CC BY
42
УДК 616.981.51:576.809.7
С.А.Еремин, Н.И.Микшис, О.А.Волох, О.М.Кудрявцева, И.А.Шепелев, А.Ю.Гончарова,
Ю.А.Попов, А.К.Никифоров
изучение биокинетических особенностей и оптимизация условий культивирования рекомбинантного аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Рекомбинантный штамм Bacillus anthracis 55ATnA-1Spo- при пассировании in vitro сохраняет свойство аспо-рогенности и способность к репликации гибридной плазмиды. Синтез иммуногенного белка генно-инженерным продуцентом не зависит от содержания в атмосфере СО2. Определены условия культивирования аспорогенного штамма для увеличения продукции протективного антигена. Использование в технологическом процессе не образующего спор штамма B. anthracis позволит обеспечить безопасность и экологичность процедуры получения основного компонента химической сибиреязвенной вакцины.
Ключевые слова: культивирование, Bacillus anthracis, протективный антиген.
Анализ заболеваемости природно-очаговыми и зооантропонозными инфекциями в 2007 г. показал лишь незначительное уменьшение случаев сибирской язвы у людей по сравнению с предыдущим годом
[3]. Возможность заражения человека возбудителем этого особо опасного инфекционного заболевания поддерживается существованием множественных почвенных очагов и периодически возникающими эпизоотиями. Кроме того, В. ап1ктае18 относится к категории А агентов биотерроризма [12].
Наиболее действенным способом профилактики сибирской язвы является вакцинация людей групп риска и сельскохозяйственных животных. Применяемые в России живые сибиреязвенные вакцины, несмотря на свою эффективность, обладают относительно высокой реактогенностью. Более безопасные химические вакцины состоят главным образом из протективного антигена (ПА), выделенного из аттенуированных штаммов В. апкта^ [11, 14]. Входящий в состав сибиреязвенного экзотоксина ПА обладает ярко выраженными иммуногенными свойствами, однако две другие его составляющие -отечный и летальный факторы, участвуют в реализации патогенного действия микроорганизма [5, 15]. Существующая технология получения ПА из аттенуированных культур не позволяет добиться полного разделения компонентов токсина, ввиду близких значений их молекулярных масс. С помощью рекомбинантных технологий возможно создание продуцентов ПА, лишенных генов, детерминирующих синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы. В то же время, с позиции биологической безопасности в производстве химических вакцин предпочтительнее использование бактериальных штаммов, не образующих спор.
В РосНИПЧИ «Микроб» сконструирован аспо-рогенный продуцент ПА сибиреязвенного микроба [2]. Генно-инженерный штамм содержит структурный ген pag в составе гибридного репликона риВ110РА-1 и продуцирует около 100 мкг/мл ПА, что в 4-5 раз
больше значений, определенных для В. апґкгасіз СТИ-1 и В. anthracis 55. По биологическим характеристикам синтезируемый штаммом ПА претендует на роль основного компонента в усовершенствованной химической вакцине. Целью настоящего исследования было определение условий культивирования рекомбинантного продуцента ПА, обеспечивающих высокий выход белкового продукта.
Материалы и методы
В работе использован рекомбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1^ро) (КМ97, патент РФ № 2321629) [Сар(рХ02-),Тох-(рХ01). Кмг(риВ110РА-1). $ро-].
Для выращивания использовали бульон Хоттингера, казеиновый бульон. L-бульон, S-бульон
[4]. содержащий (г/л): триптон - 33.0; дрожжевой экстракт - 20.0; L-гистидин - 2.0; №С1 - 7.4; №2НРО4 - 8.0; КН2РО4 - 4.0 (pH 7.4). В готовую среду при необходимости добавляли: глюкозу - 2.0 г/л; канамицин - 25 мкг/мл.
Чистоту культуры В. anthracis контролировали бактериоскопически и бактериологически.
Оценку биокинетических показателей роста проводили с использованием морфометрических и биокинетических методов анализа. Физиологическое состояние популяции оценивали по следующим показателям:
1) выход биомассы (Е)
Е=УжфхХ/Ужф+Угф.
где Ужф - объем жидкой фазы. Утф - объем твердой фазы. X - концентрация биомассы.
2) удельная скорость роста клеток (ц)
Ц=2.3 (^Х-^Х0) / М0:
где Х0 и X - начальная и конечная концентрации.
t0 и t - начальный и конечный момент времени.
