CC BY
202
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3
Вып. 4
ЗООЛОГИЯ
УДК 595.341.4:57.017.64+577.112
А. М. Андреева, И. П. Рябцева, И. И. Руднева, В. Г. Шайда, Н. Е. Ламаш, А. Э. Дмитриева
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ У РАЗЛИЧНЫХ ПО ЭКОЛОГИИ ТЕЬЕ0БТЕ1*
Одной из основных функций крови является транспорт необходимых для жизнедеятельности организма соединений к клеткам и тканям. С транспортной функцией крови тесно связана дыхательная. В ее обеспечении участвуют плазма и форменные элементы. Основным носителем дыхательной функции в крови является белок гемоглобин, локализованный в эритроцитах; в других тканях ее выполняют другие белки из семейства глобинов [1-5].
Для функционирования гемоглобина, заключенного в эритроцит, важна целостность последнего. У всех позвоночных имеет место разнокачественность эритроцитов по резистентным характеристикам (осмотической и кислотной), которая формируется в результате действия на организм внешних и внутренних факторов. У человека в норме гемолиз эритроцитов начинает происходить в 0,46-0,42%-ном растворе №С1, полный гемолиз — в 0,32-0,3%-ном №С1. Снижение осмотической резистентности эритроцитов происходит вследствие изменений структурных и функциональных свойств мембран эритроцитов, возникающих при старении организма, заболеваниях, обусловленных накоплением скрытых структурных повреждений в белково-липидном каркасе мембран низко- и высокостойких эритроцитов [6].
Андреева Алла Михайловна — заведующая ЦКП «Молекулярные технологии» ИБВВ РАН; e-mail: [email protected]
Рябцева Ирина Павловна — научный сотрудник, ИБВВ РАН, ЦКП «Молекулярные технологии»; e-mail: [email protected]
Руднева Ирина Ивановна — главный научный сотрудник, ИнБЮМ НАН Украины, отдел ихтиологии; e-mail: [email protected]
Шайда Валентин Григорьевич — главный научный сотрудник, ИнБЮМ НАН Украины, отдел ихтиологии; e-mail: [email protected]
Ламаш Нина Евгеньевна — старший научный сотрудник, Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН; e-mail: [email protected]
Дмитриева Александра Эльдаровна — аспирант, старший лаборант, ИБВВ РАН, ЦКП «Молекулярные технологии; e-mail: [email protected]
* Работа поддержана РФФИ (проект № 10-04-00954-а).
© А. М. Андреева, И. П. Рябцева, И. И. Руднева, В. Г. Шайда, Н. Е. Ламаш, А. Э. Дмитриева, 2013
Эритроциты рыб по осмотической резистентности уступают таковым у млекопитающих: признаки гемолиза у них могут появляться уже при небольших разведениях физиологического раствора (0,9-0,81%-ный NaCl), массовый гемолиз эритроцитов половозрелых рыб происходит, как правило, при 0,63-0,54%-ном NaCl [7]. Резистентные характеристики эритроцитов рыб, как и человека, зависят от стадии зрелости: молодые эритроциты имеют более высокую осмотическую и кислотную резистентность по сравнению со старыми формами [8, 9]. На резистентные показатели эритроцитов рыб влияют многие факторы: в их числе физиологическое состояние, старение [10]; питание, липидный состав кормов [11-13]; стрессы [14-16]; рН, температура, токсиканты [17-22] и др. Сезонные колебания процессов формирования эритроцитов рыб не вписываются в какие-то выраженные закономерности [22]. Некоторые авторы отмечают видоспецифичный характер показателей красной крови и их независимость от естественной динамики температуры воды [23].
