20 -0,85; КН2Р04- 680,0; К2НР04 - 871,0; аденин - 2,1; урацил - 1,4; Ь-триптофан - 52,0; Ь-цистин - 12,0; глицин:- 15,0; тиамин-гидрохлорид - 10,0; казами-новые кислоты - 3,6 (pH 6,9); с добавлением (г/л): агарозы - 7,5; глюкозы - 20; бикарбоната натрия -7,2; а также (мл/25 мл среды): нормальной лошадиной сыворотки - 0,6; кроличьей сыворотки с антителами: к ПА - 1. В работе использовали морских свинок весом от 300 до 350 г.
Постановка реакции преципитации на среде с анти-ПА антителами. На твердую питательную среду вышеописанного состава, содержащую кроличьи анти-ПА антитела, переносили уколом изолированные колонии трансформантов. Посевы инкубировали 24 ч в атмосфере С02, результаты регистрировали в проходящем свете, отмечая зону преципитации вокруг посева уколом. Положительным контролем служил вакцинный штамм В. ашИгаЫз СТИ-1 (продуцирующий ПА), отрицательным - бесплазмидный В. атНгас1$ СТИДТ (не продуцирующий ПА).
Исследование белкового состава культуральных фильтратов. Культуру исследуемых штаммов выращивали в течение 16 ч в Б-бульоне с добавлением бикарбоната натрия (7,2 г/л) и 0,4 % глицерина при ^температуре 37 °С с аэрацией. При выращивании штаммов с клонированным геном pag в среду добавляли канамицин (50 мкг/мл). После периода инкубации клетки осаждали центрифугированием при 10000 об./мин. Супернатанты стерилизовали через мембранные фильтры (МППроге, США) с диа-метром пор 0,22 мкм, концентрировали добавлением сульфата аммония до 70 % насыщения или с использованием центриконов-30, центрифугировали при 10000 об./мин в течение 15 мин, надосадочную жидкосръ удаляли, а осадок разводили буфером для электрофореза.
Электрофорез белковых препаратов. Препараты ресуспендировали в буфере, содержащем
0,125 моль трис-НС1, 4 % SDS, 20 % глицерола, 2 % 2-меркаптоэтанола, 0,03 ммоль бромфенолового синего (pH 6,8), прогревали при 100 °С в течение 90 с и вносили по 15 мкл образца в лунки 10 % полиакриламидного геля. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА в течение 5 ч. Г ель окрашивали по инструкции фирмы Amersham, сканировали и проводили компьютерный анализ.
Иммуноблот. Перенос белков на нитроцеллю-лозную мембрану (Hybond-C, Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1 ч. После переноса мембрану однократно отмывали в буфере (TBS), содержащем 20 мМ трис-ОН, 500 мМ NaCl (pH 7,5) и инкубировали в течение 1,5 ч в блокирующем растворе, содержащем 1 % БСА в TBS. Затем мембрану отмывали дважды в буфере (TTBS), содержащем 0,05 % твин-20 в TBS и инкубировали с кроличьими антителами к ПА в разведении 1:2000 в течение ночи при температуре
4 °С. Далее, после двукратного отмывания в TTBS, мембрану инкубировали с меченными пероксидазой антителами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1: 2000 в течение 2 ч, после чего отмывали двукратно в TTBS, однократно в TBS и окрашивали раствором диаминобензидина в течение 30 мин.
Иммуноферментный анализ. В каждый ряд 96-луночного планшета вносили по 100 мкл препарата культурального фильтрата одного из штаммов в двукратных разведениях. В последнем ряду также титровали очищенный белок ПА, начиная от установленной концентрации (100 мкг/мл). После стандартных этапов инкубации со специфическими и меченными пероксидазой видоспецифическими антителами проводили обработку субстратом (орто-фенилдиамин) и результаты регистрировали спектрофотометрически с помощью Multiskan Plus Version 2.01 при длине волны 492 нм.
Стабильность плазмид in vitro и in vivo. Стабильность гибридной плазмиды оценивали согласно методикам, предложенным J.Bamard, A.Friedlander [1] и S.Cohen [2].
