Идентификация вителлогенина в крови мелкочешуйной красноперки-угай Tribolodon brandtii Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Труды Карельского научного центра РАН

№ 3. 2013. С. 46-51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 575.113+597.113:597

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИТЕЛЛОГЕНИНА В КРОВИ МЕЛКОЧЕШУЙНОЙ КРАСНОПЕРКИ-УГАЙ TRIBOLODON BRANDTII

А. М. Андреева1, Р. А. Федоров1, И. П. Рябцева1, Н. Е. Ламаш2, 3,

А. Э. Филиппова1

1 Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, Борок

2 Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток

3 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия

В сыворотке крови преднерестовых самок мелкочешуйной красноперки-угай из Японского моря идентифицировали белок вителлогенин с помощью методов протеомики - 20-80Б-электрофореза и последующей масс-спектрометрии MALDI в тандемном режиме. Поиск гомологов в базе данных NCBI по спектрам фрагментации анализируемого белка позволил идентифицировать вителлогенин красноперки-угай с высоким критерием достоверности. Результаты работы показали возможность успешной идентификации вителлогенина по его С-концевому фрагменту, не входящему в состав консервативных мотивов. Полученные результаты предполагают использование методов протеомики для мониторинга состояния водоемов.

Ключевые слова: мелкочешуйная красноперка-угай; кровь; вителлогенин; электрофорез; масс-спектрометрия.

A. M. Andreeva, R. A. Fyodorov, I. P. Ryabtseva, N. E. Lamash, A. E. Philippova. IDENTIFICATION OF VITELLOGENIN IN THE BLOOD SERUM OF THE PACIFIC REDFIN TRIBOLODON BRANDTII

We identified the protein vitellogenin in the blood serum of the pre-spawning females of Tribolodon brandtii from the Sea of Japan using proteomic methods - 2d-SDS-electrophoresis and MALDI mass spectrometry in the tandem mode. The search for homologues in the DB NCBI by the spectra of fragmentation of the analyzed protein made it possible to identify the vitellogenin of Tribolodon brandtii with the high «score» criterion. The results showed vitellogenin can be successfully identified by its C-terminal region, which is not part of conservative motifs. The results suggest proteomic methods can be used to monitor waterbodies.

Key words: Tribolodon brandtii; blood; vitellogenin; electrophoresis; mass

spectrometry.

Вителлогенин входит в состав семейства белков, транспортирующих липиды и содержащих в структуре консервативный домен «lipid transport domain»; структурную формулу этого димерного белка можно представить как Vg = lipid ([Lv-Pv])2, где Vg - белок вителлогенин, Lv - белок липови-теллин, Pv - белок фосвитин [Anderson et al., 1998; Babin et al., 1999; Wang et al., 2000]. Белок синтезируется в печени, после чего поступает в кровь в виде Са-фосфолипопротеина. Известно, что он отсутствует в крови самцов и имеется в незначительных количествах в крови самок; после эстрадиоловой индукции появляется у самцов и резко нарастает в крови у самок [Нейфах, Тимофеева, 1978]. Данным обстоятельством обусловлен интерес к вителлогенину как к индикатору загрязнений водоемов, так как некоторые сбрасываемые в водоемы соединения имитируют действие эстрогенов и приводят к феминизации популяций рыб, например, эндокринные дизрупторы (EDs) с эстрогенными свойствами [Sonnenschein, Soto, 1998].

Наиболее доступными методами идентификации вителлогенина рыб являются иммунологические методы, основанные на специфическом взаимодействии антител и антигенов, -иммуноблоттинг, иммуноферментные методы. Однако такой подход чаще всего выявляет не один, а несколько белков - претендентов на роль вителлогенина, часть которых связывает антитела специфично, а часть - неспецифически. Проблема заключается в сложности оценки специфичности такого связывания и трактовки полученных результатов не только в случае вителлогенина [Johanning, Specker, 1995; Matsubara et al., 1995, 1999; Finn et al., 2000; Shved et al., 2010], но и других белков [Mohida et al., 1994; BengtLn et al., 2002; Vesely et al., 2006; Liu et al., 2007; Ганжа, 2011].