Целью данной работы являлось исследование сезонной изменчивости осмотической резистентности эритроцитов рыб и сравнительный анализ данного показателя у представителей пресноводных, морских, солоноватоводных и проходных Teleostei.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали Teleostei:
1) пресноводных — леща Abramis brama L. (30 экз.), карася серебряного Carassius auratus L. (15 экз.), плотву Rutilus rutilus L. (30 экз.), синца Abramis ballerus L. (20 экз.), густеру Blicca bjoerkna L. (5 экз.), чехонь Pelecus cultratus L. (5 экз.), уклейку Alburnus al-burnus L. (10 экз.), щуку обыкновенную Esox lucius L. (13 экз.), судака обыкновенного Stizostedion lucioperca L. (10 экз.), отловленных в Рыбинском водохранилище; а также леща и плотву в возрасте 0+-4+ (60 экз.), содержащихся в прудах;
2) морских — скорпену Scorpena porcus L., бычка-кругляка Neogobius melanosto-mus Р., бычка-мартовика Mesogobius batrachocephalus Р., морского налима Gaidropsarus mediterraneus L., зеленушку Symphodus tinca L., рыбу-звездочета Uranoscopus scaber, султанку обыкновенную Mullus barbatus L. из Черного моря (36 экз.);
3) солоноватоводных — тюльку черноморско-каспийскую Clupeonella cultriven-tris N., отловленную в Рыбинском водохранилище (10 экз.);
4) проходных — мелкочешуйную (Tribolodon brandtii D.) и крупночешуйную (Tri-bolodon hakonensis G.) красноперок угай из Японского моря (15 экз.).
У пресноводных рыб кровь отбирали в весенний, летний и осенний периоды; у тюльки из Рыбинского водохранилища — в сентябре; у рыб из Черного моря — в мае — июне; у красноперки из Японского моря — в мае и октябре.
В выборке из Рыбинского водохранилища присутствовали молодь и половозрелые рыбы, из прудов — сеголетки, молодь и половозрелые лещ и плотва; среди черноморских рыб — рыбы с гонадами 2-й (морской налим), 3-й и 4-й (бычки, скорпена), 5-й (султанка, бычки, звездочет, скорпена, зеленушка) стадий зрелости; среди красноперок были самцы и самки 2-й (октябрь) и 3-5-й (май) стадий зрелости гонад, а также отнерестившиеся особи (май); выборка тюльки была представлена самцами и самками с гонадами 4-й стадии зрелости.
Отбор крови и эритроцитов. Кровь у рыб отбирали из хвостовых сосудов, для получения сыворотки кровь отстаивали при 8 °С, для получения плазмы ее собирали
в пробирки с 1%-ным раствором гепариноида. Отстоявшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трехкратно отмывали физиологическим раствором, центрифугировали и использовали в работе.
Регистрация гемоглобина. Гемоглобин получали после отмывания эритроцитов в физиологическом растворе, последующего гемолиза в дистиллированной воде и центрифугирования в течение 10 мин при 2 тыс. об/мин. Для разрушения молодых эритроцитов, не гемолизирующих в дистилляте, использовали ультразвук (ультразвуковая установка УЗДН-2Т, Россия). Гемоглобин регистрировали спектрофотометрически по наличию спектров и поглощению в области -угполосы Сорэ: окси-гемоглобин поглощал при \макс 412-414 нм, мет-гемоглобин — при \макс 406-408 нм.
Изучение осмотической резистентности эритроцитов. Осмотическую резистентность эритроцитов изучали по их гемолизу в гипотонических растворах №С1. Гемолиз проводили в течение 15 мин в растворах с разным разбавлением исходного 0,9%-ного раствора №С1 (0,9; 0,81; 0,72; 0,63; 0,54; 0,45; 0,36; 0,27; 0,18 и 0,09% №С1), а также в дистиллированной воде. Эффективность гемолиза эритроцитов оценивали по поглощению отцентрифугированных образцов в области -угполосы Сорэ.
Микроскопические исследования клеток крови. Для оценки физиологического состояния рыб анализировали мазки крови. Препараты окрашивали по Романовскому—Гимза при общем увеличении х1400. В каждом мазке анализировали не менее 500 клеток эритроидного ряда [24].