Результаты и обсуждение
На первом этапе для трансформантов, содержащих гибридную плазмиду pUBl 10РА-1, изучали стабильность наследования генетической информации in vitro и in vivo. Исследовали до 30 клонов рекомбинантных штаммов, полученных на основе бесплазмидных производных - В. anthracis СТИДТ, В. anthracis 55ДТ, и штамма близкородственного бактериального вида В. subtilis WB600. Стабильность in vitro тестировали по 2 вариантам: выращиванием в течение нескольких генераций в бульоне без добавления селективного антибиотика и чередованием циклов развития в присутствии плазмидного маркера и без него. В первом случае культуры рекомбинантных клонов выращивали в течение ночи в
5 мл бульона без селективного антибиотика, затем наносили методом реплик на чашки с канамицином (25 мкг/мл) и без него и подсчитывали процент клонов, выросших на селективных чашках. После периода инкубации в бульоне без селективного давле-
16 II П 13
Рис. 1. Зоны преципитации на среде с анти-ПА антителами исходных, реципиентных и рекомбинантных штаммов:
1.1 - В. атЬгас'н СТИ-1,1.2- реципиент В. аткгас^з СТИДТ,
1.3-рекомбинантный штамм с гибридной плазмидой р1!В1 ЮРА-1 на основе В. ашИгаах СТИДТ; 11.1 - В. агиИгаах 55,11.2 - реципиент В. атИгаЫз 55ЛТ, II.3 - рекомбинантный штамм с гибридной плазмидой риВ1 ЮРА-1 на основе В. ам/ггаах 55ДТ; 111.1 - В. зиЫШя WB6(Ю, 111.3 - рекомбинантный штамм с гибридной плазмидой риВ1 ЮРА-1 на основе В. 5иЬШ1$ \VB600
Рис. 2. Белковые профили культуральных фильтратов исходных, реципиентных и рекомбинантных штаммов В. атИгаах и В. зиЫШй:
1 - реципиент В. апЛгаш СТИДТ; 2 - В. апЛгаЫз СТИ-1;
3, 4, 5-рекомбинантные клоны с гибридной плазмидой р1Ш1 ЮРА-1 на основе В. амИгас 'и СТИДТ; 6 - маркеры молекулярных масс;
7-В. апЛгас'н 55; 5 - реципиент В. амИгаыз 55ДТ;
9,10, И -рекомбинантные клоны с гибридной плазмидой р11В1 ЮРА-1 на основе В. аш1ггас11 55ДТ; 12 - В. зиЫШэ \VB600;
13,14 - рекомбинантные клоны с гибридной плазмидой р11В I ЮРА-1 на основе В. \VB600
ния канамицина гибридную плазмиду наследовали в среднем 30 % клонов различных рекомбинантных штаммов. Во втором случае культуры рекомбинантах клонов выращивали в бульоне с добавлением канамицина (25 мкг/мл) до середины логарифмической фазы, затем разводили 1:100 средой без антибиотиков и продолжали выращивать до конца логарифмической фазы. Через 10-12 подобных чередующихся пассажей клетки разбавляли средой для споруляции, не содержащей антибиотики, и инкубировали 3 сут до образования спор. Споровую взвесь прогревали при 65 °С, высевали на агаровую среду до получения изолированных колоний и затем осуществляли клональный анализ. Для этого перекалывали по 100 клонов каждого штамма параллельно на среды с добавлением антибиотика и без селективного давления. Подсчитывали процент клонов, выросших на селективных чашках. При чередовании пассажей на селективных и обычных средах часть трансформантов полностью утрачивала признак антибиотикорезистентности еще на начальных этапах, однако отдельные рекомбинантные клоны сохраняли способность к росту в присутствии селективной концентрации канамицина даже после 10 дубль-пассажей и последующего цикла споруляции. Стабильные in vitro клоны трансформантов каждого из реципиентных штаммов тестировали in vivo на модели морских свинок. Лабораторным животным вводили споровую взвесь рекомбинантного штамма в концентрации МО9 КОЕ. Затем через определенные промежутки времени проводили высев культуры из места инъекции с последующим пере-колом изолированных колоний на простые и селективные среды. В результате пассажа через организм лабораторных животных изолированные рекомбинантные клоны показали 100% стабильность гибридного репликона.
Сравнение уровней продукции ПА проводили между исходными вакцинными штаммами В. anthracis СТИ-1, В. anthracis 55 и перечисленными выше культурами с клонированным геном pag. На среде, содержащей антитела к ПА, зоны радиальной диффузии антигена вокруг посева уколом для рекомби-натных штаммов составили 5—10 мм, а для вакцинных - 1,5-2 мм (рис. 1). По результатам белкового электрофореза культуральных фильтратов и имму-ноблота с анти-ПА антителами рекомбинантные штаммы продуцировали в среду культивирования в несколько раз больше белка с молекулярной массой, соответствующей значениям ПА (рис. 2). Количественную оценку уровней продукции ПА осуществляли с использованием ИФА. Для этого готовили культуральные фильтраты штаммов, выращенных в стандартизированных условиях. По известной концентрации ПА в очищенном препарате устанавливали значения для испытуемых образцов. В результате было установлено, что вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1, В. anthracis 55 продуцируют примерно 20-30 мкг/мл ПА, в то время как сконструированные на их основе штаммы с гибридной плазмидой pUB 1 ЮРА-1 - в пределах 50-70 мкг/мл.
Таким образом, проведено изучение экспрессии клонированного гена pag и стабильности гибридной плазмиды pUB110PA-l в реципиентных штаммах В. anthracis СТИАТ, В. anthracis 55ДТ и В. subtilis WB600. Отобраны стабильные in vitro и in vivo клоны с высокой продукцией биологически значимого антигена. Штаммы-продуценты ПА не содержат в геноме плазмид pXOl и рХ02, детерминирующих синтез токсина и капсулы - основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы. Продукция белка ПА штаммами с клонированным геном pag примерно в 2,5 раза превосходит продукцию ПА вакцинами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.
