CC BY
20
Труды ИБВВ РАН, 2017, вып. 80(83)
Transactions of IBIW RAS, 2017, issue 80(83)
УДК 597:577.322.9.088.5
СТЕХИОМЕТРИЯ БЕЛКОВЫХ АГРЕГАТОВ ПЛАЗМЫ РЫБ
А. М. Андреева
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, е-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru
Исследовали структурную организацию и состав белковых комплексов плазмы и тканевых жидкостей организма, реорганизации комплексов в ходе капиллярной фильтрации из плазмы в интерстициальную жидкость организма у морских и пресноводных Teleostei. По результатам работы рассчитаны стехиомет-рические модели белковых комплексов плазмы и предложена модель становления структурной организации белков плазмы в эволюции Те1ео81е1. Обсуждается функциональная целесообразность присутствия белковых комплексов в плазме рыб.
Ключевые слова: костистые рыбы, белки плазмы, белковый комплекс, 2D-электрофорез, MALDI.
ВВЕДЕНИЕ
В общих чертах белковые агрегаты можно охарактеризовать как надмолекулярные структуры из полипептидных цепей. Агрегирование является общим свойством белковых молекул и встречается на всех уровнях организации живой материи [Довидченко и др., 2014 (Dovidchenko et al., 2014)]. Наблюдаемый в последние десятилетия интерес к механизмам агрегирования белков обусловлен обнаружением связи между мисфолдингом - нарушением пространственной укладки белков - и заболеваниями человека [Bucciantini et al., 2002; Ellis, Pinheiro, 2002; Walsh et al., 2002; Stefani, Dobson, 2003; Neumann et al., 2009; Kwiatkow-ski et al., 2009; Vance et al., 2009; Doi et al., 2010]. На склонность белков к агрегированию влияют не только особенности первичной и вторичной структур полипептидных цепей, но и микроокружение белка. Разные стратегии в организации макромолекул четко прослеживаются на примере внутри- и внеклеточных белков. Так, разная компартментализация и разные барьерные свойства окружающих белки оболочек, разные буферные системы и конвективные свойства жидкостей внутри клетки и во внеклеточных жидкостях организма, а также разные функциональные задачи - все это в комплексе определяет различные стратегии в организации белков внутри и вне клетки.
Согласно установленным ранее принципам, внутриклеточные белки организованы преимущественно как олигомеры и состоят из нескольких полипептидных цепей, связанных нековалентно; внеклеточные белки организованы преимущественно как мономеры и состоят из 1 полипептидной цепи [Schulz, Schirmer, 1979]. Целесообразность такой дифференциа-
ции обусловлена, прежде всего, необходимостью плотной упаковки белков внутри клетки, способствующей снижению осмотического давления и вязкости во внутриклеточном пространстве. Для внеклеточных пространств стратегия организации белков проявляется в разных размерах их мономерных форм. "Истинные" белки плазмы (но не "транзитные") являются крупными мономерами; это предотвращает их быструю фильтрацию в интерстициальную жидкость [Schulz, Schirmer, 1979].
Есть ли исключения из этой закономерности? Что касается внутриклеточных белков, то их организация достаточно консервативна. Что же касается белков плазмы, то их структурная организация в разных группах Vertebrata оказалась различной. У Mammalia в норме белки плазмы являются мономерами; даже если они состоят из нескольких полипептидных цепей, то последние связаны друг с другом кова-лентно. Агрегированные формы белков плазмы у человека встречаются исключительно при патологиях [Stefani, Dobson, 2003]. Между тем, в плазме низших позвоночных - рыб - обнаружены белковые комплексы, относительное содержание которых достигает 20-30%, а в отдельных случаях 50% [Andreeva, 2010]. Никаких гипотез и концепций относительно этого феномена не предложено. В данном исследовании мы постарается разобраться в структурной организации белковых комплексов плазмы рыб, предложим их стехиометрические модели, обсудим функциональную целесообразность их присутствия в крови, а также вопросы, касающиеся эволюции структурной организации белков плазмы у Teleostei.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В качестве объектов использовали плазму костистых рыб: султанки Mullus ЬогЬМш Ь., звездочета
Uranoscopus scaber, морского ерша Scorpaena porcus L., бычков кругляка Neogobius melanostomus P. и мартовика Mesogobius
batrachocephalus P., морского налима Gaidropsarus mediterraneus L., зеленушки Symphodus tinca L. (Черное море); речной камбалы Platichthys flesus L., камбалы лиманды Limanda limanda L., зубатки Anarhichas lupus L., трески Gadus morhua L., бычка керчака Myoxocephalus scorpius L. (Белое море); щуки Esox lucius L., судака Stizostedion lucioperca L., окуня Perca fluviatilis L., пеляди Coregonus peled G., карпа Cyprinus carpio L., леща Abramis brama L., синца A. ballerus L., плотвы Rutilus rutilus L., карася серебряного Carassius auratus L. (Рыбинское водохранилище, р. Волга); дальневосточной мелкочешуйной красноперки Tribolodon brandtii D. (Японское море, р. Волчанка); карпа Cyprinus carpio L. (подро-щен в экспериментальных прудах ИБВВ РАН).
В экспериментах по акклимации пресноводных рыб к условиям повышенной солености использовали лещей и плотву 2+. Половозрелых рыб отлавливали в мае в р. Волга; в результате естественного нереста производителей в экспериментальных нерестовых прудах получали потомство, которое подращивали в экспериментальных нагульных прудах до 2+ и использовали далее в экспериментах по акк-лимации к солености.
Определение стадии зрелости гонад. Стадии зрелости гонад половозрелых рыб определяли по шкале зрелости половых продуктов [Сакун, Буцкая, 1968 (Sakun, Butskaya, 1968)].
Получение плазмы крови ПК рыб. Кровь отбирали из хвостовых сосудов рыб сразу после их отлова. Для получения плазмы кровь собирали в пробирки с 1%-ным раствором (m/V) гепариноида, осевшие эритроциты удаляли центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 мин. при 14000 g.
Получение тканевой жидкости ТЖ. Мышечную жидкость отбирали выше боковой линии между краем жаберной крышки и спинным плавником. С помощью ножниц с длинными лезвиями делали кожный разрез и микронаконечником дозатора оттягивали кожу в глубине "кармана" так, чтобы создать в нем разрежение. Благодаря "подсасывающему" эффекту этого разрежения мышечная жидкость собиралась в "кармане" в количестве нескольких микролитров, которые отбирали для анализа. При необходимости использовали "бумажный метод" отбора мышечной жидкости [Andreeva et al., 2015a].
Электрофоретические методы. Низкомолекулярную (НМ) фракцию оценивали по числу белков, молекулярной массе MW и элек-трофоретической подвижности Rf белков, и
расположению на электрофореграмме в 7.5%-ном ПААГ.
Способ организации белков по типу мо-номер/олигомер определяли по расположению, числу и MW белковых "пятен" в неденатури-рующем двумерном электрофорезе (2D-E) в градиенте концентраций 5-40% полиакрила-мидного геля (ПААГ) и денатурирующем электрофорезе - в 11%-ном ПААГ с 8 М мочевиной [Creighton, 1979] и 12.5%-ном Ds-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях [Laemmli, 1970]. В первом направлении проводили диск-электрофорез в 7.5- или 4.9%-ном ПААГ.