3) удельная скорость образования антигена (qp)
qp=P-P о / X(t-to),
где P0 и P - начальная и конечная концентрации антигена, X - концентрация биомассы, t0 и t - начальный и конечный момент времени.
Протеолитическую активность штамма B. anthracis исследовали на полусинтетической среде следующего состава (г/л): бакто-агар - 15,0; дрожжевой экстракт - 4,0; казеин (альбумин) - 2,0; трис-HCl - 1,21; K2HPO4 - 0,5; MnSO4 ■ H2O - 0,03; MgSO4 ■ 7H2O - 0,4; CaCl2 - 0,08; ZnSO4 ■ 7H2O -0,005; CuSO4 ■ 5H2O - 0,005; (NH4)2SO4 - 2,0 (pH 7,4). Изолированные колонии суточной агаровой культуры B. anthracis наносили на поверхность пластинки агара (не более 16 клонов на чашку), инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. На среде с казеином или альбумином вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов на мутном фоне среды образовывались зоны просветления шириной до 10 мм. Через 48 ч инкубации на этой же среде регистрировали синтез желтого диффундирующего пигмента по возникновению вокруг посева желтой радиальной зоны на беловатом общем фоне.
Постановку реакции радиальной диффузионной преципитации осуществляли на казаминовой среде, содержащей кроличьи анти-ПА антитела, переносом уколом изолированных колоний штаммов. Посевы инкубировали в течение 16 ч при температуре 37 °С, а затем в течение 24 ч при комнатной температуре.
Наличие гибридной плазмиды в штамме B. anthracis 55ATnA-1(Spo“) подтверждали данными электрофоретического разделения выделенной ДНК, а наличие клонированного гена pag - результатами ПЦР-анализа с олигонуклеотидными праймерами на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы ДНК в составе pag-гена плазмиды pXO1 B. anthracis (РосНИПЧИ «Микроб»). Реакцию проводили с препаратами плазмидных ДНК (концентрация ДНК - 100 нг/мкл), выделенных из рекомбинантных бациллярных штаммов, а также из контрольного штамма B. anthracis СТИ-1.
Экспрессию гена pag исследовали с помощью комплекса биохимических и иммунохимических методов. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [9] с применением набора реактивов «Bio-Rad DC Protein Assay» (США). Чистоту препаратов ПА контролировали в SDS-PAGE электрофорезе по U.K.Laemmli, а иммуноспецифичность - в иммуно-блоте по методу H.Towbin [8, 13]. В иммунохимиче-ских реакциях использовали кроличьи поликлональные антитела к ПА. Для определения продукции ПА использовали непрямой твердофазный иммунофер-ментный анализ (ТИФА). В каждом ряду 96-луночно-го планшета титровали культуральные фильтраты, в последнем ряду - очищенный белок, начиная от уста-
новленной концентрации. Меченные пероксидазой видоспецифические антитела (Sigma, CША) использовали в рабочем разведении 1:20000. Хромогенными субстратами служили ортофенилдиамин или ABTS (Sigma, CША). Учет результатов проводили при длине волны 492 или 405 нм соответственно.
Результаты и обсуждение
В качестве продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба использовали аспо-рогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ДTПА-1(Spo-). Данный штамм, сочетающий высокую продукцию протективного антигена с низкой активностью протеолитических ферментов, получен в результате генетической передачи гибридной плазмиды pUB110PA-1 со встроенным геном pag [2] в аспорогенный и протеазодефицитный реципиентный штамм B. anthracis 55ДT [І].
В течение более 30-суточных пассажей штамма B. anthracis 55ДTПА-1(Spo-) на питательных средах с добавлением селективного антибиотика случаев элиминации плазмиды pUB110PA-1 не отмечено. Элиминации плазмиды pUB110PA-1 не происходило и при условии непродолжительного выращивания штамма B. anthracis 55ДTПА-1(Spo-) в жидкой питательной среде без селективного антибиотика. Однако продление времени культивирования рекомбинантного аспорогенного продуцента ПА в отсутствие ка-намицина более 3 сут, а также увеличение количества суточных пассажей (более 3), приводило к резкому нарастанию темпов утраты гибридного репликона. Аспорогенность культур подтверждали через каждые 5-7 пересевов. На промежуточных этапах и по окончании всех схем пассирования реверсии к спорообразующему фенотипу не происходило. Кроме того, тестировали протеолитическую активность штамма. При исследовании на среде с казеином у всех тестированных клонов отсутствовали зоны деградации белкового субстрата вокруг посевов.