Электрофоретический анализ белков. Электрофорез белков сыворотки, плазмы крови и гемоглобина проводили в диск-электрофорезе. Для расчета относительного содержания внеклеточного гемоглобина в крови образцы сыворотки и плазмы разгоняли в диск-электрофорезе, окрашивали бензидином (для идентификации гемоглобина) и Сооша881е R-250 (окрашивание белка); окрашенные красителем Сооша881е гели денситометрировали. Рассчитывали относительное содержание гемоглобина в каждой лунке. Результаты обрабатывали статистически. В небольших выборках (и < 8) рассчитывали величины М ± SE.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Оценка состояния крови у половозрелых рыб в процессе ее отбора и хранения в весенне-летний и осенний периоды
1.1. Морские рыбы. При отстаивании в условиях 8 °С тридцати шести образцов сыворотки крови от семи видов черноморских рыб, отловленных в весенне-летний период, не было выявлено ни одного случая гемолиза эритроцитов, за исключением одной пробы с кровью зеленушки.
1.2. Пресноводные рыбы. В весенне-летний период сыворотка и плазма крови синца, леща, уклейки и густеры в основном были гемолизированы; у леща встречались негемолизированные образцы крови. У синца и леща относительное содержание внеклеточного гемоглобина в сыворотке варьировало от 0,02 до 50% и выше. У синца летом внутрисосудистый гемолиз эритроцитов носил перманентный характер, у плотвы и чехони гемолиз эритроцитов также имел место, но не носил перманентного характера. В осенне-зимний период, наряду с гемолизированными образцами крови, мы получали и негемолизированные образцы сыворотки и плазмы данных видов. В сыворотке крови щуки внеклеточный гемоглобин отсутствовал, за исключением одного случая,
у судака в летний период встречались гемолизированные образцы плазмы и сыворотки.
При хранении негемолизированных образцов сыворотки над сгустком крови при 8 °С гемолиз эритроцитов у рыб происходил в разные сроки: у леща, как правило, в течение суток; у плотвы — спустя сутки; у судака — через 2-3 суток; у щуки — через 2-6 суток с начала отстаивания сыворотки; следы гемолиза эритроцитов появлялись через 2-3 суток и в сыворотке серебряного карася. Эти показатели сохранялись для рыб, отловленных как в летний, так и в осенний периоды.
В период подготовки к нересту у рыб с гонадами 4-й стадии зрелости (щука, лещ, плотва) были отобраны сыворотка и плазма крови. Эритроциты таких рыб оказались в высокой степени устойчивыми к гемолизу: в сыворотке и плазме над осадком эритроцитов следы гемолиза не появлялись в течение семи дней (рис. 1).
Abs
3,0 -
2,5 -
2,0 -
1,5 -
1,0 -
0,5
0
1 24 72 96
■1
120 168 336
— 2 .......
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0
1 24 72 96 120 168 336
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0
1 24 72
96 120 168 336 Время,ч
Рис. 1. Динамика гемолиза эритроцитов при отстаивании сыворотки (1) и плазмы (2) над осадком эритроцитов и в физиологическом растворе (3) при температуре 8 °С у плотвы (а), леща (б) и щуки (в) в преднерестовый период
По оси абсцисс — время в часах; по оси ординат — поглощение в области Сорэ (Abs). (Пояснения в тексте.)
1.3. Тюлька. Плазма тюльки над осадком эритроцитов оставалась негемолизиро-ванной неделю при температуре хранения 8 °С, спустя некоторое время гемолиз эритроцитов произошел одновременно во всех 10 пробах.
1.4. Красноперка. Плазма красноперки, отловленной в октябре, отстаивалась после отбора крови при 8 °С без следов гемолиза; следы гемолиза эритроцитов появились в плазме через четыре дня после отбора крови. У рыб, отловленных в мае, начавшая отстаиваться плазма также не имела следов гемолиза. Однако майские пробы крови с гепарином хранились три дня при 8 °С и один день (4-й по счету после отбора крови) при более высокой температуре в связи с трудностями доставки проб в лабораторию; на 4-й день после отбора крови в узкой полоске плазмы, примыкающей к осадку форменных элементов, были замечены следы гемолиза во всех 13 образцах.
Таким образом, негемолизированные образцы плазмы и сыворотки крови надежно удавалось получить только у морских рыб (весеннее-летний период), тюльки (сентябрь) и красноперки (май, октябрь), что характеризует их эритроциты как относительно устойчивые. У пресноводных костистых рыб выявлена широкая вариабельность по данному показателю — от видов с перманентным гемолизом эритроцитов (синец) до видов с устойчивыми эритроцитами (щука). Основная масса отобранных
для анализа видов занимала промежуточное положение по этому показателю (лещ, плотва, судак и др.); весенне-летние образцы крови отличались меньшей устойчивостью эритроцитов к гемолизу в условиях отбора крови и ее хранения.