В качестве маркеров MW использовали полимеры сывороточного альбумина человека HSA (67, 134, 201, 268, 335 кДа) и овальбумина ОА (45, 90, 135 кДа) и PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (11, 17, 28, 36, 55, 72, 95, 130, 250 кДа) (Fermentas). Денситометрирование, расчет относительного содержания (ОС) и MW белков проводили с помощью программы ONE-Dscan, Ver 1.31 (Scananalytic Inc.).
Экспериментальная акклимация неполовозрелых лещей к условиям повышенной солености воды. Для исключения влияния фактора созревания гонад на капиллярную фильтрацию использовали неполовозрелых лещей возраста 2+, полученных в результате естественного нереста производителей и подрощен-ных в экспериментальных прудах. Рыб аккли-мировали к воде различной солености - 8.0, 10.0 и 11.5%о в соответствии с рекомендациями по акклимации пресноводных рыб в диапазоне "критической солености" [Хлебович, 1974 (Khlebovich, 1974); Мартемьянов, 1989 (Martemyanov, 1989)], добавляя соль NaCl в аквариумы в расчете 1 г/л в сутки. В контрольный аквариум соль не добавляли. В аквариумах поддерживали устойчивый температурный и гидрохимический режим.
Масс-спектрометрия MALDI. Операции по подготовке проб анализируемых белков для масс-спектрометрии выполнены в соответствии с протоколом, описанным ранее [Андреева, 2013 (Andreeva, 2013)]. Масс-спектры (ms) продуктов трипсинолиза получали на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектро-метре
Ultraflextreme BRUKER ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона в диапазоне масс 700-4500 m/z. Точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 50 ррм. При необходимости получали спектры фрагментации ms-ms отдельных пептидов. Для их получения использовали тан-
демный режим прибора, точность измерения фрагментных ионов была не ниже 1 Да. Масс-спектры обрабатывали с помощью программного пакета FlexAnalysis 2.4 ("Bruker Daltonics", Германия).
Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot (опция "пептидный фингерпринт", www.matrixscience.com). Поиск проводили в базах данных NCBI среди белков всех организмов и/или EST vertebrates. Канди-датные белки, имеющие параметр достоверности score > 83, считали определенными надеж-
но (p < 0.05). С использованием программного обеспечения Biotools 3.0 ("Bruker Daltonics", Германия) проводили поиск кандидатных белков по объединенным данным ms+(ms-ms). Если кандидатные последовательности обнаруживались в неаннотированной базе данных EST в виде библиотек кДНК, то реконструированную на основе мРНК аминокислотную последовательность вставляли в Protein BLAST и далее задавали поиск кандидатного белка среди белков всех позвоночных.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Белковые комплексы обнаружены нами в низкомолекулярной (НМ) фракции белков плазмы рыб. Рассмотрим организацию этой фракции на примере представителей пресноводных и морских Te1eostei.
Организация низкомолекулярной фракции белков плазмы у пресноводных Te1eostei. НМ-фракция белков плазмы расположена на электрофореграмме в зоне электрофоретиче-ской подвижности Rf 0.37-0.87 и состоит из двух подфракций (рис. 1).
Рис. 1. Диск-Е плазмы: 1, 2 - леща, 3, 4 - судака. "Alb" и "Prealb" - подфракции НМ-фракции белков плазмы.
Fig. 1. Disk-E of bream (1, 2) and zander (3, 4) blood plasma. "Alb" and "Prealb" - subfractions of LM- plasma protein fraction.
Первая подфракция представлена в виде "пятна" с нечеткими контурами, на ее долю приходится более половины всего белка фракции; вторая подфракция, как правило, гетеро-генна и состоит из 2-15-ти белков (рис. 1). Первая подфракция связывает альбуминспе-цифичный краситель синий Эванса, поэтому мы назвали ее альбуминоподобной (А1Ь); вторая - не связывает краситель [Andreeva, 2012] и по ее локализации на электрофореграмме -перед А1Ь - мы обозначили ее как преальбу-мины (Ргеа1Ь) (рис. 1).
В 2D-E в неденатурирующих условиях первая подфракция представлена одним белковым "пятном" с MW около 120 кДа, вторая -2-15 белками от 45 до 100 кДа (рис. 2, верхний ряд); в денатурирующем геле с мочевиной обе подфракции представлены несколькими белками (рис. 2, средний ряд). В SDS-ПААГ первая подфракция представлена белками с MW около 14, 25 и 50-60 кДа, вторая - 2-3 белками с MW около 50-60 кДа (рис. 2, ни^жний ряд).
У разных представителей пресноводных Teleostei - карповых, окуневых, щуковых, лососевых рыб - НМ-фракции белков плазмы организованы сходным образом [Andreeva, 2012]. Данное обстоятельство позволяет использовать результаты идентификации белков у отдельных видов с секвенированными геномами для идентификации соответствующих белков у видов с несеквенированными геномами. В качестве модельного вида мы использовали карпа.
Как обнаружить белковые комплексы в плазме рыб? Неденатурированные белковые комплексы выглядят на электрофореграммах в виде "пятен" с нечеткими контурами. Их локализацию в геле определяли по белку-"навигатору" трансферрину (Tf). В диск-Е Tf расположен непосредственно над комплексом, в 2D-E примыкает к комплексу слева (рис. 2). Tf окрашивается реактивом Мюллера [Palmour, Sutton, 1971], что удобно для его быстрой идентификации в геле. Кроме того, Tf успешно идентифицируется с помощью MALDI как у
модельных, так и у диких видов с несеквени-рованными геномами [АМгееуа й а1., 2015а].
Комплексы обнаруживали по сопоставлению количества белковых пятен на дорожке А1Ь в разных 2D-Е системах - в градиенте концентраций ПААГ, в ПААГ с 8 М мочевиной и 8Б8-ПААГ в восстанавливающих условиях, и по сопоставлению величин MW белков в этих системах. В денатурирующих условиях комплексы диссоциировали под действием мочевины или додецилсульфата натрия на отдельные полипептидные цепи. Сопоставление величин М\¥ белков в разных условиях дает
представление о стехиометрии комплекса и стабилизирующих его связях. Так, в градиенте ПААГ MW комплекса у карповых рыб составил около 120 кДа: в ПААГ с мочевиной комплекс диссоциировал на 3 белка с MW около 120, 90 и 56 кДа; в 8Б8-ПААГ - в основном на 3 белка с MW около 60, 29 и 12 кДа (рис. 2). Сопоставление этих величин позволяет предположить, что 120 кДа-белок является комплексом, состоящим, как минимум, из 3-х белков, связанных друг с другом нековалентными (водородными) связями.
Рис. 2. 2D-E плазмы: верхний ряд, градиент концентраций ПААГ - лещ (1), плотва (2), красноперка (3), карп (4); средний ряд, ПААГ с мочевиной - синец (1), лещ (2), плотва (3), красноперка (4); нижний ряд, SDS-ПААГ -плотва (1), карась (2), красноперка (3), карп (4). Рамками выделены НМ-фракции, овалами - группы белков. Белые стрелки в верхнем ряду указывают на нативный белковый комплекс, в среднем и нижнем рядах - на дорожку комплекса.
Fig. 2. 2D-E of blood plasma. Upper row: 2D-PAGE (5-40% PAG) of bream (1), roach (2), eastern redfin (3) and carp (4) plasma. Middle row: 2D-PAGE with 8 M urea of zope (1), bream (2), roach (3) and eastern redfin (4) plasma. Lower row: 2D-SDS-PAGE of roach (1), crucian carp (2), eastern redfin (3) and carp (4) plasma. LM- protein fractions are designated by dotted frames, protein groups - by dotted ovals. White pointers in upper row indicate the native protein complex, in middle and lower rows - to the track of the complex.
