CC BY
32
УДК 616.981.51:591.67
П.Ю.Попова, Н.И.Микшис, О.М.Кудрявцева, А.Ю.Гончарова, Л.В.Новикова, Т.Н.Каштанова, Ю.А.Попов, Е.А.Смолькова, А.Л.Кравцов, Т.Н.Щуковская
влияние протективного антигена, синтезируемого АспорогЕнным рекомбинантным штаммом BACILLUS ANTHRACIS, на иммунную систему экспериментальных животных
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
На модели мышей линии BALB/c и морских свинок проведена оценка иммуногенности и безопасности препарата протективного антигена, полученного из аспорогенного рекомбинантного продуцента B. anthracis 55ДТПА-1(Spo). Показано, что развитие адаптивного иммунитета у иммунизированных очищенным белком лабораторных животных характеризуется высокими значениями титров специфических антител. Двукратная иммунизация биомоделей антигенным препаратом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом B. anthracis, сопоставимую с протективностью живой сибиреязвенной вакцины. Получены данные, свидетельствующие о возможности уменьшения вводимой дозы вакцинного штамма при последующей однократной иммунизации протективным антигеном. Установлено, что в иммунизирующей дозе рекомбинантный протективный антиген не обладает реактоген-ностью и не оказывает повреждающего действия на тимоциты и спленоциты лабораторных животных.
Ключевые слова: сибирская язва, протективный антиген, иммунитет, антитела.
P.Yu.Popova, N.I.Mikshis, O.M.Kudryavtseva, A.Yu.Goncharova, L.V.Novikova, T.N.Kashtanova, Yu.A.Popov, E.A.Smol’kova, A.L.Kravtsov, T.N.Shchukovskaya
Influence of the Protective Antigen, Produced by Bacillus anthracis Asporogenic Recombinant Strain, on the Immune System of Laboratory Animals
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Assessment of immunogenicity and biological safety of protective antigen preparation obtained from asporogenic recombinant producer, B. anthracis 55ATPA-1(Spo-), is made on the mice (BALB/c species) and Guiney pigs models. It is shown that the development of adaptive immunity in the inoculated with purified protein laboratory animals is characterized by high titers of specific antibodies. Double immunization of biological models with antigen preparation confers protection from B. anthracis infection, commensurable with protective capacity of the live anthrax vaccine. Obtained are the data confirming the possibility to reduce the injected doze of the vaccine strain in case of subsequent single immunization with protective antigen. It is determined that recombinant protective antigen shows no sign of reactogenicity and does not damage thymocytes and splenocytes in laboratory animals when administered for immunization.
Key words: anthrax, protective antigen, immunity, antibodies.
Особо опасная зооантропонозная инфекция -сибирская язва, вызываемая Bacillus anthracis, характеризуется острым началом и тяжелым течением. При несвоевременной диагностике и отсутствии этиотропной терапии летальность при сибиреязвенной инфекции может достигать 90 % [4]. Ключевой момент патогенеза заболевания - воздействие экзотоксина возбудителя на инфицированный макроорганизм [6, 7]. Токсин B. anthracis состоит из трех компонентов - отечного фактора, летального фактора и протективного антигена (ПА). ПА, с одной стороны, участвует в образовании токсичных комплексов, а с другой - является основным иммуногеном возбудителя сибирской язвы.
Важным профилактическиммероприятием,осу-ществляемым на территориях стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов Российской Федерации, является вакцинация населения и восприимчивых животных с использованием живых аттенуированных вакцин. Выраженное защитное действие живых вакцин сочетается с относительно высокой частотой развития побочных эффектов [1].