2. Особенности осмотической резистентности эритроцитов у рыб в весенне-летний и осенний периоды
2.1. Морские рыбы. Практически у всех морских видов, отловленных в весенне-летний период, удалось сохранить в негемолизированном виде эритроциты в процессе их отмывания. В физиологическом растворе наиболее устойчивыми оказались эритроциты скорпены, практически не гемолизирующие в течение 15 мин эксперимента. У других видов (морского налима, султанки, звездочета, бычка-мартовика и бычка-кругляка) в течение 15 мин в физиологическом растворе эритроциты гемолизировали в той или иной степени.
У султанки, бычка-мартовика и морского налима выявлена дифференциация эритроцитов по осмотической резистентности (рис. 2).
0,90 0,81 0,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0,27 0,18 0,09 0 0,90 0,81 0,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0,27 0,18 0,09 0
NaCl, % NaCl, %
Рис. 2. Кривые осмотической резистентности эритроцитов скорпены (а, экз.) и бычка-мартовика (б, экз.)
По оси абсцисс — концентрация NaCl (в %); по оси ординат — поглощение в области Сорэ (Abs). Вертикальные пунктиры разделяют эритроциты на фракции, содержащие мет-(406, 408 нм) и окси- (412 нм) гемоглобины (то же для рис. 3 и рис. 4).
Так, у морского налима обнаружено три фракции эритроцитов: 1) первыми в диапазоне 0,9-0,72%-ного NaCl гемолизировали эритроциты с мет-гемоглобином (А.макс = 408 нм); 2) вторыми в диапазоне 0,72-0,0%-ного NaCl — эритроциты с мет- и ок-си-гемоглобином (Л.макс = 410 нм); 3) третью фракцию составили молодые эритроциты, не гемолизирующие даже в дистиллированной воде. На подсушенном зафиксированном спиртом неокрашенном мазке эти эритроциты под микроскопом выглядели как круглые клетки эритроидного ряда.
У бычка-мартовика старые, зрелые и молодые формы эритроцитов также гемолизировали дифференцированно: 1) первая, менее устойчивая фракция — в 0,9-0,64%-ном NaCl (406 нм); 2) вторая в диапазоне 0,56-0,27%-ного NaCl (408-410 нм) и 3) третья в диапазоне 0,18-0,0%-ного NaCl (412 нм) (см. рис. 2).
У скорпены, звездочета и бычка-кругляка гемоглобин из различающихся по осмотической резистентности фракций эритроцитов был только в окси-форме (412— 414 нм).
2.2. Пресноводные рыбы. Эритроциты большинства исследованных пресноводных видов, отловленных в разные сезоны, гемолизировали или имели следы гемолиза в физиологическом растворе уже в первые 15 мин. Так, гемолиз эритроцитов леща и плотвы в физиологическом растворе при 8 °С происходил перманентно, о чем свидетельствует непрерывное нарастание абсорбции в области Сорэ. При этом эритроциты леща и плотвы начинали гемолизировать, как правило, через сутки, у щуки через шесть суток. В преднерестовый период у щуки эритроциты в физиологическом растворе гемолизировали через трое суток, у леща — в течение суток; между тем при отстаивании плазмы и сыворотки — через семь дней (см. рис. 1).
У щук, отловленных летом, эритроциты начинали гемолизировать в 0,9-0,81%-ном растворе ЫаС1, массовый гемолиз происходил в 0,5%-ном ЫаС1. У щук, отловленных осенью, эритроциты начинали гемолизировать в 0,72%-ном ЫаС1, массовый гемолиз также происходил в 0,5%-ном ЫаС1. У щук, отловленных летом, при гемолизе всех эритроцитов выделялся только окси-гемоглобин, а у осенних щук первыми в диапазоне 0,9-0,81%-ный ЫаС1 гемолизировали эритроциты с мет-гемоглобином (406 нм), далее, в диапазоне 0,72-0,45%-ного ЫаС1 — эритроциты с мет- и окси-гемоглобином (408-410 нм), и последними в диапазоне 0,27-0,0%-ного ЫаС1 — эритроциты с окси-гемоглобином (414 нм) (рис. 3).