Идентификация белков в составе комплекса плазмы карпа. У модельного вида -карпа - белки в составе комплекса плазмы идентифицировали с помощью MALDI. Для этого белки вырезали из 2D-SDS-ПААГ, подвергали трипсинолизу, получали шб и идентифицировали, отбирая среди выборки кандида-
тов наиболее адекватные. У карпа в настоящее время в DB Рго1ешБ/КСВ1 имеется свыше пяти тысяч расшифрованных белковых последовательностей. Мы идентифицировали 4 белка в составе белкового комплекса плазмы карпа (рис. 3, белки 1-4).
Рис. 3. 2D-SDS-E плазмы карпа. В рамку выделены белки НМ-фракции. Белая стрелка указывает дорожку белкового комплекса и белки 1-4 в его составе.
Fig. 3. 2D-SDS-PAGE of carp blood plasma. The proteins of LM-fraction are designated by dotted frame. White pointer indicates to the protein complex track and to the proteins 1-4 in its composition.
В таблице 1 представлено по одному кандидату с наибольшей достоверностью score для каждого из четырех белков карпа (табл. 1). Для белка 1 на рисунке 3 (MWobs около 64 кДа) гомологи обнаружены в неаннотированной DB EST/NCBI, поэтому расчетная величина молекулярной массы (MWcalc) в таблице 1 отсутствует. Кандидаты для этого белка представлены библиотеками кДНК, сконструированными на основе популяций мРНК печени карпа (CF662379). Для идентификации белка 1 мы вставляли реконструированную на основе
мРНК аминокислотную последовательность в Таблица 1. Идентификация белков в составе белкового комплекса плазмы карпа Table 1. Identification of the proteins in the composition of protein carp plasma complex
Protein BLAST и задавали поиск среди белков всех позвоночных. Из предложенных кандидатов мы отобрали наиболее адекватный, на наш взгляд, гомолог - "Warm temperature acclimation-related 65 kDa protein" карповой рыбы пестрого толстолобика Hypophthalmichthys nobilis R. Этот белок часто обозначают как ге-мопексин (Нх), так как он содержит в структуре "Hemopexin-like''-повторы, связывает гем и транспортирует его в печень (GenBank ACO51168.1). Для остальных трех белков комплекса плазмы карпа кандидаты были определены с помощью программы Mascot (табл. 1).
Protein № Candidate proteins (NCBI) Accession Number (NCBI) MW, kDa calc/obs1 Score2 Coverage %
1 Warm temperature acclimation-related 65 kDa protein [Hypophthalmichthys nobilis] (silver carp) GenBank ACO51168.1 /63.4 173 43
2 Fetuin long form [Cyprinus carpio] gi|29501368 51.666/52.8 144 6
3 apolipoprotein A-I [Cyprinus carpio] gi|13445027 20.797/22.0 260 63
4 14 kDa apolipoprotein [Cyprinus carpio] gi|385865216 15.718/12.8 241 73
№ - номер белка по рис.3; расчетная и экспериментальная величины молекулярной массы полипептидной цепи, 2 вероятностный коэффициент достоверности, 3 перекрывание аминокислотных последовательностей. Protein number (№) is given according to fig.3; 1 calculated and experimental values of protein MW, 2 parameter of reliability, 3 amino-acid sequences overlapping.
Сопоставив число белковых пятен на дорожке белкового комплекса, величины MW нативных и денатурированных белков и результаты MALDI-идентификации, мы пришли к выводу о наличии в составе белкового комплекса плазмы карпа четырех транспортных белков - гемопексина, фетуина и двух негомологичных аполипопротеинов А-1 и Аро-14. Для
проверки этого результата мы сравнили ms нативного белкового комплекса и ms отдельных денатурированных белков в его составе. Результаты показали наличие в масс-спектре нативного комплекса сигналов от всех входящих в его состав белков - гемопексина, фетуи-на и аполипопротеинов (рис. 4).
Рис. 4. Масс-спектр нативного белкового комплекса T. brandtii и сигналы отдельных белков в его составе: "Warm temperature acclimation-related 65 kDa"-белка (▼ ), фетуина (•) Аро А-I (*) и Аро-14 ( и ).
Fig. 4. Mass-spectra of T. brandtii native plasma protein complex and the signals of separate proteins in its composition: "Warm temperature acclimation-related 65 kDa"-protein (▼ ), fetuin (•) Аро А-I (*) and Аро-14 ( и ).
Учитывая однотипную организацию белкового комплекса плазмы у исследованных представителей пресноводных карповых, окуневых, щуковых и лососевых рыб (карп, бра-хиданио рерио, густера, уклея, плотва, лещ, чехонь, дальневосточных красноперок рода Tribolodon, щука, судак, окунь, пелядь) и сходные показатели MW белков в составе комплексов, мы пришли к выводу об их едином составе - из гемопексина, фетуина и апо-липопротеинов.
Стехиометрическая модель комплекса. Использование разных электрофоретических систем и MALDI позволило установить состав и ориентировочную стехиометрию белкового комплекса плазмы у пресноводных костистых рыб. Учитывая экспериментальную величину MW комплекса (около 100-120 кДа) и MW отдельных белков в его составе - около 67 кДа для Hx, около 53 кДа для фетуина, 26 и 14 кДа для Аро А-I и Аро-14 соответственно, мы предположили, что НМ-фракция содержит ас-социциаты разных белков с приблизительно сходными показателями MW - гомодимеры Нх и Fet, тетрамеры Аро А-I и олигомеры Аро-14
более высокого порядка, стабилизированные водородными связями. В составе такой структуры присутствуют и липиды (Lp) [Andreeva, 2012], связанные с белками нековалентными связями:
[(Нх)2 (Fet)2 (АроА-1)4 (Аро-14)п>^р (1) Гемопексин и два аполипопротеина присутствовали в составе комплекса плазмы у всех исследованных нами видов пресноводных Teleostei, между тем как фетуин обнаружен не у всех рыб. С учетом данного обстоятельства универсальную стехиометрическую модель белкового комплекса плазмы рыб можно представить следующим образом:
[(Нх)2 (АроА-1)4 (Аро-14)п>^р (2) Стехиометрическая модель и структурные реорганизации белкового комплекса плазмы. В диск-Е два основных способа организации НМ-фракции мы обозначили как "базовый" и "пластический". Они сопутствовали разным сезонам и разным стадиям репродуктивного цикла рыб и различались величинами Rf, MW и степенью гетерогенности белков фракции (рис. 5).
Рис. 5. Диск-Е белков плазмы леща и организация НМ-фракции по "базовому" (1, 2) и "пластическому" (3, 4) типам.