Избежать нежелательных последствий можно, используя для вакцинации очищенный препарат им-муногенного антигена возбудителя. Оптимальным источником ПА могут служить штаммы B. anth-racis, лишенные детерминант синтеза основных факторов патогенности [5]. Использование в качестве продуцентов ПА сибиреязвенных штаммов, не образующих спор, позволяет избежать микробной контаминации лабораторных и производственных помещений. В ходе предыдущих работ в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб» был сконструирован аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis, содержащий гибридную плазмиду с клонированным геномpag, кодирующим синтез ПА. Из культурального фильтрата штамма-продуцента B. anthracis 55ДТПА-1^ро) выделен ПА, достигнута высокая степень очистки препарата (90 %) за счет использования двухэтапной хроматографии [3].
Целью настоящей работы явилась оценка иммуногенности и безопасности препарата очищенного ПА на различных экспериментальных моделях.
Материалы и методы
Штаммы, лабораторные животные. В работе использовали рекомбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1^ро) (КМ97, патент РФ № 2321629); вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1; тест-заражающий штамм В. anthracis 2-я вакцина Ценковского (ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва).
Исследования проводили на морских свинках массой от 250 до 300 г и линейных мышах BALB/с -от 18 до 20 г.
приготовление спор штаммов сибиреязвенного микроба. Культуру иммунизирующего или тест-заражающего штаммов В. anthracis выращивали в течение 3-5 сут на агаре Хоттингера при температуре 37 °С. Биомассу смывали с поверхности агара и дважды отмывали дистиллированной водой. Перед иммунизацией или заражением споры прогревали при температуре 65 °С в течение 30 мин.
Выделение и очистка пА из рекомбинантного штамма. ПА выделяли из штамма В. anthracis 55ДТПА-1^ро). Антиген очищали двухэтапной хроматографией как описано ранее [3].
Иммунизация лабораторных животных. Очищенный ПА в сочетании с полным адъювантом Фрейнда (в объемном соотношении 2:1) вводили лабораторным животным подкожно двукратно с интервалом 14 дней. Иммунизирующая доза для морских свинок составила 25 мкг, для мышей BALB/с - 10 мкг. Инъекцию споровой взвеси вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 осуществляли подкожно однократно в дозах 5-106 или 5-107 КОЕ для морских свинок и 2Т06 КОЕ для линейных мышей. Контрольным животным вводили 0,9 % раствор натрия хлорида.
определение иммуногенности антигенного препарата и вакцинного штамма В. anthracis. Через 21 день от последней иммунизации биомоделей заражали возрастающими дозами тест-штамма В. anthracis 2-ая вакцина Ценковского. Для иммунизированных морских свинок концентрация спор тест-заражающего штамма составила от 1-104 до 1Т07 КОЕ, а для интактных - от 1Т01 до 1Т04 КОЕ. Иммунизированным линейным мышам вводили споровую взвесь в дозах от 1-103 до 1-106 КОЕ, контрольным животным - от 1-102 до
1-105 КОЕ. Наблюдение за зараженными животными осуществляли в течение 10 дней. Значение ЛД50 тест-заражающего штамма подсчитывали по формуле Кербера. Индексы иммунитета определяли как отношение ЛД50 заражающей культуры для вакцинированных и интактных животных.
постановка твердофазного иммуно-ферментного анализа. Очищенный ПА вносили в лунки 96-луночных планшетов («Медполимер», Санкт-Петербург) в концентрации 5-10 мкг/мл. Меченые пероксидазой видоспецифические антитела (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва) использовали в рабочем разведении 1:1000. В качестве
хромогенного субстрата использовали ABTS (Sigma, США). Результаты регистрировали спектрофотометрически с помощью Stat Fax (Awareness Technology, США) при длине волны 405 нм.
Цитофлуориметрический мониторинг пролиферативной активности сплено-цитов и тимоцитов. Линейным мышам вводили ПА в дозе 10 мкг однократно подкожно. Лимфоциты тимуса и селезенки выделяли общепринятыми методами [2]. Окрашивание лимфоцитов проводили смесью бромида этидия и митрамицина в течение 20 мин. Образцы анализировали на проточном ци-тофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия).
