CC BY
33
УДК 597.554.3:577.122 "313"
ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ПЛАЗМЫ У КОСТИСТЫХ РЫБ
А. М. Андреева, И.П. Рябцева, Р. А. Федоров
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузскийр-н, e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru
Исследовали организацию низкомолекулярной фракции плазмы и белковые комплексы в её составе у пресноводных и морских костистых рыб. С помощью MALDI в составе фракции идентифицированы ге-мопексины, негомологичные аполипопротеины и ингибиторы сериновых протеиназ. У пресноводных рыб белковые комплексы были организованы единообразно - из олигомерных форм гемопексина и апо-липопротеинов. Весной комплексы из олигомеров перестраивались в комплексы из мономерных форм этих белков. У морских видов имело место разнообразие в организации НМ-фракций плазмы. Их белковые комплексы отличались по составу от комплексов "пресноводного" типа и обнаружены не у всех морских видов, возможно, по причине отсутствия у некоторых из них аполипопротеинов. Обсуждается участие белковых комплексов плазмы в стабилизации обменных процессов в организме рыб. Предполагается, что организацию протеома плазмы и белковых комплексов в его составе определили особенности становления внутренней жидкой среды организма в эволюции рыб.
Ключевые слова: костистые рыбы, плазма, белки, MALDI
ВВЕДЕНИЕ
Одной из особенностей протеома плазмы рыб является присутствие в нем белковых комплексов из олигомеров транспортных белков в составе низкомолекулярной фракции (Андреева и др., 2015a). Протеом плазмы активно исследуется у разных видов рыб (Tsai et al., 2004; Lucitt et al., 2008; Babaei et al., 2013; Braceland et al., 2013; Low et al., 2013; Dietrich et al., 2014). За редким исключением, он включает в себя практически все характерные для позвоночных белковые семейства (Andreeva, 2012). Использование современных подходов в его исследовании (2D- электрофорез, трипсинолиз, хроматография, масс-спектрометрия MALDI) позволило обнаружить в его составе до тысячи и более полипептидов - продуктов отдельных генов, как у высших позвоночных - млекопитающих (Anderson et al., 2004), так и у низших - рыб (Babaei et al., 2013).
Белковые комплексы обнаружены в плазме только у представителей низших таксонов, например, у Teleostei и Elasmobranchii (Андреева, Федоров, 2010; Андреева и др., 2015b). В плазме млекопитающих в норме они отсутствуют; их появление сопутствует, как правило, ряду заболеваний, в том числе, нейро-дегенеративным патологиям (Margulis et al., 2006; Lazarev et al., 2013) и диабету (Ali Han et al., 2007).
Известно, что белки-олигомеры эффективно регулируют осмотическое давление жидкости внутри клетки. Между тем, участие внеклеточных олигомерных белков в осморегуляции считается проблематичным из-за возможной "утечки" низкомолекулярных полипептидных цепей из внутрисо-судистого пространства в интерстициальное (Шульц, Ширмер, 1982). У пресноводных Teleostei содержание белковых комплексов в плазме достигает 20% и выше (Андреева, 2010), и физиологическая целесообразность их присутствия в крови остается загадкой. Цель настоящего исследования - сравнительный анализ организации низкомолекулярных фракций плазмы и поиск в их составе белковых комплексов у пресноводных и морских костистых рыб.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. В работе использовали костистых морских и пресноводных рыб:
- султанку (барабульку) Mullus barbatus, звездочета Uranoscopus scaber, морского ерша (скор-пену) Scorpaena porcus L., бычка кругляка Neogobius melanostomus P. и мартовика Mesogobius batra-chocephalus P., морского налима Gaidropsarus mediterraneus L., зеленушку Symphodus tinca L. (Черное море); речную камбалу Platichthys ^flesus, лиманду Limanda limanda, зубатку Anarhichas lupus, треску Gadus morhua, бычка керчакаMyoxocephalus scorpius (Белое море);
- щуку Esox lucius L., судака Stizostedion lucioperca L., окуня Perca fluviatilis L., карпа Cyprinus carpio L., леща Abramis brama L., синца Abramis ballerus L., плотву Rutilus rutilus L., карася серебряного Carassius auratus L. (Рыбинское водохранилище, р.Волга).
Кроме диких видов в работе использовали карпа Cyprinus carpio L, содержащегося в экспериментальных прудах ИБВВ РАН. В экспериментах по акклимации пресноводных рыб к условиям повышенной солености использовали лещей, подрощенных на экспериментально-прудовой базе ИБВВ РАН. Половозрелых лещей отлавливали в мае в р.Волга; далее потомство, полученное в результате
естественного нереста производителей в экспериментальных нерестовых прудах, подращивали в нагульных прудах до 2+.
Определение стадии зрелости гонад. Стадии зрелости гонад половозрелых рыб определяли по шкале зрелости половых продуктов (Сакун, Буцкая, 1968).
Получение плазмы крови рыб. Кровь отбирали из хвостовых сосудов рыб сразу после их отлова. Для получения плазмы кровь собирали в пробирки с 1%-ным раствором (m/V) гепариноида, осевшие эритроциты удаляли центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 мин при 14 000 g.