По данным белкового электрофореза и имму-ноблота, продукция ПА у аспорогенного рекомбинантного штамма была выше, чем у контрольного вакцинного штамма B. anthracis 55. Результаты реакции преципитации на среде с анти-ПА антителами подтвердили преимущество B. anthracis 55ДГША-i(Spo ) в способности к синтезу ПА. Зоны радиальной диффузии антигена вокруг посевов клонов аспорогенного рекомбинанта достигали 10 мм, в то время как у вакцинного штамма B. anthracis 55 они были не более 2 мм. C использованием 'І’ИФА осуществили количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантным штаммом - около 100 мкг/мл. Продукция ПА вакцинными штаммами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 составила 15 и 20 мкг/мл соответственно.
Tехнология выделения ПА из аттенуированных штаммов B. anthracis предполагает выращивание бактериальных культур в атмосфере с повышенным
содержанием СО2. В нашем случае моделирование указанных выше условий секреции ПА оказалось излишним. Продукция ПА рекомбинантным штаммом с риВ110РА-1 весьма эффективно происходила и в обычной атмосфере. Сконструированный штамм с клонированным геном pag выгодно отличается от аттенуированных продуцентов, ввиду отсутствия у него области, детерминирующей синтез СО2-зави-симого транскрипционного регулятора - AtxA. В штаммах сибиреязвенного микроба область AtxA локализована в составе высокомолекулярного ре-пликона рХ01. Как известно, экспрессия гена pag в составе рХ01, находится под строгим контролем СО2-зависимого транскрипционного регулятора -AtxA [7]. Повышение содержания СО2 является пусковым моментом для осуществления координированной регуляции синтеза ПА, ОФ, ЛФ, капсулы, белков S-слоя и, возможно, других факторов [6, 7, 10]. В штамме с клонированным геном pag область AtxA отсутствует, что объясняет СО2-независимый синтез ПА.
Для определения возможного влияния состава среды на секрецию ПА, культуру штамма B. anthra-cis 55ДТПА-1^ро) выращивали на средах, различающихся по содержанию питательных ингредиентов (в порядке убывания): S-бульоне, L-бульоне, бульоне Хоттингера с добавлением триптона (20 мг/мл), бульоне Хоттингера, казеиновой среде. Одинаковое количество микробной взвеси В. anthracis 55ДТПА-1^ро) засевали во флаконы с равным объемом перечисленных сред, добавляли канамицин в селективной концентрации и выращивали в течение 18 ч при температуре 37 °С с аэрацией. Протеины, секретиру-емые в среду культивирования, осаждали сульфатом аммония и разводили равными объемами буфера для электрофореза. После электрофоретического разделения протеинов сравнивали продукцию белка с молекулярной массой 83 кДа. Иммунореактивность
и специфичность данного белка подтверждали результатами реакции иммуноблота, дот-анализа, ТИФА с антителами к ПА. Во всех случаях отмечали образование окрашенных иммунных комплексов. Двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг ПА приводила к формированию адаптивного иммунитета с высокими значениями титров анти-ПА антител -1:8000 и 1:16000 (по результатам ТИФА). В случаях иммунизации культурой B. anthracis СТИ-1 титры составляли 1:1000 - 1:2000.
Наилучшие условия для роста и секреции ПА обеспечивал S-бульон. При выращивании на казеиновой среде продукция ПА была минимальной. Бульон Хоттингера и казеиновая среда могут быть использованы в технологии получения ПА только после добавления в них триптона.