Abs Abs
0,90 0,81 0,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0,27 0,18 0,09 0 0,90 0,81 0,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0,27 0,18 0,09 0
NaCl, % NaCl, %
Рис. 3. Кривые осмотической резистентности эритроцитов щуки в летний (а) и осенний периоды (б):
а — неполовозрелые щуки; б — самка, 3-я стадия зрелости гонад (1); половозрелая щука, стадия не определена (2); сеголетки (3).
У половозрелой плотвы из водохранилища в весенне-летний период массовый гемолиз эритроцитов происходил в 0,45%-ном ЫаС1, у леща и синца был размыт в диапазоне 0,72-0,27%-ного ЫаС1. У половозрелых леща и плотвы из прудов (возраст 3+ и 4+) в весенний и осенний периоды эритроциты различались по осмотической резистентности: гемолиз эритроцитов осенних рыб начинался в 0,63-0,54%-ном ЫаС1, весенних рыб — в 0,72%-ном ЫаС1. Показатели резистентности эритроцитов осенних рыб из
Рыбинского водохранилища совпадали с таковыми для рыб из прудов. Объяснить сезонные различия резистентности эритроцитов можно не столько температурными показателями воды, сколько фактором питания: весенний материал зимовал в прудах, где рыбы не питались более шести месяцев, а осенние рыбы в нагульных прудах активно питались все лето, что не могло не сказаться на прочности мембран их эритроцитов.
Гемоглобин, освобождающийся из гемолизированных молодых и зрелых эритроцитов половозрелых синца, леща и плотвы в весенне-летний период был только в окси-форме (412-414 нм). При этом молодые эритроциты синца в отличие от леща и плотвы не гемолизировали даже в дистиллированной воде. Осмотическая резистентность молодых эритроцитов синца варьировала по сезонам: у летнего синца молодые эритроциты не гемолизировали, а у осенних синцов молодые эритроциты гемолизировали и в слабых растворах ЫаС1, и в воде.
Наиболее устойчивыми к гемолизу оказались эритроциты сеголетков и годовичков (лещ, плотва): они начинали гемолизировать в 0,27%-ном ЫаС1; эритроциты двухлеток — в 0,36%-ном №С1. На третьем году жизни осмотическая резистентность эритроцитов достигала минимальных дефинитивных показателей.
2.3. Тюлька. У тюльки обнаружено несколько фракций эритроцитов, различающихся по устойчивости к гемолизу: неустойчивая фракция, содержащая мет-гемоглобин, начинала гемолизировать в 0,72%-ном ЫаС1, более устойчивая фракция, содержащая окси-гемоглобин, гемолизировала в 0,45%-ном ЫаС1.
2.4. Красноперка. Эритроциты красноперок, отловленных в мае, были дифференцированы по устойчивости к гемолизу: менее устойчивая фракция гемолизировала в диапазоне 0,81-0,63%-ного ЫаС1, более устойчивая — в 0,63-0,36%-ном ЫаС1, обе фракции высвобождали только окси-гемоглобин (412-414 нм) (рис. 4). При доставке проб в лабораторию прошел гемолиз наименее устойчивой фракции эритроцитов. Измерение абсорбции в области Сорэ в этих образцах гемолизированной плазмы над осадком эритроцитов также показало наличие только окси-гемоглобина.