Получение тканевой жидкости. Мышечную жидкость отбирали выше боковой линии между краем жаберной крышки и спинным плавником. С помощью ножниц с длинными лезвиями делали кожный разрез и микронаконечником дозатора оттягивали кожу в глубине «кармана» так, чтобы создать в нём разрежение. Благодаря «подсасывающему» эффекту этого разрежения мышечная жидкость собиралась в «кармане» в количестве нескольких микролитров, которые отбирали для анализа. При необходимости использовали «бумажный метод» отбора мышечной жидкости (Андреева и др., 2015b). Перед электрофорезом образцы ТЖ центрифугировали.
Электрофоретические методы. НМ-фракцию оценивали по числу белков, молекулярной массе MW и электрофоретической подвижности Rf белков, и расположению на электрофореграмме в 7.5%-ном ПААГ.
Способ организации (мономер/олигомер) белков определяли по расположению, числу и молекулярной массе (MW) «пятен» белков в неденатурирующем 2D-электрофорезе (2D-E) в градиенте концентраций 5-40% ПААГ и денатурирующем электрофорезе — в 11%-ном ПААГ с 8 М мочевиной (Creighton, 1979) и 12.5%-ном Ds-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях (Laemmli, 1970). В первом направлении проводили диск-электрофорез в 7.5- или 4.9%-ном ПААГ.
В качестве маркеров MW использовали полимеры сывороточного альбумина человека HSA (67, 134, 201, 268, 335 кДа) и овальбумина ОА (45, 90, 135 кДа) и PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (11, 17, 28, 36, 55, 72, 95, 130, 250 кДа) (Fermentas). Денситометрирование, расчет относительного содержания и MW белков проводили с помощью программы ONE-Dscan, Ver 1.31 (Scananalytic Inc.).
Экспериментальная акклимация неполовозрелых лещей к условиям повышенной солености воды. Для исключения влияния фактора созревания гонад на капиллярную фильтрацию использовали неполовозрелых лещей возраста 2+, полученных в результате естественного нереста производителей и подрощенных в экспериментальных прудах. Рыб акклимировали к воде различной солености — 8, 10 и 11.5%о в соответствии с рекомендациями по акклимации пресноводных рыб в диапазоне "критической солености" (Хлебович, 1974; Мартемьянов, 1989), добавляя соль NaCl в аквариумы в расчете 1 г/л в сутки. В контрольный аквариум соль не добавляли. В аквариумах поддерживали устойчивый температурный и гидрохимический режим.
Масс-спектрометрия MALDI. Операции по подготовке проб анализируемых белков для масс-спектрометрии выполнены в соответствии с протоколом, описанным ранее (Андреева и др., 2015а,Ь). Масс-спектры (ms) продуктов трипсинолиза получали на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflextreme BRUKER ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона в диапазоне масс 700-4500 m/z. Точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 50 ррм. При необходимости получали спектры фрагментации ms-ms отдельных пептидов. Для их получения использовали тандемный режим прибора, точность измерения фрагментных ионов была не ниже 1 Да. Масс-спектры обрабатывали с помощью програмного пакета FlexAnalysis 2.4 ("Bruker Daltonics", Германия).
Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot (опция "пептидный фингер-принт", www.matrixscience.com). Поиск проводили в DB NCBI среди белков всех организмов и/или EST vertebrates. Кандидаты, имеющие параметр достоверности score>83, считали определенными надежно (p < 0.05). С использованием ПО Biotools 3.0 ("Bruker Daltonics", Германия) проводили поиск кандидатов по объединенным данным ms+(ms-ms). Если кандидатные последовательности обнаруживались в неаннотированной базе данных EST в виде библиотек кДНК, то реконструированную на основе мРНК аминокислотную последовательность вставляли в Protein BLAST и далее задавали поиск кандидатного белка среди белков всех позвоночных.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Организация НМ- фракции белков плазмы у пресноводных рыб.
В диск-Е белков плазмы низкомолекулярная фракция (НМ-фракция) располагается ниже бэта-глобулинов трансферринов, специфически окрашивающихся реактивом Мюллера (Андреева и др., 2015a,b) (рис.1, табл.1).
Рис.1. Разделение белков плазмы рыб в диск-Е (а) и 2D-SDS-E (восстанавливающие условия) (b,c): a- леща (1, 2), синца (3, 4), уклеи (5), чехони (6), густеры (7), карпа (8-11); b - карпа; с - щуки. М - PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas). Белки НМ-фракции выделены пунктиром. "Alb" и "Prealb" - подфракции. Tf, Hx, Fet, Spi, Apo-I, Аро-14 - белки НМ-фракции. Белая стрелка указывает на трансферрин. Пояснения в тексте.
У всех исследованных видов НМ-фракции были организованы единообразно - из двух подф-ракций. Первая содержала доминирующий белок, на долю которого приходилось свыше 20% всего белка плазмы. На электрофореграмме он имел вид большого пятна. Специфическое связывание доминирующим белком альбуминспецифичного красителя синего Эванса (Андреева и др., 2015a,b) позволило считать его альбуминоподобным и обозначать далее как подфракцию Alb в неденатурирую-щем электрофорезе (рис.1). Вторая подфракция состояла из более подвижных в электрическом поле по сравнению с Alb белков. По аналогии с белками млекопитающих мы обозначили их как преальбу-мины (Prealb). Такая структура НМ-фракции была характерна не только для карповых, но и для щу-ковых и окуневых рыб.