В сыворотке крови самок рыб с гонадами 4-й стадии зрелости вителлогенин обнаруживается в составе так называемой «половой фракции», локализованной на диск-электро-фореграмме между гамма-2- и альфа-2-глобу-линами: часть белков этой фракции расположена между гамма-2- и гамма-1-глобулинами, другая часть - между гамма-1- и альфа-2 глобулинами [Andreeva, 2001]. Ввиду множественности «половой фракции» мы предлагаем использовать для идентификации вителлогенина методы протеомики - 2D-SDS-электрофорез с последующей масс-спектрометрией MALDI и поиском гомологов в базе данных NCBI. Поскольку аминокислотная последовательность вителлогенина содержит консервативные мо-

тивы, такой подход дает шанс успешной идентификации белка с использованием баз данных, интегрирующих информацию о величинах молекулярных масс продуктов трипсинолиза вителлогенинов у видов (позвоночных, в их числе и рыб) с расшифрованным геномом. Надежная идентификация вителлогенина в крови рыб дает возможность адекватной оценки состояния водной экосистемы в отношении загрязняющих ее соединений с эстрогенными свойствами.

Целью данной работы является идентификация белка вителлогенина в сыворотке крови самок мелкочешуйной красноперки-угай с помощью масс-спектрометрии MALDI.

Материалы и методы

Объекты исследования. В качестве объекта исследования использовали самок мелкочешуйной красноперки-угай Tribolodon brandtii, отловленных в период апреля-мая в Японском море, залив Восток. В работе использовали сыворотку крови самок с гонадами 4-й стадии зрелости. Отбор крови проводили по протоколу [Андреева и др., 2007].

Методы исследования. Применяли фракционирование белков сыворотки крови в ПААГ и масс-спектрометрию MALDI (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация). Масс-спектрометрию выполняли специалисты ИБМХ РАМН. Белки сыворотки крови разделяли в двумерном SDS-электрофорезе [Laemmli, 1970]. Низкий уровень «шумов» продуктов трип-синолиза белков из биологических жидкостей рыб на масс-спектрах позволил в первом направлении электрофореза использовать диск-электрофорез вместо изофокусирования [Andreeva, 2012]. В первом направлении проводили диск-электрофорез в 9%-м ПААГ; в лунку геля вносили 2 мкл сыворотки, содержащей 0,1 -0,2 мг белка, в 4 мкл 40%-й сахарозы. Пре-электрофорез проводили в режиме 2,5 мА, основной электрофорез - 3,0 мА на лунку, при напряжении около 160 В и 300 В соответственно. Далее вырезали полоску геля с анализируемыми белками сыворотки и вымачивали ее в течение 15 минут в денатурирующей смеси, содержащей 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 2%-й SDS, 10%-ю сахарозу и 5%-й р-МЭ. По истечении времени полоску переносили на блок SDS-геля, заливали концентрирующим гелем и полимери-зовали. Каждый образец дублировали внесением в лунку 40 мкл обработанной денатурирующей смесью биологической жидкости, содержащей около 26 мкг белка. Преэлектрофорез проводили в режиме 50 мА, основной электро-

0

форез - 60 мА на камеру, при напряжении около 80 и 100 В соответственно. После электрофореза гели фиксировали 70%-м изопропанолом и окрашивали Coomassie R-250. Из геля вырезали окрашенные красителем участки, содержащие белки, для последующего их трипсинолиза.

Продукты трипсинолиза анализировали с помощью масс-спектрометрии. Масс-спектры ms получали на тандемном MALDI-времяпро-летно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd) в режиме положительных ионов в линейной моде, с использованием реф-лектрона и в тандемном режиме [Гоуфман и др., 2006]. Масс-спектры обрабатывали с помощью программного пакета FlexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия). При помощи программы Mascot (опция «пептидный фингер-принт», www.matrixscience.com) проводили поиск гомологов в базе данных NCBI среди белков всех организмов. Кандидатные белки, имеющие параметр достоверности score >83 в базе данных NCBI, считали определенными надежно (р < 0,05). Спектры фрагментации ms/ms отдельных пептидов получали в тандемном режиме, с использованием программного обеспечения Biotools 3.0 (Bruker Daltonics, Германия) проводили поиск по ms/ms.