На следующем этапе тестировали влияние продолжительности выращивания в жидких питательных средах разного состава на секрецию ПА. Уровень продукции ПА и рост биомассы сравнивали в поздней логарифмической или в ранней стационарной фазе роста (через 16, 18 и 24 ч культивирования). Использовали следующие среды: S-бульон, казеиновый бульон (140 мг% амминного азота), бульон Хоттингера (200 мг% аминного азота), а также последние две среды с добавлением триптона (20 мг/мл). Триптон (Difco) вводили в состав среды или непосредственно перед высевом культуры штамма-продуцента, или через 4 (16) часов роста в объемном соотношении 1/10 (2 мл штокового раствора на 20 мл бульона). Культивирование проводили при температуре 37 °С в колбах (250 мл) на тер-мостатируемой качалке RC-TK (США) с аэрацией (130 об/мин). Объем среды во всех случаях составлял 20 мл. Для создания селективных условий в среды вносили канамицин (25 мкг/мл). Посевной материал готовили из 18-часовой агаровой (LB-агар) культуры B. anthracis 55ATПА-1(Spo-) 4-й
Сравнительный анализ выхода биомассы и продукции nA штаммом B. anthracis 55ATnA-1(Spo ) на различных средах
Cреда Концентрация, через
16 ч 18 ч 24 ч
культуры в процессе роста, млрд м.к./м ПА, мг/мл культуры в процессе роста, млрд м.к./мл ПА, мг/мл культуры в процессе роста, млрд м.к./мл ПА, мг/мл
8-бульон
Казеиновый бульон с добавлением триптона перед началом выращивания
Бульон Хоттингера с добавлением триптона перед началом выращивания
Казеиновый бульон с добавлением триптона через 4 ч от начала выращивания
Бульон Хоттингера с добавлением триптона через 4 ч от начала выращивания
Казеиновый бульон с добавлением триптона через 16 ч от начала выращивания
Бульон Хоттингера с добавлением триптона через 16 ч от начала выращивания
15 5,0 15
20 18,0 22
20 21,0 20
18 0,80 20
20 0,64 20
15 0,24 12
17 0,96 18
4,48 20 2,0
2,60 20 1,0
4,80 25 1,20
0,60 18 0,24
0,60 28 0,32
0,12 23 0,06
0,64 27 0,12
Рис. 1. Зависимость удельной скорости роста (ц) штамма-продуцента В. аШктаЫз 55ДТПА-1(8ро-) и скорости образования ПА (ор) от среды культивирования на 16 ч от начала выращивания:
1 - 8-бульон, 2 - бульон Хоттингера с добавлением триптона перед началом культивирования, 3 - казеиновый бульон с добавлением триптона перед началом культивирования.
□ - удельная скорость роста штамма; ■ - удельная скорость образования ПА
генерации. Инокулят добавляли в объеме 0,5 мл до конечной концентрации в питательной среде -1,5-109 м.к./мл. Концентрацию ПА в культуральных фильтратах рассчитывали с помощью ТИФА. Ростовые качества среды оценивались по концентрации микробных клеток, определяемой по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Накопление биомассы наиболее интенсивно происходило на средах с высоким содержанием триптона, постепенно достигая максимума к 24 ч инкубации (таблица).
Содержание ПА в культуральных фильтратах зависело от наличия триптона в составе питательных сред, времени его внесения, продолжительности выращивания. В условиях культивирования на богатых питательных средах способность к синтезу ПА рекомбинантного аспорогенного штамма возрастала во много раз (рис. 1).
По результатам эксперимента к 16 ч от начала культивирования концентрация ПА оказалась самой низкой в культуральном фильтрате штамма
В. аШкгааз 55ДТПА-18ро- , выращенного на казеиновой среде. Несколько более высокие показатели отмечались при культивировании на бульоне Хоттингера без добавления триптона и с добавлением триптона через 4 ч от начала выращивания. Концентрация ПА в условиях роста аспорогенного рекомбинантного продуцента в 8-бульоне ожидаемо была выше в несколько раз. Самые высокие значения уровня продукции ПА зарегистрированы при росте В. аШкгааз 55ДТПА-1(8ро) в бульоне Хоттингера или казеиновой среде с добавлением триптона перед началом выращивания.
На всех средах максимальные концентрации ПА отмечались к 16 ч (рис. 2). В дальнейшем происходило постепенное снижение содержания ПА в культуральных фильтратах. Минимальные значения оказались через 24 ч выращивания. Особенно четко данная тенденция прослеживалась при использовании бульона Хоттингера или казеиновой среды с добавлением триптона. Вероятно, после 16 ч культивирования синтезируемый ПА начинает постепенно разрушаться под действием активизирующихся про-теолитических ферментов штамма-продуцента.
Таким образом, установлено, что продукция ПА рекомбинантным штаммом В. аМкгааз 55ДТПА-1(8ро) не зависит от содержания СО2 в атмосфере. Для лучшей секреции ПА предпочтительнее выращивание культуры генно-инженерного продуцента на среде с высоким содержанием триптона и дрожжевого экстракта. В качестве альтернативы 8-бульону возможно использование бульона Хоттингера или казеиновой среды с добавлением триптона в высокой концентрации. Во избежание возможной протеолитической деградации ПА продолжительность роста культуры штамма-продуцента не должна превышать 16 ч.