В 2D-SDS-E структура НМ-фракции у всех исследованных видов была единой. Фракция вплотную примыкала к белку "навигатору" - трансферрину (рис.1, табл. 1).
2. Идентификация белков НМ- фракции плазмы пресноводных видов на примере карпа.
Идентификацию белков НМ-фракции проводили с помощью MALDI. Для идентификации использовали белки карпа (табл.1) как вида с секвенированным геномом (BioProjects:PRJEB7241, NCBI; 5036 аминокислотных последовательностей в DB Proteins NCBI). Было отобрано семь белков НМ-фракции (рис.1). В таблице 1 представлено по одному кандидату с наибольшей величиной score для каждого белка.
В подфракции Alb мы идентифицировали четыре белка. Для белка с экспериментальной MW около 64 кДа гомологи были обнаружены в неаннотированной базе EST. Кандидатные последовательности с высокими величинами score были представлены библиотеками кДНК, сконструированными на основе популяций мРНК печени карпа (CF662379).
С помощью Protein BLAST найден гомолог 64 kDa-белка- "warm temperature acclimation-related 65 kDa protein". Этот белок содержит в своей структуре "Hemopexin-like''-повторы, связывает гем и транспортирует его в печень (GenBank ACO51168.1) (Kinoshita et al., 2001). На рисунке 1 (b,c) он соответствует белку Hx. Для 53 kDa-белка кандидатом оказался фетуин Fet. Подобно альбумину, фе-туин транспортирует в крови метаболиты. В своей структуре он содержит цистатин-подобный домен, характерный для семейства ингбиторов цистеиновых протеиназ Spi (Tsai et al., 2004). 20 kDa- и 14 kDa -белки идентифицированы как A-I и Аро-14 аполипопротеины соответственно (табл.1).
Таблица 1. Идентификация трансферрина и белков НМ-фракции плазмы карпа*
Обозначение Белка
Кандидатный белок (NCBI)
Accession Number (NCBI)
MW, kDa calc/obs
Score
Coverage %
Tf
Hx
Fet
ApoA-I
Apo-14
Hx
transferrin variant C
[Cyprinus carpio]
Warm temperature acclimation-related 65 kDa protein [Hy-pophthalmichthys nobilis]
Fetuin long form
[Cyprinus carpio]
apolipoprotein A-I
[Cyprinus carpio]
14 kDa apolipoprotein
[Cyprinus carpio]
gi|189473159
GenBank ACO51168.1
gi|29501368
gi|13445027
gi|385865216
Spi
Spi
Warm-temperature-accli-mation- gi| 14388583 related-65 kDa-protein [Cyprinus carpio]
serine protease inhibitor gi|439153
[Cyprinus carpio]
Alpha-1-antitrypsin homolog; gi|416561 Flags: Precursor
[Cyprinus carpio]_
73.134/63.8
/63.4
51.666/52.8
20.797/22.0
15.718/12.8
50.013/54.6
45.846/48.5
41.873/43.2
159
173
144
260
241
223
129
133
38
43
63
73
39
11
34
*кандидаты к белкам см на рис.1; обозначение белка см на рис.1
В подфракции Prealb мы идентифицировали три белка: белок "warm temperature acclimation-related 65 kDa", проявляющий свойства гемопексина Нх, и два серпина - ингибитора сериновых про-теиназ Spi (табл.1).
Обе подфракции карпа содержат один и тот же белок со свойствами гемопексина "«warm-temperature-acclimation-related-65 kDa" с различными показателями MW — около 64 и 54 кДа соот-ветветственно, что свидетельствует о наличии в НМ-фракции различных его модификаций. Для разных кандидатов библиотеки кДНК охватывают разные области белка - N-концевую для белка подфракции Alb (GenBank ACO51168.1), и всю аминокислотную последовательность (1-439) для белка из подфракции Prealb (gi| 14388583).
3. Организация НМ-фракции белков плазмы у морских рыб.
У морских видов структура НМ-фракции не была единой (рис.2). У одних видов фракция была организована по "пресноводному" типу, у других отличалась от него отсутствием в диск-Е массивного доминантного белка или в 2D-SDS-E аполипопротеина А-I в составе фракции.
Для НМ-фракций плазмы морских рыб использование Tf в качестве "навигатора" на про-теомной карте плазмы было не всегда оправдано. В ряде случаев фракция располагалась правее от Tf, как и у пресноводных костистых, в других случаях типичные для НМ-фракции белки располагались вокруг (или ниже) Tf (рис.2).
Сравнительный анализ протеомных карт плазмы разных видов морских Teleostei выявил разнообразие их НМ-фракций как по положению на карте относительно Tf, так и по наличию/отсутствию на ней переносчиков липидов - аполипопротеинов. У камбалы, трески, бычков, звездочета оба аполипопротеина (А-I и Аро-14) присутствовали на карте; у султанки, зеленушки и морского налима отсутствовали (рис.2); у скорпены обнаружен один аполипопротеин А-I.
4. Идентификация белков НМ-фракции плазмы морских видов рыб.