В диск-электрофорезе сыворотки крови самок рыб выявлена множественная «половая фракция» (рис. 1: а).

Для масс-спектрометрии с дорожки «половой фракции» на 2D-SDS-геле были отобраны несколько субъединиц, в их числе субъединица с ММ около 26 кДа (рис. 1: б). На примере данной субъединицы рассмотрим принцип идентификации белка вителлогенина. Для идентификации белка получили масс-спектры продуктов его трипсинолиза (рис. 2). Далее проводили поиск гомологов в NCBI. Проведенный по масс-спектрам ms поиск не дал приемлемых результатов. Для субъединицы с ММ 26 кДа кандидатные последовательности были представлены в основном библиотеками кДНК, сконструированными на основе популяций мРНК трески Gadus morhua (score 80), черного толстоголова Pimephales promelas (score 79) и других рыб (Mascot EST vertebrates).

Далее поиск гомологов был продолжен по ms/ms пептидной карты белка. Для фрагмента с молекулярной массой 974,4966 Da обнаружено 50 кандидатных белков, из которых 23 - вителло-генины рыб с критерием достоверности score выше 117: 1) vitellogenin precursor [Pimephales

Рис. 1. Фракционирование белков сыворотки крови красноперки-угай в диск- (а) и БРБ-электрофорезе (б)

а - сыворотка крови самцов (1) и самок (2, 3); вертикальная стрелка указывает направление электрофореза, горизонтальная светлая стрелка указывает на локализацию «половой фракции» в крови самок; б - электрофореграмма белков сыворотки самки красноперки-угай; горизонтальная стрелка указывает направление диск-, вертикальная - БРБ-электрофореза, светлая стрелка указывает «дорожку» «половой фракции», цифра 1 обозначает локализацию субъединицы с молекулярной массой около 26 кДа; М - маркер молекулярной массы РегтеГав, молекулярные массы маркерных белков представлены в килодальтонах (кРа)

®

Рис. 2. Масс-спектр продуктов трипсинолиза субъединицы с молекулярной массой около 26 кДа. По оси абсцисс - отношение величины молекулярной массы к заряду продуктов трипсинолиза белков (т/2), по оси ординат - интенсивность сигнала

promelas] (score 312); 2) vitellogenin [Cyprinus carpio] (score 308); vitellogenin [Carassius auratus] (score 289); vitellogenin 1 precursor [Danio rerio] (score 268); vitellogenin 7 precursor [Danio rerio] (score 262); vitellogenin B1 [Cirrhinus molitorella] (score 247); и др. (Mascot NCBI). На рис. 3 представлена аминокислотная последовательность одного из этих кандидатных белков - Vg карпа.

Аминокислотная последовательность ви-теллогенина карпа из 1353 остатков на 4 % перекрывалась с исследуемым белком крас-ноперки-угай (рис. 3). Для пептида K.LLGYQLAAYFDKPTAR.V score была максимальной (табл.).

Аминокислотная последовательность вителлогени-на Сyprinus carpio и его пептидов, совпадающих с пептидами белка красноперки-угай

Start-End Mr (calc) Score Peptide

4ЗЗ-445 1440,7105 R. EVVMLGYGSMIAR. H + oxidation (M)

4ЗЗ-445 1456,7054 R. EVVMLGYGSMIAR. H+ 2 oxidation (M)

10З5-1050 1811,9880 14 R. LLKQISLIDEETPEGK. A

1174-11В9 1825,9726 129 K. LLGYQLAAYFDKPTAR. V

12З6-124В 1286,6619 76 K. AEAGVLG EFPAAR. L

1249-1255 97З,4869 66 R. LELEWER. L

(http://www.matrixscience.com/)

Таким образом, субъединица с мол. массой около 26 кДа представляет собой С-концевой фрагмент вителлогенина красноперки-угай. Анализ аминокислотной последовательности Уд в йВ Ойй Ы0В1 показал, что этот фрагмент лежит вне области консервативных мотивов.