Fig.5. Disk-E of bream plasma proteins and LM- fraction organization according to "basic" (1, 2) and "plastic" (3, 4) types.
io
Базовый тип характеризуется более высокими показателями MW нативного комплекса (около 120 кДа) и максимальной гетерогенностью подфракции Prealb; пластический тип -минимальными показателелями MW нативного комплекса (около 100 кДа) и гетерогенности подфракции Prealb (рис. 5). Базовый и пластический типы НМ-фракции чередовались в течение года: характерный для летне-осеннего и зимнего периодов базовый тип сменялся весной на пластический. Базовые НМ-фракции встречались у рыб с гонадами I—III стадий зрелости, пластические НМ-фракции - у рыб с гонадами IV стадии зрелости. В период подготовки рыб к нересту происходила реорганизация комплекса плазмы, в ходе которой MW комплекса снижалась со 120 до 100 кДа. Между тем, субъединичный состав комплекса в ходе сезонной и генеративной динамик не менялся. Исходя из вышеизложенного, мы предположили, что в течение года белковые комплексы плазмы регулярно перестраивались: ассоциаты из олиго-меров разных белков реорганизовывались в ге-тероолигомеры из разных мономеров - гемо-пексина и двух аполипопротеинов: [(Нх)2 (АроА-1)4 (Аро-14)п>4]Ьр [(Нх) (АроА-I) (Аро-14)] Lp (3)
Структурные реорганизации белкового комплекса плазмы в ходе капиллярной фильтрации в интерстициальное пространство. В плазме готовящейся к зимовке красноперки T. brandtii обнаружены 120 кДа- и 90 кДа-комплексы, в составе которых выявлено четы-
ре субъединицы с MW около 12, 22, 41 и 64 кДа (рис. 6).
Теоретически 64 кДа-субъединицы могут формировать 120 кДа-димеры, 41 кДа-субъединицы - 120 кДа-тримеры, 12 кДа- и 22 кДа- субъединицы - олигомеры более высокого порядка с MW около 90 кДа. Кроме того, не исключена возможность формирования комплексов смешанного состава. Идентификация субъединиц в составе комплекса из мышечной жидкости показала их принадлежность к Нх и аполипопротеинам Аро А-1 и Аро-14 (табл. 2). Денатурированный Аро А-1 из плазмы и мышечной жидкости был представлен двумя субъединицами с MW около 29 и 41 кДа, что позволяет предположить наличие в жидкостях организма не только его 29 кДа- формы, но и ковалентного производного.
Протеомные карты плазмы и мышечной жидкости рыб практически совпадали, но только в мышечной жидкости были обнаружены отдельные отсутствующие в плазме белки, обозначенные как 11 и 12' (рис. 6). Они оказались неагрегированными мономерными формами Аро А-1 и Аро-14 соответственно.
Таким образом, в мышечной жидкости отдельные белки присутствовали как в составе комплекса, так и в виде свободных мономерных форм, что позволяет предположить диссоциацию комплекса в ходе его капиллярной фильтрации из плазмы в интерстициальное пространство.
A
B
Рис. 6. Протеомные карты плазмы (А) и мышечной жидкости (Б) красноперки в градиенте ПААГ (а) и SDS -ПААГ (восстанавливающие условия) (б). 1-9 - белки плазмы, 1-13' - мышечной жидкости. Пунктиром выделена область белкового комплекса. Белая стрелка указывает дорожку комплекса.
Fig. 6.Proteomic maps of eastern redfin blood plasma (A) and interstitial muscle fluid (B) in gradient PAGE (a) and SDS-PAGE (reducing conditions) (б). 1-9 - plasma proteins, 1-13' - interstitial fluid proteins. Dotted line isolated the region of protein complex. White pointer indicates the track of complex.
Таблица 2. Идентификация белков мышечной жидкости T. brandtii1 Table 2. T. brandtii interstitial fluid proteins identification1
Protein № Candidate proteins (NCBI) Accession Number (NCBI) MW, kDa calc/obs Score Coverage %
1(1/), 5(5/) transferrin gi|193480074 73.5/65 80 2
[Ctenopharyngodon
6(6/) idella]
warm temperature gi|218202908 16.6' 94 43
acclimation-related 65.0
65kDa protein, partial
[Ctenopharyngodon
7(7') idella]
apolipoprotein A-I-1 gi|206598060 29.9/ 93 6
[Hemibarbus 41.0
8(8/) mylodon]
apolipoprotein A-I-1 gi|206598060 29.9/ 93 6
[Hemibarbus 24.3
9(9') mylodon]
«14 kDa gi| 110351026 14.8/ 63 6
apolipoprotein» 13.0
[Pimephales
10(10/) promelas]
serpinal protein GenBank / 423 98
11(11') [Danio rerio] AAH62869.1 53.0
apolipoprotein A-I-1 gi|206598060 29.9/ 93 6
[Hemibarbus 24.3
mylodon]
нумерация белков в соответствии с рис. 6; остальные обозначения см. в табл. 1. 1 protein numeration is given according to fig. 6; the remaining designations see in Table 1.
Структурные реорганизации комплексов плазмы при адаптациях рыб к солености. При экспериментальной акклимации лещей и плотвы к условиям повышенной солености была отмечена тенденция к диссоциации белковых комплексов плазмы в ходе их капиллярной фильтрации в интерстициальную мышечную
жидкость. При солености 11.5%о содержание комплекса в плазме снижалось в два раза, в жидкости белых мышц - в 3-4 раза (рис. 7). Параллельно было отмечено почти двукратное увеличение относительного содержания мономерного Аро А-1 в мышечной жидкости рыб.
Рис. 7. Динамика относительного содержания белкового комплекса и Аро А-I в сыворотке крови и интерстици-альной жидкости белых мышц леща в условиях акклимации рыб к соленоqй воде: 1 - пресная вода, 2 - 8%о, 3 -10%о, 4 - 11.5%. ОСФ - относительное содержание белков в %.
Fig.7. Dynamics of relative content (RC, %) of protein complex and ApoA-I in the bream blood serum and interstitial muscle fluid in acclimation conditions to saline water: 1 - fresh water, 2 - 8%, 3 - 10%, 4 - 11.5%.
Белковые комплексы плазмы у морских видов рыб. Поиск белковых комплексов в
плазме рыб из других отрядов и семейств Pisces был проведен по такому же алгоритму,
что и у пресноводных и проходных карповых, а именно, по сопоставлению протеомных карт плазмы в разных 2D-E-системах с последующей идентификацией белков с помощью MALDI. Стоит особо отметить, что у диких видов идентификация белков в составе комплекса с помощью масс-спектрометрии большей частью была затруднительна. Во многих случаях белки объектов не имели гомологов среди белков модельных видов, представленных в DB NCBI аминокислотными и кодирующими их нуклеотидными последовательностями. Тем не менее, с учетом особенностей организации белковых комплексов плазмы у модельных видов рыб, был проведен поиск белковых комплексов у 30-ти морских и пресноводных видов Teleostei из 9 отрядов и 15 семейств.
Несмотря на то, что у морских Teleostei в структуре НМ-фракции белков плазмы были обнаружены те же белки, что и у пресноводных рыб, у морских видов не было отмечено свойственного для пресноводных видов единообразия структуры НМ-фракции (рис. 8).
Во-первых, локализация на протеомной карте плазмы аполипопротеинов и гемопекси-
на у морских видов несла черты видоспеци-фичности (рис. 8). У бычка-мартовика эти белки находились на разных дорожках и образовывали только гомоолигомеры; у речной камбалы к этой особенности добавлялось особое расположение белков на карте - по разные стороны от белка "навигатора» трансферрина; у зеленушки не найден Аро А-I; между тем, как у представленного на рисунке для сравнения пресноводного вида - щуки - НМ-фракция белков плазмы была организована как и у карповых рыб (рис. 8). Во-вторых, не у всех морских видов рыб белковые агрегаты обнаружены в плазме. Если у беломорских видов - трески, речной камбалы, лиманды и бычков - комплексы в плазме присутствовали, то у большинства исследованных черноморских видов комплексы в плазме не обнаружены. Сравнивая количество белков НМ-фракции плазмы этих видов в разных 2D-E мы обратили внимание, что количество белков в неденатурирую-щих условиях, как правило, было сопоставимо с количеством белков в ПААГ с 8М мочевиной (табл. 3), что косвенно указывает на отсутствие комплексообразования.