Идентификацию белков проводили на примере речной камбалы, у которой на сегодняшний день секвенировано 596 нуклеотидных последовательностей (ДНК, РНК) (DB Genoms, NCBI) и 364 аминокислотных (DB Proteins, NCBI). В составе НМ-фракции её плазмы были идентифицированы те же белки, что и у карпа - белок со свойствами гемопексина ("warm- ... protein"), ингибиторы протеи-наз серпины и аполипопротеины (табл.2).
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
bed
Рис.2. Диск-Е (а) и 2D-SDS-E (b, c, d) плазмы морских видов рыб: а — султанки (1), морского налима (2), бычков мартовика (3) и кругляка (4), звездочета (5), скорпены (6), речной камбалы (7-10), лиманды (11), зубатки (12) и трески (13); b — бычка мартовика, c — речной камбалы, d — зеленушки. Обозначения — см рис.1.
Таблица 2. Идентификация белков НМ-фракции плазмы речной камбалы*
Обозначение белка Кандидатный белок (NCBI) Accession number (NCBI) MW calc/obs, kDa Score Coverage %
Hx warm temperature acclimation related-like 65kDa protein [Harpagifer antarcticus] gi| 169807830 48.372/64.2 116 20
Hx warm-temperature-acclimation-related-65kDa- protein-like- protein precursor [Takifugu rubripes] gi|74095891 49.438/64.2 79 2
Spi alpha-1-antitrypsin [Epinephelus coioides] ACJ05607.1 — /56.3 265 62
Apo A-I apolipoprotein AI precursor [Platichthys flesus] gi|60417202 29.374/23.6 217 53
Apo-14 14 kDa apolipoprotein [Platichthys flesus] gi|60417188 15.763/12.1 106 56
*кандидаты к белкам см. на рис.2; обозначение белка см. на рис.2
5. Поиск белковых комплексов в составе НМ-фракций плазмы у пресноводных рыб.
Сравнительный анализ протеомных карт плазмы рыб в 2Б-Е выявил сложную структуру доминирующего белка (А1Ь). У плотвы доминирующий белок и в ПААГ с 8М мочевиной и в SDS-ПААГ (восстанавливающие условия) диссоциировал на шесть - семь субъединиц. Произведен расчет величин MW белков на дорожке доминирующего белка: в градиенте ПААГ около 120 кДа; в ПААГ с мочевиной — около 30 (2), 65, 80-90 (з) и 200 кДа; в SDS-ПААГ — около 10, 14, 26, 40, 63 и 65 кДа (рис.3). Полученные результаты свидетельствуют о наличии в НМ-фракции плазмы плотвы белкового комплекса, стабилизированного нековалентными (в т.ч. водородными) связями.
Рис.3. 2Б-Б белков плазмы плотвы в градиенте концентраций 5-40% ПААГ (а), в ПААГ с 8М мочевиной (Ь) и 8Б8-ПААГ (восстанавливающие условия) (с). Серая стрелка указывает на дорожку доминирующего белка. Пояснения в тексте.
Сходные результаты получены и для других видов пресноводных рыб. Сравнив их с протеомом НМ-фракции плазмы карпа, можно сделать вывод о наличии в составе белковых комплексов разных видов пресноводных костистых рыб одних и тех же белков — гемопексина (Нх) и аполипопротеинов А-1 и Аро-14. В белковом комплексе плазмы плотвы они представлены олигомерными формами: мономерами (А-1, Нх), димерами (Нх), тетрамерами (А-1), октамерами (А-1) и олигомерами более высокого порядка (аро-14). Анализ масс-спектров нативных комплексов и денатурированных белков (субъединиц) показал присутствие в первых — сигналов от Нх, Аро А-1 и Аро-14 (Андреева и др., 2015а).
6. Выявление белковых комплексов в составе НМ-фракций плазмы у морских рыб.
"Морской" тип НМ-фракций плазмы отличается от "пресноводного" отсутствием единообразия. У видов, имеющих в протеоме плазмы аполипопротеины (речная камбала, треска, бычки), обнаружены и белковые комплексы. У султанки, зеленушки и морского налима аполипопротеины отсутствовали; не обнаружены у них и белковые комплексы (рис.4).
М к Да
— 263, 201 = 134, 90
-67
-43
т-Д
М кДа
- 114, 90
_ 67
4!
Л-
М кДа
— 230 ^130 - 95
— 72
— 55
_ 36
- 28
- 17
- II
Рис.4. 2Б-Б белков плазмы речной камбалы (а, Ь, с) и скорпены (4 е, : в градиенте концентраций 5-40% ПААГ (а,ф, в ПААГ с 8М мочевиной (Ь, е) и 8Б8-ПААГ (восстанавливающие условия) (с, :0. НМ-фракция белков плазмы выделена пунктиром. Белая стрелка указывает на трансферрин. Пояснения в тексте.
У речной камбалы белки НМ-фракции располагаются на протеомной карте по обе стороны от трансферрина. Слева от Tf на протеомной карте расположено четыре неденатурированных белка; им соответствует 10 денатурированных белков в ПААГ с мочевиной и SDS-ПААГ (рис.4а, b, c). В градиенте ПААГ, в области справа от Tf, расположены шесть неденатурированных белков. Им соответствует около 10-ти денатурированных белков в ПААГ с мочевиной и SDS-ПААГ. Сравнительный анализ MW и количества неденатурированных и денатурированных белков на 2D-E плазмы камбалы позволяет предположить присутствие в ней белковых комплексов с MW от 90 до 120 кДа из мономеров Аро А-I, димеров Аро A-I и Аро-14, тетрамеров Аро A-I, а также более высокоорганизованных вариантов Аро-14.