Выводы

Результаты работы показали успешную идентификацию вителлогенина красноперки-угай с использованием баз данных по белкам рыб с секвенированным геномом с высоким критерием достоверности. Успешная идентификация прошла с использованием МАШ1 в тандемном режиме. Важным выводом работы является возможность идентификации вителлогенина по неконсервативному фрагменту. Полученные результаты предполагают возможность использования подходов протеоми-ки для оценки состояния водоемов по маркерным белкам.

Авторы выражают искреннюю благодарность к. б. н. М. В. Серебряковой (ИБМХ РАМН) за масс-спектрометрический анализ белков.

0

1 M R AWL AL T V ALVASQQINL VPEFTPGKTY VYNYEALLLG GLPHEGLARA

51 GIKVNSKVHL SAVTENTFLM KLMDPLIYEY AGIWPKDPFV PATKLTSALA

101 AQLQIPIKEE YANGWGKVF APAGVSPTVL NLHRGILNIL QLNLKKTQNI

151 YELQEAGAQG VCRTHYVISE DPKANHITVT KSKDLSHCQE RIMKDVGLAY

201 TERCAECTER IKSLIETATY NYIMKPASAG VLITEATVEE VHQFS PFKEI

251 HGAAQMEAKQ TLAFVEIEKT LWPIKADYL ARGSLQYEFA TEILQT PIHL

301 MKISDAPAQI IEVLKHLVAN NVAMVHEDAP LKFVQLIQLL RVSTLENIEA

351 IfflAQFKDKPA YRRWLLDALP SVGTPVIIKF IKEKFLAGEL TLPEFIQALV

401 VALQMVTADL DTIQLTASLA MHEKIAKMPA LREVVMLGYG SMIARHCVAV

451 PTCSAELLRP IHEIAAEAT S KNDIREITLA LKVLGNAGHP ASLKPIMKLL

501 PGLRTAAS SL PLRVQVDAIL ALRNIAKKEP KLVQPVALQL VLDRALHPEV

551 RMVACIVLFE SKPSVALVSS LAGALKTETN MHWSFAYSH IKSLTRITAP

601 DMAAVAGAAN VAIKLMSRKL DRLSFRF SRA LQLDYYHT PL MIGAAGSAYM

651 INDAATILPR AWAKARAYL AGAAADVL EI GVRTEGIQEA LLKSPAADES

701 VDRITKIKRT LRALANWKDL PNDQPLASVY IKFLGQEVAF VKIDKTIIEE

751 AIPIVTGPKP RELLKAALKA LQEGIAWQYA KPLLAAEVRR ILPTAVGVPM

801 ELSLYTAAVA AASVNVKATI T PPLPEEIET MTLEQLKKTD VQLQAEARPS

851 IALQTEAVMG VNTALIQAAV MARGKIRTIA PVKVAARADI LKGNYKVEAL

901 PVEVPEHIAT LSFETLAWR NIEEPTAERT VPLVPELAVQ NSQTHSDYLS

951 SENQDEVPVR APAPFDKTLC LAVPYIEIKG CVELHSHNAA FIRNDPLYYI

1001 IGQHSARATV ARAEGPAVER LELEVQVGPR AAE RLLKQIS LIDEETPEGK

1051 AFLLKLKEIL ETEDKNRPVS SESRSSSSSR SNRSSSSSSS ssssssssss

1101 MSSSRVSKTA TIME PFRKFH KDRYLAPHGA SKKVSSGS SA SSFERIQKQA

1151 KFLGNAVPPV FAVIARAVRV DHKLLGYQLA AYFDKPTARV QIWSSIAEN

1201 DNLKICVDGA LLSKHKVTAK LAWGPECQQY AVTAKAEAGV LGEFPAAILLE

1251 LEWERLPITV TTYAKKMSKH IYMAAFQAGF RLERVMNSEK EIELTLALPH

1301 QRSLNVIFRI PEMTLSRMGI HLPYAIPINP DGSLSIQIDE DILSWIQRHI

1351 KEE

Рис. 3. Аминокислотная последовательность вителлогенина карпа. Mascot, Protein View: gi| 151558991 vitellogenin [Cyprinus carpio]. Жирным шрифтом выделены перекрывающиеся пептиды карпа и красноперки-угай.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 13-04-00427-а).

Литература

Андреева А. М., Чалов Ю. П., Рябцева И. П. Особенности распределения белков плазмы между специализированными компартментами внутренней среды на примере карпа Сурппив сагро (1_.) // Журн. эвол. биохимии и физиологии. 2007. Т. 43, № 6. С. 501-504.