1
4
2 3
Рис. 8. 2D-SDS-E белков плазмы 1 - щуки, 2 - бычка-мартовика, 3 - речной камбалы, 4 - зеленушки. В рамки выделены белки НМ- фракции. Черная стрелка указывает на трансферрин.
Fig. 8. 2D-SDS-PAGE of the plasma proteins of Esox lucius (1), Mesogobius batrachocephalus (2), Platichthys flesus (3), Symphodus tinca (4). LM-protein fraction is framed by dotted line. Black pointer indicates transferring.
Таблица 3. Максимальное количество белков НМ-фракции плазмы у черноморских видов рыб в разных элек-трофоретических системах (1D- и 2D-E)
Table 3. Maximum quantity of proteins of LM- plasma fraction in Black Sea fish species at the different electrophoresis systems (1D- and 2D-E)
Виды диск-Е 2D-E, градиент 2D-E, 8М мочевина 2D-SDS-E
Species disk-E 2D-PAGE, 5-40% 2D-PAGE, 8M urea 2D-SDS-PAGE
Mullus barbatus 6 10 11 12
Uranoscopus scaber 9 15 17 24
Symphodus tinca 7 16 17 24
Gaidropsarus mediterraneus 8 18 20 21
Scorpaena porcus 7 15 24 34
Neogobius melanostomus 7 12 11 22
Mesogobius batrachocephalus 10 18 16 41
Только у скорпены в градиенте ПААГ и ПААГ с мочевиной в НМ-фракции было обнаружено 15 и 24 белков соответственно, что
предполагает наличие агрегированных форм в нативных условиях (табл. 3).
И в-третьих, при наличии в плазме морских видов белковых комплексов, последние
были представлены исключительно гомооли-гомерами. Например, у беломорских видов в составе белковых комплексов обнаружены только гомоолигомеры гемопексина и аполи-попротеинов.
Таким образом, белковые комплексы обнаружены нами в плазме как пресноводных,
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование выявило универсальный характер организации белковых комплексов плазмы у пресноводных Teleostei. Эти комплексы представляют собой ассоциаты из мономерных и олигомерных форм гемопексина и аполипопротеинов. В течение года происходят динамичные перестройки комплексов, в процессе которых 120 кДа-ассоциаты из олигомеров гемопексина и аполипопротеинов (и липидов) - [(Нх)2(АроА-I)4(Аро-14)n>4]Lp - сменяются на 100 кДа-ассоциаты из мономерных форм этих же белков (и липидов) - [(Нх)(АроА-I)(Аро-14)]Lp. Рассчитанные на основе электрофоретических методов стехиометрические модели комплексов подтверждают и данные масс-спектрометрии MALDI, с помощью которой сигналы индивидуальных белков обнаружены в масс-спектрах нативных комплексов.
У морских Teleostei отсутствие единообразия в организации белковых комплексов плазмы проявляется в их составе - у разных видов они представлены гомоолигомерами АроА-I или Аро-14, гомоолигомеры Нх нами не установлены. Кроме того, комплексы выявлены не у всех исследованных морских видов рыб.
Наличие стехиометрических белковых комплексов в жидкостях организма пресноводных Teleostei, их олигомерная организация, состав (из транспортных белков) и регулярные структурные реорганизации в ходе сезонных и репродуктивных ритмов - все это позволяет считать их присутствие в плазме рыб функционально оправданным. Очевидна транспортная функция комплекса, следующая из состава его белков - гемопексина (переносит гем) и аполипопротеинов А-I (переносят холестерин). Между тем, появление мономерных форм белков при капиллярной фильтрации комплекса в интерстициальную жидкость в условиях акклимации рыб к повышенной солености - позволяет предположить участие белковых комплексов и в осморегуляции. Сравнительный анализ диссоциации комплекса у акклимированных к соленой воде рыб (лещ, плотва) и у проходной красноперки демонстрирует ее приуроченность к разным событиям: 1) осморегуляторным - у леща и
так и морских костистых рыб. Но если у первых отмечено единообразие их организации, то среди морских видов наблюдается разнообразие комплексов 1) по признаку их наличия/отсутствия в плазме, 2) по их локализации на протеомной карте плазмы и 3) по составу белков.
РЕЗУЛЬТАТОВ
плотвы, так как диссоциация комплекса происходит у рыб в условиях нарастающей солености воды, что совпадает с направлением реакции диссоциации олигомерных комплексов при нарастании ионной силы in vitro; 2) и к метаболическим процессам - у проходной красноперки, так как диссоциация комплекса in vivo характерна не для морской, а для речной фазы жизни рыб и связана, вероятно, с подготовкой рыб к зимовке, а не с осморегу-ляцией. Данное обстоятельство, а также установленная ранее согласованность параметров капиллярной фильтрации белка плазмы с питанием, сезоном, созреванием и возрастом [Andreeva et al., 2015a, b; Andreeva, 2012], демонстрируют универсальную роль белковых комплексов в метаболизме рыб.
Систематизируя костистых рыб по признаку наличия/отсутствия белковых комплексов в плазме крови, можно выделить два "полярных" варианта: с одной стороны, это пресноводные рыбы, в крови которых стабильно присутствуют единообразно организованные белковые комплексы; с другой стороны, это морские виды, в крови которых белковых комплексов нет. "Промежуточный" вариант включает в себя морские виды с разным набором гомоолигомеров из разных аполипопротеинов. Мы связали этот феномен с ранними этапами становления протеома жидкой внутренней среды организма у низших позвоночных -рыб. История таксона Pisces неразрывно связана с океаном и с последующим освоением пресных вод [Romer, Parsons, 1986]. Учитывая обнаруженные нами особенности организации белков жидкой среды организма у морских и пресноводных рыб, мы предположили, что протеом плазмы у предков современных рыб, обитающих в области критической солености около 8%о и несколько выше [Хлебович, 1974 (Khlebovich, 1974)], мог быть представлен слабыми ассоциатами из отдельных белков. При освоении предковыми формами рыб пресных и высокосоленостных акваторий могли быть задействованы противоположные стратегии организации белков жидкой среды организма. У видов, столкнувшихся в эволюционной истории с пресными водами, одним из возмож-
ных приспособлений могло стать агрегирование белков плазмы, снижающее онкотическое давление крови и, как следствие, поступление воды в организм. У морских видов наоборот: увеличение количества белковых мономеров в крови способствовало росту онкотического давления крови, что снижало риск обезвоживания организма в соленой воде. Косвенным доказательством выдвинутой концепции является наличие у карповых рыб, становление которых связывают с пресными водами, типичных для пресноводных Teleostei белковых комплексов в крови; именно у карповых рыб содержание комплексов в крови достигает максимальных среди исследованных нами видов Teleostei величин [Andreeva, 2010].