1,6 г
0,90 0,810,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0Д7 0,18 0,09 0 0,90 0,810,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0Д7 0,18 0,09 0 0,90 0,810,72 0,63 0,54 0,45 0,36 0,27 0,18 0,09 0
№С1, %
Рис. 4. Осмотическая резистентность эритроцитов красноперки, отловленной в мае (я, б) и октябре (в), у самок (я) и самцов: ¿II (в); ¿IV (1, 2) (б); ¿III (3) (б); ¿отнерестившихся (4) (б)
У красноперки, отловленной в октябре, первая фракция эритроцитов гемолизиро-вала в диапазоне 0,9-0,63%-ного ЫаС1, освобождая мет-гемоглобин (406-408 нм), вторая — в 0,63-0,36%-ном ЫаС1 с мет- и окси-гемоглобином (410 нм), третья — в 0,36-0,0%-ном ЫаС1 с окси-гемоглобином (412 нм). При этом в отличие от майских образцов молодые эритроциты октябрьской красноперки не гемолизировали в дистиллированной воде. Разрушали их с помощью ультразвука, содержащийся в них гемоглобин был
в окси-форме. Достоверных отличий эритроцитов по показателям резистентности у крупночешуйной и мелкочешуйной красноперок не выявлено.
Итак, проведенный сравнительный анализ показателей резистентности эритроцитов у разных представителей Те1го$1г1 позволил выявить некоторые закономерности:
1) снижение солености водной среды в целом коррелировало со снижением устойчивости эритроцитов рыб к гемолизу;
2) выявлена широкая вариабельность резистентности эритроцитов у пресноводных рыб. Различия коррелировали с экологическими особенностями видов: у активных и хищных рыб эритроциты были более прочными (хищник-засадчик — щука, хищник-пелагофил — судак), у менее подвижных нехищных видов — менее прочными, гемолиз крови у таких рыб носил зачастую перманентный характер (планктофаг — синец, бентофаг-мезобентофил — лещ, всеядный зоофаг — плотва);
3) эритроциты рыб в весенне-летний период отличались меньшей устойчивостью к внутрисосудистому гемолизу по сравнению с осенним периодом;
4) среди половозрелых пресноводных рыб, находящихся в разных фазах репродуктивного цикла, высокие показатели осмотической резистентности эритроцитов отмечены у рыб с гонадами 4-й стадии зрелости;
5) в онтогенезе леща и плотвы максимальные показатели осмотической резистентности эритроцитов в гипотонических растворах №С1 выявлены у сеголетков и годовичков; не выявлено ни одного случая внутрисосудистого гемолиза эритроцитов у сеголетков;
6) в весенне-летний период у молоди и половозрелых рыб (пресноводных, морских, проходной красноперки) выявлено по несколько фракций эритроцитов, различающихся по осмотической резистентности; все они содержали только окси-гемоглобин. Осенью у рыб (пресноводные, красноперка) обнаружено несколько различающихся по резистентности фракций эритроцитов, одни из которых содержали мет-, другие — окси-гемоглобин;
7) практически во всех группах рыб отмечено формирование разнокачественной устойчивости к гемолизу молодых и зрелых эритроцитов: старые эритроциты, содержащие мет-гемоглобин, и зрелые эритроциты, содержащие окси-гемоглобин, были менее устойчивы к гемолизу по сравнению с молодыми эритроцитами, содержащими окси-гемоглобин. Молодые эритроциты были неоднородны по резистентным свойствам.
Выявленные закономерности предполагают участие факторов солености воды, образа жизни, питания, репродуктивной фазы и стадии онтогенеза в формировании разнокачественности эритроцитов рыб по параметру осмотической резистентности. Сезонная изменчивость резистентных параметров эритроцитов формируется в результате сочетания этих факторов. При этом роль каждого фактора не всегда была однозначной. Иллюстрацией тому являются два примера.
— У солоноватоводного вида — тюльки, отловленной в пресных водах Рыбинского водохранилища, резистентность эритроцитов при хранении была максимальной среди исследованных пресноводных и морских Тг1го$1г1. В то же время у красноперок, которые, подобно тюльке, исторически формировались как солоноватоводные виды (в доледниковую фазу Японское море представляло собой мелководный пресноводный водоем, впоследствии испытавший осолонение) [25, 26], эритроциты оказались значительно менее устойчивыми к хранению, чем у тюльки.
— Что касается образа жизни, то широкая вариабельность резистентности эритроцитов рыб действительно коррелировала с разными экологическими особенностями видов; однако касалось это только пресноводных рыб, а у морских рыб такая корреляция явно не прослеживалась.