Ганжа Е. В. Некоторые показатели иммунитета триплоидной радужной форели ОпсогЬупсЬив тук1вв при её культивировании в условиях южного Вьетнама // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб: материалы международной конференции (Борок, 2011 г.). Москва, 2011. С. 90-95.

Гоуфман Е. И., Мошковский С. А., Тихонова О. В., Лохов П. Г., Згода В. Г., Серебрякова М. В., Торопыгин И. Ю., Власова М. А., Арчаков А. И., Сафарова М. Р., Макаров О. В. Протеомное исследование термостабильной фракции сыворотки пациентов с различными опухолями с применением двумерного электрофореза // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 4. С. 445-453.

Нейфах А. А., Тимофеева М. Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития. М.: Наука, 1978. 307 с.

Anderson T. A., Levitt D. G., Banaszak L. J. The structural basis of lipid interactions in lipovitellin, a soluble lipoprotein // Structure. 1998. Vol. 6 (7). P. 895-909. doi:10.1016/S0969-2126(98)00091-4.

Andreeva A. M. Serum gamma-globulins of the fishes // Journal of Ichthyology. 2001. V. 41 (6). P. 464470. Original Russian text is published in Voprosy Ikhtiology, 2001, V. 41 (4). P. 550-556.

Andreeva A. M. Structural and functional organization of fish blood proteins. N. Y.: Nova Science Publisher, 2012, 188 p.

Babin P. J., Bogert J., Kooiman F. P., Van Marrewijk W. J. A., Van der Horst D. J. Apolipophorin II/I, apolipoprotein B, vitellogenin, and microsomal triglyceride transfer protein genes are derived from a common ancestor // J. Mol. Evol. 1999. Vol. 49, N 150. P. 1-9.

Bengt^n E., Quiniou S. M., Stuge T. B., Katagiri T., Miller N. W., Clem L. W., Warr G. W., Wilson M. The IgH locus of the channel catfish, Ictalurus punctatus, contains multiple constant region gene sequences: different genes encode heavy chains of membrane and secreted IgD // J. Immunol. 2002. Vol. 169 (5). P. 2488-2497.

Finn R. N., Fyhn H. J., Norberg B., Munholland J. and Reith M. Oocyte hydration as a key feature in the adaptive evolution of teleost fishes to seawater // Proc. 6 Int. Symp. Reprod. Physiol. Fish. 2000. P.289-291.

0

Johanning K. M., Speaker J. L. Characterization of yolk proteins during oocyte development of tilapia, Oreochromis mossambicus // Comp. Biochem. Physiol. 1995. Vol. 112B. P. 177-189.

Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature (Gr. Brit.). 1970. Vol. 227 (4), N 5259. P. 680-685.

Liu J. L., Anderson G. P., Goldman E. R. Isolation of anti-toxin single domain antibodies from a semisynthetic spiny dogfish shark display library // BMC Biotechnology. 2007. 7:78. doi:10.1186/1472-6750-7-78.