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования определяли напряженность и длительность поствакцинального иммунитета. Лабораторных животных иммунизировали ПА, полученным из аспорогенного рекомбинантного продуцента. В качестве группы сравнения использовали биомоделей, иммунизированных вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1. Забор крови осуществляли из краевой ушной вены у морских свинок и из хвостовой вены у линейных мышей в различные сроки - на 7, 14, 21, 28-е сутки, а также через 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 и 4,5 месяца после начала иммунизации. Титр антител к ПА определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
Отмечены следующие особенности антитело-образования у мышей линии BALB/c. После двукратной иммунизации дозой 10 мкг очищенного препарата ПА происходило постепенное нарастание титров специфических антител. К 21-му дню иммуногенеза титр анти-ПА антител составил 1/2560, а через 2 месяца он достигал максимального значения - 1/40000 (рис. 1). Вслед за пиком отмечали снижение титров до уровня 1/20000 - через 2,5 месяца, 1/5120 - через 3-3,5 месяца, и 1/640 - через 4,5 месяца. В сыворотках животных, вакцинированных B. anthracis СТИ-1,
45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000
Рис. 1. Динамика титров анти-ПА антител при иммунизации линейных мышей BALB/c препаратом ПА (линия синего цвета) или вакцинным штаммом (линия оранжевого цвета):
По оси абсцисс - сутки и месяцы после иммунизации.
По оси ординат - обратные значения титров сывороточных анти-ПА антител. На графиках приведены средние значения данных, полученных от 5 особей животных
максимум анти-ПА антител выявлялся на 28-е сутки - 1/5120. В дальнейшем выявляли титры на уровне 1/1280 - через 1,5-3 месяца, и 1/640 - через 3,5 месяца. На протяжении всего срока наблюдения титры антител к ПА у мышей, иммунизированных антигенным препаратом, были выше.
После двукратной иммунизации морских свинок дозой 25 мкг рекомбинантного ПА отмечали повышение титров анти-ПА антител - до 1/1280 к 21-м суткам, 1/5120 - к 2 месяцам (рис. 2). Пик антитело-генеза (1/40000) регистрировали через 2,5 месяца от начала эксперимента. В случае иммунизации споровой взвесью штамма В. anthracis СТИ-1 (5^106 КОЕ) максимальный титр антител к ПА в сыворотках животных отмечали через 1,5 месяца - 1/2560. В целом во все сроки количество антител к ПА у биомоделей, иммунизированных антигенным препаратом, было примерно в 2-4 раза больше.
Параллельно в течение первых двух недель проводили оценку реактогенности вводимого экспериментальным моделям препарата ПА. Каждые два дня определяли массу тела морских свинок и линейных мышей, осматривали и пальпировали место инъекции. За время наблюдения не отмечалось снижения веса лабораторных животных. Визуальных и пальпа-торных изменений на месте введения препарата не регистрировали.
На следующем этапе оценивали способность ПА защищать лабораторных животных от заражения различными дозами тест-штамма В. anthracis
2-я вакцина Ценковского. В экспериментах были использованы морские свинки и мыши линии BALB/c по 20 особей в каждой. Опытных биомоделей иммунизировали ПА или вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1. Животных контрольной группы оставляли интактными. Заражение осуществляли через 21 день от последней иммунизации. По истечении периода наблюдения, через 10 сут, подсчитывали значения ЛД50 тест-заражающего штамма и индексов иммунитета. Необходимо отметить, что в течение поствакци-
45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0
21 сутки 28 сутки 1,5 2 месяца 2,5 3 месяца 3,5 4,5
месяца месяца месяца месяца
Рис. 2. Динамика титров анти-ПА антител при иммунизации морских свинок препаратом ПА (линия синего цвета) или вакцинным штаммом (линия оранжевого цвета):
По оси абсцисс - сутки и месяцы после иммунизации.
По оси ординат - обратные значения титров сывороточных анти-ПА антител. На графиках приведены средние значения данных, полученных от 3 особей животных
нального периода среди морских свинок, иммунизированных вакцинным штаммом, пало около 25 % особей, тогда как в других группах подобных случаев зафиксировано не было.