Эти два примера указывают на наличие специфичности параметров резистентности эритроцитов как на уровне видов, так и на уровне групп видов, населяющих тот или иной биотоп.
Фактор питания однозначно влиял на устойчивость эритроцитов рыб и из водохранилища, и из прудов, вследствие чего осенняя выборка рыб, нагулявшихся в течение лета, имела более прочные к гемолизу мембраны эритроцитов. Вероятно, причина этого кроется в сезонной динамике температуры воды, которая опосредованно действует на кроветворную ткань через пищевую активность вида [27]. Между тем непосредственное повышение температуры инкубации эритроцитов щуки в экспериментах in vitro приводило к снижению их осмотической резистентности [9].
Что касается роли репродуктивной фазы, то из полученных данных не складывается полного представления о преобразованиях резистентных свойств эритроцитов в течение репродуктивного цикла. Для оценки роли этого фактора требуются специальные исследования. В обзоре А. А. Солдатова [22] отмечено, что в нерестовый период физиологические системы рыб претерпевают радикальные изменения [28, 29], направленность которых может быть разной даже в рамках одного и того же вида; однако у некоторых видов никаких существенных изменений в данный период не происходит. В той же работе отмечено, что предшествующий нересту режим питания вносит существенные коррективы в параметры красной крови нерестящихся рыб [30].
Выводы
1. Снижение солености водной среды в целом коррелировало со снижением устойчивости эритроцитов рыб к гемолизу.
2. Показатели резистентности эритроцитов у пресноводных рыб коррелировали с экологическими особенностями видов: у активных и хищных рыб эритроциты были более прочными, у менее подвижных нехищных видов — менее прочными.
3. Эритроциты рыб в весенне-летний период отличались меньшей устойчивостью к внутрисосудистому гемолизу по сравнению с осенним периодом.
4. Среди половозрелых пресноводных рыб наиболее высокие показатели осмотической резистентности эритроцитов отмечены у рыб с гонадами 4-й стадии зрелости.
5. В онтогенезе леща и плотвы максимальные показатели осмотической резистентности эритроцитов в гипотонических растворах №С1 выявлены у сеголетков и годовичков.
6. В весенне-летний период у молоди и половозрелых рыб выявлена разнокаче-ственность эритроцитов по осмотической резистентности; при этом все эритроциты содержали только окси-гемоглобин. Осенью различающиеся по резистентности фракции эритроцитов содержали мет- или окси-гемоглобин.
7. Молодые и зрелые эритроциты различались по устойчивости к гемолизу: старые эритроциты, содержащие мет-гемоглобин, и зрелые эритроциты, содержащие окси-ге-моглобин, были менее устойчивы к гемолизу по сравнению с молодыми эритроцитами,
содержащими окси-гемоглобин. Молодые эритроциты были неоднородны по резистентным свойствам.
8. Сезонная изменчивость резистентных параметров эритроцитов формируется в результате сочетания многих факторов, среди которых — соленость, образ жизни, питание, репродуктивная фаза, стадия онтогенеза, видоспецифичность и др.
Литература
1. Weber R. E., Vinogradov S. N. Nonvertebrate hemoglobins: functions and molecular adaptations // Physiol. Rev. 2001. Vol. 81. P. 569-628.
2. Burmester T., Ebner B., Weich B., Hankeln T. Cytoglobin: a novel globin type ubiquitously expressed in vertebrate tissues // Mol. Biol. Evol. 2002. Vol. 19. P. 416-421.
3. Burmester T., Hankeln T. Neuroglobin: A respiratory protein of the nervous system // News Physiol. Sci. 2004. Vol. 19. P. 110-113.
4. Ancestral hemoglobins in Archaea / Freitas T. A., Hou S., Dioum E. M., Saito J. A., Newhouse J., Gonzalez G., Gilles-Gonzalez M. A., Alam M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 6675-6680.
5. Roesner A., Fuchs C., Hankeln T., Burmester T. A. Globin gene of ancient evolutionary origin in lower Vertebrates: evidence for two distinct globin families in animals // Mol. Biol. and Evol. 2005. Vol. 22(1). P. 12-20.