Кроме того, рекомбинантные культуры синтезируют только протективный компонент токсина. Это делает возможным получение высоко очищенного продукта без реактогенных примесей отечного и летального факторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barnard J., Friedlander А. // Infect. Immun. -1999.-Vol. 67.-P. 562-567.-2. Cohen S., Mendelson L., Altbouml Z. et al. II Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, N 8. -p. 4549^558. - 3.Coulson N.. Fulop М., Titball R. // Vaccine. - 1994. - Vol. 12. - P. 1395-1401. - 4. Farchaus J., Ribot wl, Jendrek S. et al. H J. Applied Microbiol. - 1998. -Vol. 64. -i P. 982-991. - 5. Ivins B., Welkos S. // Infect. Immun. - 1986.- Vol. 54, N2. - P. 537-542. - 6. Vodkin М., Leppla S. // Cell. - 1983. - Vol. 34. - P. 693-697.
O.M.Kudryavtseva, N.I.Mikshis, L.V.Novikova, M.F.Bolotnikova, D.V.Shulepov, Yu.A.Popov
Selection of Stabile and Efficient Recombinant Strains
Overproducing Bacillus anthracls Protective Antigen
Russian Anti-Plague Research Institue «Microbe», Saratov
Stability of inheritance of genetic information was studied in vivo and in vitro in recombinant bacillary strains containing cloned pag gene determining the synthesis of the anthrax pathogen protective antigen. Stable clones were selected among the transformants that were capable of producing higher levels of the biologically important antigen as compared to those determined for the original vaccine strains. The bacillary overproducing strains were shown to synthesize only the protective component of Bacillus anthracis toxin being avirulent due to the absence of pXOl and pX02 replicons.
Key words: Bacillus anthracis, anthrax agent protective antigen, gene-engineering strains overproducing protective antigens.
Поступила 17.07.05.
УДК 616.932:575:546.212
Т.А.Кулыпань, А.В.Топорков, Н.И.Смирнова
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ БИОВАРА ЭЛЬТОР ПРИ ИХ ОБИТАНИИ В ВОДНОЙ СРЕДЕ
I Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
I
I
| В результате экспериментального моделирования установлено, что при попадании из организма хозяина в водную среду геном эпидемически опасных штаммов может утрачивать профаг СТХ или ряд генов его коровой области при сохранении других мобильных генетических элементов, несущих гены вирулентности, пандемичности и персистенции. Показано, что потеря токсигенных свойств не сопровождается изменением гемолитической активности штаммов, одного из основных фенотипических маркеров возбудителя текущей 7-й пандемии холеры. Представленные данные свидетельствуют в пользу предположения, что штаммы с1хА 1срА+, нередко выделяемые в природных популяциях, появляются в результате адаптивного изменения генома вирулентных штаммов, получивших ранее в процессе эволюции весь необходимый набор чужеродных генных блоков патогенности.
! Ключевые слова: возбудитель холеры эльтор, экспериментальное моделирование, реорганизация генома, профаг СТХ, гемолитическая активность.
Напряженная эпидемиологическая ситуация по холере в Российской Федерации обусловлена постоянной опасностью завоза этой инфекции из эндемичных очагов, локализованных на территории Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки, в связи с огромными по масштабу международными миграционными процессами населения [5(]. Возбудитель холеры имеет в геноме приобретенные в процессе эволюции мобильные генетические элементы (МГЭ) с генами вирулентности, персистенции и пандемичности (профаги СТХ, RS1; острова патогенности VPI-1 и VPI-2; острова пандемичности VSP-1 и VSP-2; остров персистенции в окружающей среде EPI), удачная комбинация которых обеспечивает возможность его пребывания в двух разных экологических нишах - в организме хозяина с развитием инфекционного процесса и в водной экосистеме [9, 17]. Для существования в разных условиях окружающей среды холерные вибрионы используют две основные стратегии выживания - переход вегетативных форм в! некультивируемое состояние (НС) и/или формирование биопленки [3, 10, 11, 14, 15]. Вместе
с тем, при попадании вирулентных клонов из организма хозяина в водную среду модульная организация их генома может, видимо, обусловить его реорганизацию, выражающуюся в потере ряда МГЭ, несущественных для выживания в новых условиях. Основанием для такого предположения служат сведения о выделении из внешней среды нетоксигенных вибрионов, сохранивших острова патогенности, пандемичности и персистенции, но утративших профаг СТХ, содержащий гены МхАВ, го?, асе, кодирующие, соответственно, биосинтез термолабильного холерного токсина - основного фактора патогенности, а также двух дополнительных токсинов и Асе [12, 17]. В то же время нельзя исключить, что указанные выше нетокси-генные штаммы никогда не приобретали профаг в процессе эволюции. Для того чтобы сделать выбор между двумя гипотезами о происхождении таких нетоксигенных штаммов были проведены исследования, направленные на выявление и анализ генетических и фенотипических изменений вирулентных штаммов после пребывания их в водной среде.