Matsubara T., Adaahi S., Ijiri S. and Yamauahi K. Change of lipovitellin during in vitro oocyte maturation in Japanese flounder Paralichthyes olivaceus. Fich. 1995. Sci.61:478-481.

Matsubara T., Ohkubo N., Andoh T., Sullivan C. V., Hara A. Two forms of vitellogenin, yielding two distinct lipovitellins, play different roles during oocyte maturation and early development of barfin flounder, Verasper moseri, a marine teleost spawning pelagic eggs // Dev. Biol. 1999. Vol. 213 (1). P. 18-32.

Mohida K., Lou Y.-H., Harat A., Yamauahi K. Physical biochemical properties of IgM from a teleost fish // Immunology. 1994, 83. P. 675-680.

Shved N. A., Syasiana I. G., Kumeiko V. V. Enzyme -linked immunosorbent assay (ELISA) measurement of vitellogenin in plasma and liver histopathology in barfin plaice Liopsetta pinnifasciata from Amursky Bay, Sea of Japan // Fich Physiol. Biochem. 2010. Vol. 37, N 4. P. 781-799.

Sonnensahein C., Soto A. M. An updated review of environmental estrogen and androgen mimics, antagonists // J. Steroid Bioghem. Mol. Biol. 1998. Vol. 65. P. 143-150.

Vesely T., Resahova S., Pokorova D., Hulova J., Nevorankova Z. Production of monoclonal antibodies against immunoglobulin heavy chain in common carp (Cyprinus aarpio L.) // Veterinarni Medicina. 2006 (5), 51. P. 296-302.

Wang H., Yan T., Tan J. T. T., Gong Z. A zebrafish vitellin gene (vg3) encodes a novel vitellogenin without a phosvitin domain and may represent a primitive vertebrate vitellogenin gene // Gene. 2000. Vol. 256. P. 303-310.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Андреева Алла Михайловна

зав. ЦКП «Молекулярные технологии», д. б. н. Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН

пос. Борок, Некоузский район, Ярославская обл., Россия, 152742

эл. почта: aam@ibiw.yaroslavl.ru тел.: (48547) 24119

Федоров Роман Александрович

младший научный сотрудник ЦКП «Молекулярные технологии»

Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН

пос. Борок, Некоузский район, Ярославская обл.,

Россия, 152742

эл. почта: fedor-off@yandex.ru

Рябцева Ирина Павловна

научный сотрудник ЦКП «Молекулярные технологии» Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН

пос. Борок, Некоузский район, Ярославская обл., Россия, 152742

эл. почта: molbiol@ibiw.yaroslavl.ru

Ламаш Нина Евгеньевна

старший научный сотрудник

Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского

Дальневосточного отделения РАН

лаб. фармакологии

ул. Пальчевского, д. 17, Владивосток,

Россия, 690059

Дальневосточный федеральный университет ул. Суханова, 8, Владивосток,

Россия, 690950

эл. почта: ninalamash@yandex.ru

Филиппова Александра Эльдаровна

старший лаборант ЦКП «Молекулярные технологии» Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН

пос. Борок, Некоузский район, Ярославская обл.,

Россия, 152742

эл. почта: antury@yandex.ru

Andreeva, Alla

I. P. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences,

152742, Borok, Nekouzskiy District, Yaroslavl Region Russia

e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru tel.: (48547) 24119

Fedorov, Roman

I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences,

152742, Borok, Nekouzskiy District, Yaroslavl Region Russia

e-mail: fedor-off@yandex.ru

Ryabtseva, Irina

I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences,

152742, Borok, Nekouzskiy District, Yaroslavl Region Russia

e-mail: molbiol@ibiw.yaroslavl.ru

Lamash, Nina

A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences 17 Palcheyskogo St.,

690059 Vladivostok, Russia Far Earsten Federal University,

8 Sukhanova St., 690059 Vladivostok, Russia e-mail: ninalamash@yandex.ru

Philippova, Alexandra

I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences,

152742 Borok, Nekouzskiy District, Yaroslavl Region Russia

e-mail: antury@yandex.ru