Еще одним аспектом выполненного исследования является особая роль входящего в состав комплекса плазмы белка - переносчика холестерина аполипопротеина Аро А-I. Этот белок обнаружен у всех пресноводных, но не у всех морских видов. Именно этот белок накапливается в интерстициальной жидкости белых мышц пресноводных рыб при помещении их в соленую воду, что позволило нам рассматривать его как осморегуляторный белок. В качестве осморегуляторного данный белок рассматривают и другие авторы [Jiong Chen et al., 2009].
Возникают вопросы: (1) почему именно аполипопротеин А-I связан у рыб и с транспортом, и с осморегуляцией, (2) почему именно этот белок формирует динамичные белковые комплексы в плазме Teleostei и (3) почему этот белок отсутствует в крови некоторых морских видов рыб? Ответы на первые два вопроса кроются, на наш взгляд, в пойкилотерм-ной природе рыб. Эта природа предопределяет приуроченность всех обменных процессов рыб к условиям среды. Весной происходит активация биосинтетических процессов в организме. В первую очередь активация синтеза касается белков, обслуживающих энергетический обмен и, в их числе, транспортных белков апо-липопротеинов, переносящих липиды. Важ-
ность такого транспорта определяется тем, что липиды у рыб являются основным энергетическим субстратом [Шульман и др., 1978 (Schul-man et al., 1978); Watanabe, 1982; Babin et al., 1997; Paolucci et al., 1998; Kondo et al., 2001, 2005; Durliat et al., 2000; Shen et al., 2000; Jiong Chen et al., 2009]. Установлено, что Аро А-I, помимо обратного транспорта холестерина [Jackson et al., 1976], выполняет у рыб его прямой транспорт из печени к перифирическим тканям [Ando, Mori, 1993], а также переносит свободные жирные кислоты [De Smet et al., 1998] и выполняет ряд функций, не связанных с энергетическим обменом [Li Zhou et al., 2005]. Активное участие данного белка в метаболизме рыб объясняет его синтез в разных тканях рыб [Jiong Chen et al., 2009]. Если весной в условиях активного синтеза транспортного белка он не будет агрегировать при поступлении в плазму, то это приведет к нарастанию ее онкотического давления и нарушению водного баланса в организме. Именно агрегирование белка, наряду с его перераспределением относительно стенки капилляра [Andreeva et al., 2015b] является фактором, снижающим перепады онкотического давления жидкостей организма, что важно для поддержания в нем стабильной фильтрации. Ответ на третий вопрос, касающийся отсутствия апо-липопротеина А-I в плазме некоторых морских видов рыб, могут дать исследования экспрессии гена АроА-I у проходной рыбы айю Plecoglossus altivelis, представителя семейства айювых подотряда корюшковидных рыб [Jiong Chen et al., 2009]. Авторами работы было показано достоверное снижение экспрессии гена АроА-I в ряде тканей у рыб в условиях соленой воды, между тем как у рыб из пресной воды ген оставался экспрессированным во всех исследованных тканях. Можно предположить, что для восполнения дефицита данного белка в тканях рыб в условиях соленой воды использовались резервы сывороточного Аро А-I, что и приводило к его исчезновению из крови.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает благодарность И.И. Рудневой, В.Г. Шайда (ИнМБИ РАН, г. Севастополь) и Н.Е. Ламаш (ИБМ ДВО РАН) за предоставленные образцы плазмы черноморских рыб и дальневосточной красноперки, и М.В. Серебряковой (МГУ, г. Москва) за масс-спектрометрический анализ белков. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проекты № 13-04-00427-а и 16-04-00120-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Андреева A.M. 2013. Идентификация некоторых белков крови и тканевой жидкости у рыб с нерасшифрованным геномом // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. Т. 49. № 6. С. 394-402. [Andreeva A.M. Identification of some blood and tissue fluids proteins in fishes with the undeciphered genome // Zhurnal Evolyutsionnoi biokhimii I fiziologii. 2013. V. 49. № 6. P. 394-402]. In Russian.
Довидченко Н.В., Леонова Е.И., Галзитская О.В. Механизмы образования амилоидных фибрилл // Усп. Биол. Химии. 2014. Т.54. С. 203-230. [Dovidchenko N.V., Leonova E.I., Galzitskaya O.V. Mechanisms of the formation of the amiloid fibrils // Uspekhi biologicheskoy khimii. 2014. V. 54. P. 203-230]. In Russian.
Мартемьянов В.И. Влияние солености на пресноводных рыб // Зоол. журн. 1989. Т. 68. № 5. С. 72-81. [Martemyanov V.I. Influence of salinity on the fresh-water fishes // Zool. zhurnal. 1989. V. 68. № 5. P. 72-81]. In Russian.
Сакун О.Ф., Буцкая Н.А. Определение стадий зрелости и изучение половых продуктов рыб. Мурманск. ПИН-РО. 1968. 46 с. [Sakun O.F., Butskaya N.A. Determination of maturity stages and the study of the sexual products of the fishes. Murmansk. PINRO. 1968. 46 p.]. In Russian.
Хлебович В.В. 1974. Критическая соленость биологических процессов. Л.: Наука, 236с. [Khlebovich V.V. Critical salinity of the biological processes. Leningrad: Nauka, 1974. 236 p.] In Russian.
Шульман Г.Е. и др. Элементы физиологии и биохимии общего и активного обмена у рыб. Киев: Наукова думка. 1978. 204с. [Schulman G.E. et al. Elements of physiology and biochemistry of general and active metabolism in the fishes. Kiev: Naukova dumka. 1978. 204 p.]. In Russian.
Ando S., Mori Y. Characteristics of serum lipoprotein features associated with lipid levels of muscle and liver from five species of fish // Nippon Suisan Gakkaishi. 1993. V. 59. P. 1565-1571.
Andreeva A.M., Lamas N.E., Serebryakova M.V., Ryabtseva I.P., Bolshakov V.V. Reorganization of Low-Molecular-Weight Fraction of Plasma Proteins in the Annual Cycle of Cyprinidae // Biochemistry (Moscow). 2015a. V. 80. № 2. P. 208-218. DOI: 10.1134/S0006297915020078.
Andreeva A.M., Lamash N.E., Serebryakova M.V., Ryabtseva I.P. Seasonal Dynamics in Capillary Filtration of Plasma Proteins in Eastern Redfins of the Genus Tribolodon (Cyprinidae) // Journal of Ichthyology. 2015b. Vol. 55. № 5. P. 723-734.
Andreeva A.M. The structure of fish serum albumins // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 2010. Vol.46. P. 135-144. DOI: 10.1134/S0022093010020018.
Andreeva A.M. Structural and functional organization of fish blood proteins. Nova Science Publisher: N.Y. 2012. 188 p.
Babin P.J., Thisse C., Durliat M., Andre M., Akimenko M.A., Thisse B. Both apolipoprotein E and A-I genes are present in a nonmammalian vertebrate and are highly expressed during embryonic development // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. P. 8622-8627. DOI: 10.1073/pnas.94.16.8622
Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M., Stefani M. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases // Nature. 2002. V. 416(6880). P. 507-511. DOI: 10.1038/416507a
Creighton T.E. Electrophoretic analysis of the unfolding of proteins by urea // J. Mol. Biol. 1979. Vol. 129. P. 235 -264. DOI:10.1016/0022-2836(79)90279-1.
De Smet H., Blust R., Moens L. Absence of albumin in the plasma of the common carp Cyprinus carpio: binding of fatty acids to high density lipoprotein // Fish Physiol. Biochem. 1998. V. 19. P. 71-81.