У зеленушки, на протеомной карте плазмы которой не обнаружено аполипопротеинов, сопоставление количества белковых пятен (16 — в градиенте ПААГ; 17 — в ПААГ с мочевиной и 24 — в SDS-ПААГ) и величин MW в области НМ-фракции, не позволило предположить присутствие белковых комплексов. Такой же вывод сделан нами в отношении султанки, морского налима и скорпены (рис.4).
Таким образом, если у пресноводных видов структура протеома НМ-фракции плазмы и белковых комплексов в её составе отличается единообразием, то у морских видов можно выделить два типа протеома НМ-фракции - один сходен с "пресноводным" (по структуре и наличию комплексов), а второй отличается отсутствием комплексов.
7. Структурные реорганизации белковых комплексов плазмы в ходе сезонной динамики пресноводных рыб.
По структуре НМ-фракция была представлена двумя дискретными формами, которые мы
Рис.5 . "Базовый" (1,2) и "пластический" (3,4) типы НМ-фракции плазмы у леща.
Для НМ-фракции базового типа характерны: 1) минимальные показатели электрофоретической подвижности Rf доминирующего белка Alb, 2) максимальная гетерогенность подфракции Prealb и минимальные показатели Rf для её наиболее подвижного белка. Для НМ-фракции пластического типа характерны: 1) максимальные показатели Rf доминирующего белка Alb, 2) минимальная гетерогенность подфракции Prealb и максимальные показатели Rf для её наиболее подвижного белка (рис.5).
MW неденатурированного доминирующего белка базового типа (около 120 кДа) всегда была выше, чем у белка пластического типа (около 100 кДа).
У половозрелых рыб базовый тип НМ-фракции был характерен для летне - осеннего (нагул) и зимнего периодов, а пластический - для весеннего (преднерестового и нерестового) периода. Весной при смене базового типа НМ-фракции плазмы на пластический, MW неденатурированного белкового комплекса плазмы снижалась со 120 до 100 кДа. При этом субъединичный состав комплекса оставался постоянным. Вероятно, в этот период доминирующий белок плазмы, организованный по типу белкового комплекса, претерпевал реорганизацию. При этом 120 кДа - комплексы из димеров "«warm temperature..." белка (Hx) и олигомеров аполипопротеинов с липидами преобразовывался в комплекс из трех мономеров — "warm temperature ..."- белка (Нх) и двух аполипопротеинов.
8. Адаптации лещей к условиям повышенной солености в экспериментальных условиях.
При содержании лещей в соленой воде 8 и 10%о нами не было обнаружено достоверных изменений относительного содержания (ОС) отдельных белков НМ-фракции плазмы по сравнению с контрольной группой. Выраженные изменения появились при помещении рыб в условия сублетальной солености — 11.5%о. Они сопровождались накоплением в мышечной жидкости 30 кДа- и 16 кДа - белков, являющихся мономерными формами аполипопротеинов Аро А-I и Аро-14 соответственно (рис.6).
Мономерные формы Аро присутствовали в мышечной жидкости лещей и в контрольной группе рыб (пресная вода) (рис.6). Но только при содержании рыб в соленой воде количество мономеров Аро в мышечной жидкости достигало максимальных по сравнению с контролем величин (рис.7). Анализ содержания белков с разной MW в жидкостях организма рыб в условиях нарастающей солености показал, что в плазме относительное содержание 30-70 кДа- белков оставалось стабильным на всем соленостном диапазоне, между тем, как в мышечной жидкости тенденции снижения относи-
назвали "базовой" и "пластической" (рис.5).
тельного содержания для 60-70 кДа-белков и нарастания содержания для 30 кДа-белка сопровождались снижением содержания белкового комплекса (рис.7).
, ЗОкДа-белсж 16 кДа-белок
Рис.6. Электрофорез в градиенте концентраций ПААГ белков плазмы (1-3) и мышечной жидкости (4-6) леща. Серой стрелкой выделен белковый комплекс. Пояснения в тексте.
При 11.5%о ОС белковых комплексов в плазме лещей снижалось почти в два раза, в мышечной жидкости в 3-4 раза; при этом, ОС Аро А-1 в мышечной жидкости увеличивалось в 2 раза по сравнению со средними в группе рыб показателями (рис.7). Данное обстоятельство позволяет предположить, что при повышенной солености пул мономерных аполипопротеинов в мышечной жидкости пополняется за счет диссоциации белкового комплекса из олигомерных форм аполипопротеинов.