В исследовании на модели линейных мышей были получены следующие результаты. В группе интактных животных показатель ЛД50 составил 5Т02 спор штамма В. апікгаеі8 2-я вакцина Ценковского. Для биомоделей, иммунизированных ПА, значение ЛД50 было на два порядка выше - 7,9Т04 спор. Степени защиты при иммунизации препаратом ПА в дозе 10 мкг и вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1 в дозе 2Т06 КОЕ были сопоставимы. В последнем случае показатель ЛД50 составил 3,1Т04 спор. Соответственно индексы иммунитета оказались практически одного порядка: для препарата ПА - і58,5, для В. anthracis СТИ-1 - 63,2.
В экспериментах на морских свинках наблюдали аналогичную тенденцию. Препарат ПА, полученный из аспорогенного рекомбинантного штамма, в дозе 25 мкг обладал протективностью на уровне вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1. Показатель ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных антигенным препаратом свинок составил 1,9Т0' спор, в то время как для интактных животных он был ниже на четыре порядка - 5-103 спор. Значение ЛД50 тест-штамма для биомоделей, вакцинированных В. anthracis СТИ-1 в дозе 5Т07 КОЕ, оказалось 2Т07 спор, а в дозе 5Т06 КОЕ - 3,1Т06 спор. Следовательно, индексы иммунитета у животных, получивших препарат ПА и вакцинный штамм (в дозе 5Т07 КОЕ), были почти одинаковыми - 3980 и 3990.
На модели морских свинок тестировали также комбинированную схему иммунизации. Лабораторным животным сначала вводили дозу 5Т06 КОЕ штамма В. anthracis СТИ-1, а затем в конце поствак-цинального периода (через 21 день) - 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА в сочетании с адъювантом. В этом случае значение ЛД50 регистрировали на уровне 1,7Т07 спор, индекс иммунитета составил 3548. Полученные результаты свидетельствуют о возможности уменьшения вводимой дозы вакцинного штамма при дополнительной однократной иммунизации препаратом рекомбинантного антигена.
Для оценки влияния препарата ПА на иммунную систему биомоделей проводили исследование пролиферативной активности лимфоцитов органов центрального и периферического иммуногенеза. В качестве биомодели были выбраны линейные мыши BALB/c. Лабораторных животных (по 6 особей на каждый срок) иммунизировали подкожно препаратом ПА. Контролем служили интактные животные. Пробы тимуса и селезенки забирали через 4 ч, на 1, 3, 7 и 14-е сутки после иммунизации. Процентное соотношение тимоцитов и спленоцитов в фазах клеточного деления регистрировали с помощью проточного цитофлуориметра. В каждом образце анализировалось не менее 30000 клеток. Апоптоз оценивали по накоплению гиподиплоидных клеток в пике, рас-
Распределение тимоцитов и спленоцитов линеиных мышей BALB/c, иммунизированных рекомбинантным протективным антигеном, по клеточному циклу
Иммунизирующий препарат Срок иммуногенеза Пролиферирующие клетки, % Апоптотические клетки, % Баланс
Тимус
Контроль 28,7±1,5 3,6±0,3 0,12
ПА 10 мкг 4 ч 32,4±0,8 3,2±0,3 0,10
1 сут 32,8±0,9 2,8±0,2 0,09
3 сут 30,1±1,3 2,3±0,5 0,08
7 сут 30,9±2,7 3,1±0,5 0,10
14 сут 26,6±0,7 Селезенка 2,8±0,2 0,10
Контроль 27,7±1,6 2,8±0,3 0,10
ПА 10 мкг 4 ч
1 сут 3 сут 7 сут 14 сут
полагающемся левее пика, соответствующего диплоидным клеткам. Активацию иммунокомпетентных клеток отражало их число в стадии пролиферации. Определяли также соотношение клеток, находящихся в стадии апоптоза и пролиферации. Значение данного индекса меньше единицы свидетельствует об отсутствии повреждающего действия исследуемого препарата на иммунокомпетентные клетки.