Doi H., Koyano S., Suzuki Y., Nukina N., Kuroiwa Y. The RNA-binding protein FUS/TLS is a common aggregate-interacting protein in polyglutamine diseases // Neuroscience research. 2010. V. 66. P. 131-133. DOI: 10.1016/j.neures.2009.10.004
Durliat M., Andrea M., Babin P.J. Conserved protein motifs and structural organization of a fish gene homologous to mammalian apolipoprotein E // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 549-559. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01033.x
Ellis R.J., Pinheiro T.J. Medicine: danger-misfolding proteins // Nature. 2002. V. 416(6880). P. 483-484. DOI: 10.1038/416483a
Jackson R.L., Morrisett J.D., Gotto A.M. Lipoprotein structure and metabolism // Physiol. Rev. 1976. V. 56. P. 259-316.
Jiong Chen, Yu H. Shi, Hai Q. Hu, He Niu, Ming Y. Li. Apolipoprotein A-I, a hyperosmotic adaptation-related protein in ayu (Plecoglossus altivelis) // Comp. Biochemistry and Physiology, Part B. 2009. V. 152. P. 196-201. DOI: 10.1016/j.cbpb.2008.11.005
Kondo H., Kawazoe I., Nakaya M., Kikuchi K., Aida K., Watabe S. The novel sequences of major plasma apolipoproteins in the eel Anguilla japonica // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1531. P. 132-142. DOI: 10.1016/S1388-1981(01)00099-3
Kondo H., Morinaga K., Misaki R., Nakaya M.,Watabe S. Characterization of the pufferfish Takifugu rubripes apolipoprotein multigene family // Gene. 2005. V. 346. P. 257-266. DOI: 10.1016/j.gene.2004.11.015
Kwiatkowski T.J., Jr Bosco D.A., Leclerc A.L., Tamrazian E., Vanderburg C.R., Russ C., Davis A., Gilchrist J., Kasarskis E.J., Munsat T., Valdmanis P., Rouleau G.A., Hosler B.A., Cortelli P., de Jong P.J., Yoshinaga Y., Haines J.L. Pericak-Vance M.A., Yan J., Ticozzi N., Siddique T., McKenna-Yasek D., Sapp P.C., Horvitz H.R., Landers
J.E., Brown R.H.. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis // Science (New York, N.Y.). 2009. V. 323. P. 1205-1208. DOI: 10.1126/science.1166066 Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. 1970. Vol.
227(4). № 5259. P. 680-685. DOI: 10.1038/227680a0 Li Zhou, Yang Wang, Bo Yao, Chuang-Ju Li, Guan-Dong Ji, Jian-Fang Gui. Molecular cloning and expression pattern of 14 kDa apolipoprotein in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides // Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. 2005. V. 142. P. 432-437. DOI: 10.1016/j.cbpb.2005.09.007 Neumann M., Rademakers R., Roeber S., Baker M., Kretzschmar H.A., Mackenzie I.R.A. A new subtype of frontotemporal lobar degeneration with FUS pathology, Brain // Journal of neurology. 2009. V. 132. P. 2922-2931. DOI: 10.1093/brain/awp214
Palmour R.M., Sutton H.E. Vertebrate transferrins molecular weight, clinical composition and iron binding studies //
Biochem. 1971. V. 10. P. 4026-4032. DOI: 10.1021/bi00798a003 Paolucci M., Guerriero G., Botte V., Ciarcia G. Apolipoproteins and their electrophoretic pattern throughout the reproductive cycle in the green frog Rana esculenta // Comp. Biochem. Physiol. B. 1998. V. 119. P. 647-654. DOI: 10.1016/S0305-0491(98)00040-6 Romer A.S., Parsons Th.S. The Vertebrate Body. Philadelphia - NY - Chicago: Saunders College Publishing, 1986. 624p.
Schulz, G.E., Schirmer, R.H. Principles of Protein Structure. Springer, 1979. 314p.
Shen Y., Lindberg A., Olivecrona G. Apolipoprotein CII from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is functionally active but structurally very different from mammalian apolipoprotein CII // Gene. 2000. V. 254. P. 189-198. DOI: 10.1016/S0378-1119(00)00268-7 Stefani M., Dobson C.M. Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution // Mol. Med. 2003. V. 81. P. 678-699. DOI 10.1007/s00109-003-0464-5 Vance C., Rogelj B., Hortobagyi T., De Vos K.J., Nishimura A.L., Sreedharan J., Hu X., Smith B., Ruddy D., Wright P., Ganesalingam J., Williams K.L., Tripathi V., Al-Saraj S., Al-Chalabi A., Leigh P.N., Blair I.P., Nicholson G., de Belleroche J., Gallo J.-M., Miller C.C., Shaw C.E. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6 // Science (N.Y.). 2009. V. 323. P. 1208-1211. DOI: 10.1126/science. 1165942
Walsh D.M., Klyubin I., Fadeeva J.V., Cullen W.K., Anwyl R., Wolfe M.S., Rowan M.J., Selkoe D.J. Naturally secreted oligomers of amyloid ß protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo // Nature. 2002. V. 416. P. 535-539. DOI: 10.1038/416535a Watanabe T. Lipid nutrition in fish // Comp. Biochem. Physiol. B. 1982. V. 73. P. 3-15.
REFERENCES
Ando S., Mori Y. 1993. Characteristics of serum lipoprotein features associated with lipid levels of muscle and liver
from five species of fish // Nippon Suisan Gakkaishi. V. 59. P. 1565-1571. Andreeva A.M., Lamas N.E., Serebryakova M.V., Ryabtseva I.P., Bolshakov V.V. 2015a. Reorganization of Low-Molecular-Weight Fraction of Plasma Proteins in the Annual Cycle of Cyprinidae // Biochemistry (Moscow). V. 80. № 2. P. 208-218. DOI: 10.1134/S0006297915020078. Andreeva A.M., Lamash N.E., Serebryakova M.V., Ryabtseva I.P. 2015b. Seasonal Dynamics in Capillary Filtration of Plasma Proteins in Eastern Redfins of the Genus Tribolodon (Cyprinidae) // Journal of Ichthyology. Vol. 55. № 5. P. 723-734.
Andreeva A.M. 2010. The structure of fish serum albumins // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology.
Vol.46. P. 135-144. DOI: 10.1134/S0022093010020018. Andreeva A.M. 2013. Identifikatsiya nekotorykh belkov I tkanevoy zhidkosti u ryb s nerasshifrovannym genomom [Identification of some blood and tissue fluids proteins in fishes with the undeciphered genome] // Zhurnal Evolyutsionnoi biokhimii i fiziologii. V. 49. № 6. S. 394-402. [In Russian]. Andreeva A.M. 2012. Structural and functional organization of fish blood proteins. Nova Science Publisher: N.Y. 188 p.
Babin P.J., Thisse C., Durliat M., Andre M., Akimenko M.A., Thisse B. 1997. Both apolipoprotein E and A-I genes are present in a nonmammalian vertebrate and are highly expressed during embryonic development // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. V. 94. P. 8622-8627. DOI: 10.1073/pnas.94.16.8622 Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M., Stefani M. 2002. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases // Nature. V. 416(6880). P. 507-511. DOI: 10.1038/416507a Creighton T.E. 1979. Electrophoretic analysis of the unfolding of proteins by urea // J. Mol. Biol. Vol. 129. P. 235-264.