Рис.7. Динамика относительного содержания (%) белков НМ-фракции с различной молекулярной массой — 30-70 кДа, 30 кДа (Аро А-I), и 120 кДа (белковый комплекс), в сыворотке крови (а) и мышечной жидкости (b) лещей 2+. 1 — пресная вода, 2 — 8%0, 3 — 10%о , 4 — 11.5%«.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты выполненной работы однозначно указывают на присутствие белковых комплексов в составе НМ-фракции плазмы у пресноводных костистых рыб, между тем, как в крови морских Teleostei комплексы обнаружены не у всех исследованных видов. У пресноводных рыб выявлена единая структура как НМ-фракций, так и белковых комплексов в их составе. С помощью MALDI в составе
фракции идентифицированы гемопексины, аполипопротеины и ингибиторы протеиназ серпины. У исследованных видов (карповых, окуневых и щуковых) обнаружены единые по составу белковые комплексы из трех транспортных белков - гемопексина (переносит гем) и негомологичных аполипо-протеинов А-I и Аро-14 (переносчики липидов). Структурная организация этих комплексов меняется в течение года с 120 кДа-формы (базовый тип) на 100 кДа-форму (пластический тип). При этом, 120 кДа -комплексы, состоящие из олигомеров гемопексина и аполипопротеинов и липидов, преобразуются в 100 кДа-комплексы из мономерных форм тех же белков.
Годовая динамика белковых комплексов, вероятно, отражает особенности метаболизма рыб, а именно, доминирующую роль липидов в их энергетическом обмене (Durliat et al., 2000; Shen et al., 2000; Jiong Chen et al., 2009), в отличие от млекопитающих, в энергетике которых доминируют углеводы. Обнаружение мономерных форм гемопексина и аполипопротеинов в плазме (Andreeva et al., 2015a) и мышечной жидкости рыб, может отражать процесс транспорта липидов к различным тканям. Ведь у рыб, в отличие от млекопитающих, аполипопротеины (А-I) участвуют не только в обратном транспорте холестерина от тканей к печени, но и в его прямом транспорте от печени к тканям (Ando, Mori, 1993), взяв на себя функции переносчика липидов альбумина (у млекопитающих) (De Smet et al., 1998).
Между тем, у обитающих в море рыб единства в организации НМ-фракций плазмы не обнаружено. Различия между видами касаются и места локализации фракции на протеомной карте относительно трансферрина, и структуры фракции. У некоторых видов (треска, звездочет и бычки) НМ-фракция плазмы была организована по «пресноводному» типу, включающему и положение на протеомной карте относительно белка-«навигатора» трансферрина, и наличие всех характерных для фракции белков. У других видов (зеленушка, скорпена, речная камбала), положение фракции на карте относительно трансферрина было смещено. У султанки, морского налима и зеленушки - в протео-ме НМ-фракции отсутствовали аполипопротеины. Тем не менее, у ряда видов (трески, речной камбалы, лиманды, всех видов бычков) белковые комплексы были обнаружены. Только в отличие от пресноводных, комплексы этих морских видов состояли, в основном, из аполипопротеинов.
Мы предполагаем, что особенности организации протеома плазмы рыб, в том числе и присутствия в нем белковых комплексов, обусловлены особенностями становления внутренней жидкой среды организма в эволюции рыб. Историческое прошлое костистых рыб традиционно связывают с длительной фазой жизни в море и дальнейшим освоением пресных вод (Ромер, Парсонс, 1992). Принимая во внимание формирование первичных белковых систем при солености внутренней среды организма около 8%о (Хлебович, 1974), мы предположили, что белки древних морских рыб (предковых форм) могли существовать во внутренней жидкой среде как в виде отдельных полипептидов, так и в виде слабых белковых ассоциатов. Белки в ходе освоения рыбами пресных вод объединялись в выраженные комплексы для снижения величины онкотического давления крови, что стабилизировало процессы фильтрации в организме рыб. При освоении высокосоленостных акваторий, вероятно, имела место противоположная тенденция - белковые ассоциаты "разваливались" на отдельные белки. В условиях гипертоничной внешней среды образование олигомеров из мономерных белков могло привести к снижению онкотического и общего осмотического давления крови рыб, и, как следствие, к усугублению угрозы их дегидратации. Поэтому морским видам, вероятно, "выгоднее" иметь в крови (наряду с небольшими транспортными комплексами) больше небольших белков-мономеров для противостояния обезвоживанию организма.
Учитывая доминирующую роль низкомолекулярных белков плазмы в осморегуляции (в её части, касающейся фильтрации) по сравнению с высокомолекулярными белками, можно предположить, что динамичное равновесие между олигомерной и мономерной формами белков в плазме и тканевой жидкости стабилизирует капиллярную фильтрацию внеклеточной жидкости в организме. Проведенные нами эксперименты по акклимации лещей к условиям нарастающей солености выявили смещение этого равновесия в сторону мономерных форм белков и их накоплению в мышечной жидкости организма. В связи с этим различия в структуре протеомных карт плазмы у пресноводных и морских видов можно объяснить модулирующей ролью солености среды обитания и разным типом ионной регуляции у рыб. Только вектор этого механизма имеет разные направления у диких видов рыб и в эксперименте: если у лещей накопление аполипопротеина А-I в мышечной жидкости происходит под действием нарастающей солености, то у морских костистых Аро А-I присутствует в крови далеко не у всех видов и, судя по имеющимся литературным данным, в некоторых тканях морских рыб не экс-прессируется вовсе (Jiong Chen et al., 2009).
Данный пример демонстрирует действие "принципа экономии" в эксплуатации механизмов адаптации (Hochachka, Somero, 1973) и наводит на мысль об универсальном использовании механиз-
ма диссоциации белковых комплексов плазмы из транспортных белков для стабилизации обменных процессов в организме, включая энергетический и водный обмены.