При иммунизации линейных мышей очищенным препаратом ПА во все сроки исследования апоптоти-ческая и пролиферативная активность клеток тимуса существенно не отличалась от аналогичных показателей в группе контроля (таблица). Баланс апоптоза и пролиферации не превышал 1,0. В пробах селезенки, взятых через 4 ч, на 1-е и 3-и сутки, число пролиферирующих спленоцитов соответствовало контрольным значениям. На 7 и 14-е сутки регистрировали повышение пролиферативной активности клеток селезенки, что может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопродукцией. Введение мышам ПА не влияло на апоптотическую активность спленоцитов. Индекс соотношения клеток селезенки в стадии апоптоза и пролиферации не превышал 1,0.
Таким образом, синтезируемый рекомбинантным аспорогенным штаммом антиген вызывает развитие у лабораторных животных напряженного адаптивного иммунитета, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров специфических антител. Показано, что в иммунизирующей дозе препарат ПА не обладает реактоген-ностью и не оказывает повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки органов центральной и периферической иммунной системы. Планируется расширение исследований по изучению взаимодействия рекомбинантного ПА с клетками врожденного и адаптивного иммунитета.
Работа выполнена по государственному контракту № 62-Д/2 от 23.08.2011 в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система хими-
25,5±2,5 4,5±0,8 0,18
24,2±0,8 4,4±1,2 0,18
22,7±1,9 5,8±1,4 0,25
33,7±1,6 5,2±1,3 0,15
33,7±2,4 2,4±0,4 0,07
ческой и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2012 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов А.В. и др. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. М.: ЗАО МП «Гигиена»; 2008. 416 с.
2. Медицинские лабораторные технологии. Справочник. СПб.; 2000.
3. МикшисН.И., Кудрявцева О.М., ШулеповД.В., Гончарова А.Ю., БолотниковаМ.Ф., НовиковаЛ.В. и др. Аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Биотехнология. 2010; 4:25-33.
4. ОнищенкоГ.Г., ВасильевН.Т., ЛитусовН.В., ХаречкоА.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ; 1999. 447 с.
5. Baitlie L. Is new always better than old? The development of human vaccines for anthrax. Hum. Vaccin. 2009; 5(12):806-16.
6. Koehler T. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol. Aspects Med. 2009; 30:386-96.
7. MockM., Fouet A. Anthrax. Microbiol. Rev. 2001; 55:647-71.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Marinin L.I., Onishchenko G.G., Kravchenko T.B., Dyatlov I.A., TyurinE.A., StepanovA.Vetal. [Human Anthrax: Epidemiology, Prophylaxis, Diagnostics, Treatment]. M.: ZAO MP “Gigiena”; 2008. 416 p.
2. Medical Laboratory Technologies. Reference Book. St. Petersburg;
2000.
3. Mikshis N.I., Kudryavtseva O.M., Shulepov D.V., Goncharova A.Yu., Bolotnikova M.F., Novikova L.V et al. [Asporogenic recombinant producer of anthrax protective antigen]. Biotekhnologia. 2010; 4:25-33.
4. Onishchenko G.G., Vasil’ev N.T., Litusov N.V, Kharechko A.T., Vasil’ev P.G., Sadovoy N.V et al. [Anthrax: Relevant Issues of Microbiology, Epidemiology, Clinical Picture, Treatment and Prophylaxis]. M.: Ministry of Health of the Russian Federation; 1999. 447 p.
Authors:
Popova P.Yu., Mikshis N.I., Kudryavtseva O.M., Goncharova A.Yu., Novikova L.V., Kashtanova T.N., Popov Yu.A., Smol’kova E.A., Kravtsov A.L., Shchukovskaya T.N. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева ОМ., Гончарова А.Ю., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А., Смолькова Е.А., Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 06.09.11.