DOI:10.1016/0022-2836(79)90279-1. De Smet H., Blust R., Moens L. 1998. Absence of albumin in the plasma of the common carp Cyprinus carpio: binding
of fatty acids to high density lipoprotein // Fish Physiol. Biochem. V. 19. P. 71-81. Doi H., Koyano S., Suzuki Y., Nukina N., Kuroiwa Y. 2010. The RNA-binding protein FUS/TLS is a common aggregate-interacting protein in polyglutamine diseases // Neuroscience research. V. 66. P. 131-133. DOI: 10.1016/j.neures.2009.10.004
Durliat M., Andrea M., Babin P.J. 2000. Conserved protein motifs and structural organization of a fish gene homologous to mammalian apolipoprotein E // Eur. J. Biochem. V. 267. P. 549-559. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01033.x
Dovidchenko N.V., Leonova E.I., Galzitskaya O.V. 2014. Mekhanizmy obrazovaniya amiloidnykh fibril [Mechanisms
of the formation of the amiloid fibrils] // Uspekhi biologicheskoy khimii. V. 54. S. 203-230. [In Russian]. Ellis R.J., Pinheiro T.J. 2002. Medicine: danger-misfolding proteins // Nature. V. 416(6880). P. 483-484. DOI: 10.1038/416483a
Jackson R.L., Morrisett J.D., Gotto A.M. 1976. Lipoprotein structure and metabolism // Physiol. Rev. V. 56. P. 259316.
Jiong Chen, Yu H. Shi, Hai Q. Hu, He Niu, Ming Y. Li. 2009. Apolipoprotein A-I, a hyperosmotic adaptation-related protein in ayu (Plecoglossus altivelis) // Comp. Biochemistry and Physiology, Part B. V. 152. P. 196-201. DOI: 10.1016/j.cbpb.2008.11.005
Khlebovich V.V. 1974. Kriticheskaya solenost biologicheskikh protsessov [Critical salinity of the biological processes].
Leningrad: Nauka. 236 s. [In Russian]. Kondo H., Kawazoe I., Nakaya M., Kikuchi K., Aida K., Watabe S. 2001. The novel sequences of major plasma apolipoproteins in the eel Anguilla japonica // Biochim. Biophys. Acta. V. 1531. P. 132-142. DOI: 10.1016/S1388-1981(01)00099-3
Kondo H., Morinaga K., Misaki R., Nakaya M.,Watabe S. 2005. Characterization of the pufferfish Takifugu rubripes
apolipoprotein multigene family // Gene. V. 346. P. 257-266. DOI: 10.1016/j.gene.2004.11.015 Kwiatkowski T.J., Jr Bosco D.A., Leclerc A.L., Tamrazian E., Vanderburg C.R., Russ C., Davis A., Gilchrist J., Kasarskis E.J., Munsat T., Valdmanis P., Rouleau G.A., Hosler B.A., Cortelli P., de Jong P.J., Yoshinaga Y., Haines J.L. Pericak-Vance M.A., Yan J., Ticozzi N., Siddique T., McKenna-Yasek D., Sapp P.C., Horvitz H.R., Landers J.E., Brown R.H.. 2009. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis // Science (New York, N.Y.). V. 323. P. 1205-1208. DOI: 10.1126/science.1166066 Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. Vol.
227(4). № 5259. P. 680-685. DOI: 10.1038/227680a0 Li Zhou, Yang Wang, Bo Yao, Chuang-Ju Li, Guan-Dong Ji, Jian-Fang Gui.2005. Molecular cloning and expression pattern of 14 kDa apolipoprotein in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides // Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. V. 142. P. 432-437. DOI: 10.1016/j.cbpb.2005.09.007 Martemyanov V.I. 1989. Vliyanie solenosti na presnovodnykh ryb [Influence of salinity on the fresh-water fishes] //
Zool. zhurnal. V. 68. № 5. S. 72-81. [In Russian]. Neumann M., Rademakers R., Roeber S., Baker M., Kretzschmar H.A., Mackenzie I.R.A. 2009. A new subtype of frontotemporal lobar degeneration with FUS pathology, Brain // Journal of neurology. V. 132. P. 2922-2931. DOI: 10.1093/brain/awp214
Palmour R.M., Sutton H.E. 1971. Vertebrate transferrins molecular weight, clinical composition and iron binding studies // Biochem. V. 10. P. 4026-4032. DOI: 10.1021/bi00798a003 Paolucci M., Guerriero G., Botte V., Ciarcia G. 1998. Apolipoproteins and their electrophoretic pattern throughout the reproductive cycle in the green frog Rana esculenta // Comp. Biochem. Physiol. B. V. 119. P. 647-654. DOI: 10.1016/S0305-0491(98)00040-6 Romer A.S., Parsons Th.S. 1986. The Vertebrate Body. Philadelphia - NY - Chicago: Saunders College Publishing, 624p.
Sakun O.F., Butskaya N.A. 1968. Opredelenie stadiy zrelosti I izuchenie polovykh produktov ryb [Determination of
maturity stages and the study of the sexual products of the fishes]. Murmansk. PINRO. 46 s. [In Russian]. Schulman G.E. et al. 1978. Elementy fiziologii I biokhimii obschego I aktivnogo obmena u ryb [Elements of physiology
and biochemistry of general and active metabolism in the fishes]. Kiev: Naukova dumka. 204 s. [In Russian]. Schulz, G.E., Schirmer, R.H. 1979. Principles of Protein Structure. Springer. 314p.
Shen Y., Lindberg A., Olivecrona G. 2000. Apolipoprotein CII from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is functionally active but structurally very different from mammalian apolipoprotein CII // Gene. V. 254. P. 189-198. DOI: 10.1016/S0378-1119(00)00268-7 Stefani M., Dobson C.M. 2003. Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into protein folding,
misfolding diseases and biological evolution // Mol. Med. V. 81. P. 678-699. DOI 10.1007/s00109-003-0464-5 Vance C., Rogelj B., Hortobagyi T., De Vos K.J., Nishimura A.L., Sreedharan J., Hu X., Smith B., Ruddy D., Wright P., Ganesalingam J., Williams K.L., Tripathi V., Al-Saraj S., Al-Chalabi A., Leigh P.N., Blair I.P., Nicholson G., de Belleroche J., Gallo J.-M., Miller C.C., Shaw C.E. 2009. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6 // Science (N.Y.). V. 323. P. 1208-1211. DOI: 10.1126/science. 1165942
Walsh D.M., Klyubin I., Fadeeva J.V., Cullen W.K., Anwyl R., Wolfe M.S., Rowan M.J., Selkoe D.J. 2002. Naturally secreted oligomers of amyloid ß protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo // Nature. V. 416. P. 535-539. DOI: 10.1038/416535a Watanabe T. 1982. Lipid nutrition in fish // Comp. Biochem. Physiol. B. V. 73. P. 3-15.
PROTEIN AGGREGATES STOICHIOMETRY IN FISH PLASMA
A. M. Andreeva
Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences, 152742 Borok, Russia, e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru
Structural organization and composition of protein complexes from plasma and organism tissue fluids, reorganization of complexes in the process of its capillary filtration from plasma into interstitial fluids in sea- and fresh-water fishes (Teleostei) were investigated. The stoichiometric models of plasma protein complexes are calculated. The model of formation of plasma protein structural organization in the Teleostei evolution is proposed. The functional expediency of presence of protein complexes in fish plasma is discussed.
Keywords: bony fishes, plasma proteins, protein complex, 2D- electrophoresis, MALDI