Полученные в ходе исследования результаты об организации белковых комплексов и их постгеномных преобразованиях в годовом цикле рыб и в экспериментальных условиях повышенной солености, позволяют рассматривать комплексы плазмы в качестве универсальных регуляторов обменных процессов в организме рыб.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают благодарность за помощь в сборе материала сотрудникам Института биологии южных морей (г.Севастополь) Рудневой И.И., Шайда В.Г. и сотрудникам отдела ихтиологии; сотруднику Института физико-химической биологии (МГУ) Серебряковой М.В. за анализ масс-спектров белков.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 13-04-00427-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Андреева А.М. Структура сывороточного альбумина у рыб // Ж. эвол. биохимии и физиологии. 2010. Т. 46. № 2. С. 111-118. [Andreeva A.M. The structure of fish serum albumins // J. Evol. Biochem. Physiol. 2010. Vol. 46. No 2. P. 135-144. DOI: 10.1134/S0022093010020018] In Russian. Андреева А.М., Ламаш Н.Е., Серебрякова М.В., Рябцева И.П., Большаков В.В. Реорганизация низкомолекулярной фракции белков плазмы в годовом цикле карповых рыб// Биохимия. 2015a. Т.80. Вып.2. С. 256-268. [Andreeva A.M., Lamas N.E., Serebryakova M.V., Ryabtseva I.P, Bolshakov V.V. Reorganization of low-molecular-weight fraction of plasma proteins in the annual cycle of Cyprinidae // Biochemistry (Moscow). 2015. №2. P.208-218. January 25, 2015, MS BM14-236 (http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) (online form). DOI: 10.1134/S0006297915020078.] In Russian. Андреева А.М., Серебрякова М.В., Ламаш Н.Е., Федоров Р.А., Рябцева И.П. Особенности организации белков низкомолекулярной фракции плазмы у дальневосточных красноперок рода Tribolodon и других CYPRINIDAE // Биология моря. 2015b. Т. 41. № 1. С. 55-63. [Andreeva A.M., Serebryakova M.V., Lamash N.E., Fedorov R.A., Ryabtseva I.P. Structural features of the low-molecular-weight plasma fraction in far eastern redfins of the genus Tribolodon and other Cyprinid fishes // Russian J. Marine Biology. 2015. Vol. 41. No 1. P. 6068. DOI: 10.1134/S1063074015010022] In Russian. Андреева А.М., Федоров Р.А. Особенности организации низкомолекулярных белков крови и каневой жидкости у ската-хвостокола Dasyatis pastinaca (Chondroichthyes: Trygonidae) // Биология моря. 2010. Т. 36. № 6. С. 460-462. [Andreeva, AM; Fedorov, RA. Features of the organization of low-molecular weight proteins from the blood and tissue fluid of the common stingray Dasyatis pastinaca L. (Chondroichthyes: Trigonidae) // Russian J. Marine Biology. 2010. Vol. 36. No 6. P. 469-472. http://shark-references.com/index.php?lang=en). SpringerLink. Мартемьянов В.И. Влияние солености на пресноводных рыб // Зоол. ж. 1989. Т. 68. № 5. С. 72-81. Martem'yanov V.I. Vliyanie solenosti na presnovodnykh ryb // Zool. zhurnal. 1989. T.68. № 5. S. 72-81. [Martemyanov V.I. Effect of salinity on freshwater fish // Russian J. Zoology. 1989. Vol. 68. No 5. P. 72-81.] In Russian. Ромер А., Парсонс Т. Анатомия позвоночных. В 2-х томах. М.: Мир, 1992. 764 c. [Romer A.S., Parsons Th.S. The
Vertebrate Body. Philadelphia - NY - Chicago: Saunders College Publishing, 1986. 624p. Сакун О.Ф., Буцкая Н.А. Определение стадий зрелости и изучение половых продуктов рыб. Мурманск: ПИН-РО. 1968. 46с. Sakun O.F., Butskaya N.A. Opredelenie stadiy zrelosti I izuchenie polovykx produktov ryb. Murmansk. PINRO. 1968. 46s. [Sakun O.F., Butskaya N.A. Determination of stages of maturity and the study of sexual products of fish. Murmansk. PINRO. 1968. 46 p.] In Russian. Хлебович В.В. 1974. Критическая соленость биологических процессов. Л.: Наука, 236с. Khlebovich V.V. Kritich-eskaya solenost' biologicheskikh potsessov. Leningrad: Nauka, 1974. 236 s [Khlebovich V.V. The critical salinity of biological processes. 1974. Leningrad: Science, 1974, 236p.] In Russian. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977. 398с. [Hochachka P.W., Somero G.N. Strategies of biochemical adaptation. Philladelphia-London-Toronto: W.B. Sounders Company, 1973, 358 p In English.] In Russian.