Работа выполнена по Государственному контракту № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
16 ч
24 ч
ПА
О 4 ; § и § 3 3
с ? & ^ - /' л, С ) •т\ у
фу е О о е в Шё \ тт
С о у у
Щ Ш о о о о V ёё у
с Г5' ^\ '"Л ■
щ /^4 V/ С V—/ \ 'л )
ПА
с ё. и Гх. )
с-
с ЧВР с ■Щ ё ш л
с с ^ . э
с Г 4 г г Г~' - - ^ . \ . ■'% ”л
£ Г- г , л }
V е О , -л л у
Рис. 2. Результаты ТИФА с антителами к ПА. Цифрами обозначены разведения культуральных фильтратов аспорогенного продуцента В. апктааз 55ДТПА-18ро-, выращенного на:
1 - 8-бульоне, 2 - бульоне Хоттингера с добавлением триптона, 3 - казеиновом бульоне с добавлением триптона.
В последних рядах 2-кратные разведения очищенного препарата ПА, начиная с концентрации 320 мкг/мл
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В. и др. Получение аспорогенных штаммов Bacillus anthracis. Биотехнология. 2003; 1:3-11.
2.Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф. и др. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена Bacillus anthracis. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2007; 3:15-21.
3. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2007 году: Государственный доклад. М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Ро спотребнадзора; 2008.
4. Farchaus J., Ribot W., Downs M., Ezzell J. Purification and characterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis delta Sterne-1. J. Bacteriol. 1995; 177(9):2481-9.
5. Gladstone G. Immunity of anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates. Brit. J. Exp. Pathol. 194б; 27:393-410.
6. Hoffmaster A., Koehler T. The anthrax toxin activator gene atxA is associated with CO2-enhanced non-toxin gene expression in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 1997; б5:3091-9.
I. Koehler T., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans-acting element activate transcription from one of two pr2omoters. J. Bacteriol. 1994; 17б:58б-95.
8. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:б80-5.
9. Lowry O., Risebrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:2б5.
10. Mignot T., Mock M., Fouet A. A plasmid encoded regulator couples the synthesis of toxins and surface structures in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 2003; 47:917-27.
II. Pittman P., Kim-Ahn G., Pifat D. et al. Anthrax vaccine: safety and immunogenicity of a dose-reduction, route comparison study in humans. Vaccine. 2002; 20:1412-20.
12. Spencer R., Wilcox M. Agents of biological warfare. Rev. Med. Microbiol. 1993; 4:138-43.
13. Towbin H., Stacbelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 7б:4350-4.
14. Turnbull P. Anthrax vaccines: past, present and future.
Vaccine. 1991; 9:533-9.
15. Wright G., Green T., Kanode R. Studies on immunity in anthrax. Immunizing activity of alumprecipitated protective antigen. J. Immunol. 1954; 73(6):387-91.
S.A.Eremin, N.I.Mikshis, O.A.Volokh, O.M.Kudryavtseva, I.A.Shepelev, A.Yu.Goncharova, Yu.A.Popov, A.K.Nikiforov
Study of Biokinetic Properties and Optimization of the Conditions of Propagation of Recombinant Asporogenic Strain Producing Anthrax Agent Protective Antigen
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe", Saratov
Recombinant Bacillus anthracis strain 55A TnA-1Spo- passed in vitro preserved its asporogenic property and ability to replicate recombinant plasmid. Synthesis of immunogenic protein by genetically engineered producer did not depend on CO2 content in the atmosphere. Determined were the conditions of propagation of asporogenic strain to increase the production of protective antigen. Using Bacillus anthracis asporogenic strain in technological process will provide the safe and ecological procedure of obtaining the major component of chemical anthrax vaccine.
Key words: propagation, Bacillus anthracis, protective antigen.
Об авторах:
Еремин С.А., Микшис Н.И., Волох О.А., Кудрявцева О.М., Шепелев И.А., Гончарова А.Ю., Попов Ю.А., Никифоров А.К. Российский научноисследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Authors:
Eremin S.A., Mikshis N.I., Volokh O.A., Kudryavtseva O.M., Shepelev
I.A., Goncharova A.Yu., Popov Yu.A., Nikiforov A.K. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 01.10.09.