Шульц Г., Ширмер Р. 1982. Принципы структурной организации белков. М.:Мир. 354 с. [Schulz, G.E., Schirmer,
R.H. Principles of Protein Structure. Springer, 1979, 314 p. In English.] In Russian. Ali Han, M.V., Rashid, Z., Ali Han, V., Ali, R. Biochemical, biophysical and thermodynamic analysis of human serum
albumin glycated in vivo // Biochemistry (Moscow). 2007. Т. 72(2). С. 175-183. Anderson, N.L., Polanski, M., Pieper, R., Gatlin, T., Tirumalai, R.S., Conrads, T.P., Veenstra, T.D., Adkins, J.N., Pounds, J.G., Fagan, R., and Lobley, A. The human plasma proteome: a nonredundant list developed by combination of four separate sources // Mol. Cell Proteomics. 2004. Vol. 3. P. 311-326. Ando, S., Mori, Y. Characteristics of serum lipoprotein features associated with lipid levels of muscle and liver from
five species of fish // Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. Vol. 59. P. 1565-1571. Andreeva A.M. Structural and functional organization of fish blood proteins. NY: Nova Science Publisher, 2012. 188 p.
Babaei F., Ramalingam R, Tavendale A. et al. Novel blood collection method allows plasma proteome analysis from single zebrafish // J. Proteome Res. 2013. Vol. 12. No. 4. P. 1580-1590.
Braceland M., Bickerdike R., Tinsley J. et al. The serum proteome of Atlantic salmon, Salmo salar, during pancreas disease (PD) following infection with salmonid alphavirus subtype 3 (SAV3) // J. Proteomics. 2013. Vol. 94. P. 423-436.
Creighton T.E. Electrophoretic analysis of the unfolding of proteins by urea // J. Mol. Biol. 1979. Vol. 129. P. 235-264.
De Smet, H., Blust, R., Moens, L. Absence of albumin in the plasma of the common carp Cyprinus carpio: binding of fatty acids to high density lipoprotein // Fish Physiol. Biochem. 1998. Vol. 19. P. 71-81.
Dietrich, M.A., Arnold, G.J., Nynca, J. et al., Characterization of carp seminal plasma proteome in relation to blood plasma // J. Proteomics. 2014. Vol. 98. P. 218-232.
Durliat, M., Andrea, M., Babin, P.J. Conserved protein motifs and structural organization of a fish gene homologous to mammalian apolipoprotein E // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 549-559.
Jiong Chen, Yu H. Shi, Hai Q. Hu, He Niu, Ming, Y. Li. Apolipoprotein A-I, a hyperosmotic adaptation-related protein in ayu (Plecoglossus altivelis) // Comp. Biochem. Physiol. Part B. 2009. Vol. 152. P. 196-201.
Kinoshita, S., Itoi, S., and Watabe, S. cDNA cloning and characterization of the warm-temperature-acclimation-associated protein Wap65 from carp, Cyprinus carpio //Fish Physiol. Biochem. 2001. Vol. 24. P. 125-134.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. 1970. Vol. 227(4). No. 5259. P. 680-685.
Lazarev V.F., Sverchinskyi D.V., Ippolitova M.V., Stepanova A.V., Guzhova I.V., Margulis B.A. Factors affecting aggregate formation in cell models of huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis // Acta Naturae. 2013. V. 5. No. 2. P. 81-89.
Low C.F., Shamsudin M.N., Chee H.Y. et al. Putative apolipoprotein A-I, natural killer cell enhancement factor and lysozyme g are involved in the early immune response of brown-marbled grouper, Epinephelus fuscoguttatus Forskal, to Vibrio alginolyticus // J. Fish Dis. 2014. Vol. 37. No. 8. P. 693-701.
Lucitt M.B., Price T.S., Pizarro A. et al. Analysis of the zebrafish proteome during embryonic development // Mol. Cell. Proteomics // 2008. Vol. 7. No. 5. P. 981-994.
Margulis, B., Kinev, A., Guzhova, I. Heat Shock Proteins in Biology and Medicine. Kerala, India: Research Signpost, 2006. P. 305-329.
Shen, Y., Lindberg, A., Olivecrona, G. Apolipoprotein CII from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is functionally active but structurally very different from mammalian apolipoprotein CII // Gene. 2000. Vol. 254. P. 189-198.
Tsai P.L., Chen C.H., Huang C.J. et al. Purification and cloning of an endogenous protein inhibitor of carp nephrosin, an astacin metalloproteinase // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. No. 12. P. 11146-11155.
ORGANIZATION OF PLASMA PROTEIN COMPLEXES IN BONY FISH
A. M. Andreeva, I. P. Ryabtseva, R. A. Fedorov
I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences, 152742 Borok, Yaroslavl, Nekouz, Russia; e-mail: aam@ibiw. yaroslavl. ru
The organization of the low-molecular (LM) plasma protein fraction and its protein complexes in fresh- (FW) and sea-water (SW) Teleostei were investigated. Hemopexin (Hx), nonhomologous apolipoproteins (A-I and Apo-14) and inhibitors of serine proteinases (Spi) were identified in this fraction using MALDI. Protein complexes in FW-fishes were organized uniformly - by oligomeric forms Hx and Apo. In spring the oligomeric complexes were reorganized in complex consist of monomeric Hx and Apo. Structural diversity of LM-fraction were observed in SW- fishes. Its plasma protein complexes differed in composition from ones by FW- fishes. In addition, some species had complexes, others had no ones. There are no apolipoprotein A-I in plasma zone SW-species. Participation of plasma protein complexes in stabilization of metabolic processes is discussed. It is assumed that plasma protein aggregation influence on features of internal organism fluid medium formation in Pisces evolution.
Keywords: teleosts, plasma, proteins, MALDI