6. Попова И. Е. Изучение структурных свойств эритроцитов крови новорожденных при оксида-тивном стрессе, вызванном гипоксией: дис. ... д-ра биол. наук. Воронеж, 2007. 250 с.
7. Андреева А. М., Рябцева И. П., Лукьяненко В. В. Адаптации дыхательной функции крови у пресноводных костистых рыб // Матер. 28-й Междунар. конф. «Биол. рес. Белого моря и внутренних водоемов европейского Севера». Петрозаводск: КарНЦ РАН. 2009. С. 33-39.
8. Иванов А. А. Физиология рыб. М.: Мир, 2003. 284 c.
9. Андреева А. М., Рябцева И. П. Механизмы адаптаций дыхательной функции крови у Teleostei // Вопр. ихтиологии. 2011. Т. 51, № 6. С. 834-843.
10. Serpunin G. G., Likhatchyova O. A. Use of the ichthyohaematological studies in ecological monitoring of the reservoirs // Acta Vet. Brno. 1998. Vol. 67. P. 339-345.
11. Kiron V., Takeuchi T., Watanabe T. The osmotic fragility of erythrocytes in rainbow trout under different dietary fatty acid status // Fish. Sci. 1994. Vol. 60. P. 93-95.
12. Messager J. L., Stephan G., Quentel C., Baudin-Laurencin F. Effects of dietary oxidized fish oil and antioxidant deficiency on histopathology, haematology, tissue and plasma biochemistry of sea bass Dicentrarchus labrax // Aquat. Living Resour. Vivantes Aquat. 1992. Vol. 5. P. 205-214.
13. Obach A., Quentel C., Laurencin F. B. Effect of alpha-tocopherol and dietary oxidized fish oil on the immune response of sea bass // Dis. Aquat. Org. 1993. Vol. 15. P. 175-185.
14. Селье Г. Очерки об общем адаптационном синдроме. М.: Медгиз, 1960. 254 с.
15. Effects of daily managements stress on haematology and blood rheology of the gilthead seabream / Pages T., Gomez E., Suner O., Viscor G., Tort L. // J. Fish Biol. 1995. Vol. 46. P. 775-786.
16. Микряков Д. В., Микряков В. Р., Силкина Н. И. Изменение морфофизиологических показателей иммунокомпетентных органов карпа Cyprinus carpio под влиянием гормона стресса // Вопросы ихтиологии. 2007. Т. 47, № 3. С. 418-424.
17. Алексеев Г. А., Берлинер Г. Б. Гемоглобинурии. М.: Медицина, 1972. 248 с.
18. Идельсон Л. И., Дидковский Н. Д., Ермильченко Г. В. Гемолитические анемии. М.: Медицина, 1975. 254 с.
19. Потемкин В. В. Эндокринология. М.: Медгиз, 1986. 432 с.
20. Файнштейн Ф. Э., Козинец Г. И., Бахрамов С. М., Хохлова М. П. Болезни системы крови. Ташкент: Медицина, 1987. 319 с.
21. Knoph M. B., Thorud K. Toxicity of ammonia to Atlantic salmon (Samo salar L.) In seawater — effect on plasma osmolality, ion, ammonia and glucose levels and hematologic parameters // Comp. Biochem. Physiol. 1966. Vol. 113A. P. 375-381.
22. Cолдатов А. А. Особенности организации и функционирования системы красной крови рыб // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2005. Т. 41, № 3. С. 217-224.
23. Seasonal intrathymic erythropoietic activity in trout / Alvarez F., Flano E., Villena A. J., Zapata A., Razquin B. E. // Dev. Comp. Immunol. 1994. Vol. 18. P. 409-420.
24. Иванова Н. Т. Атлас клеток крови рыб (сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб). М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. 184 с.
25. Lindberg G. U. Quaternary period in light of biogeographical data. Moscow—Leningrad: USSR Academy of Sciences Publisher, 1955. 334 p.
26. Nishimura S. Origin of the Japan Sea. Tokyo: Tsuijishokan, 1974. 249 p.
27. Galindez E. J., Aggio M. C. The spleen of Mustelus schmitti (Chondrichthyes, Triakidae): a light and electron micriscopic study // Ichthyol. Res. 1998. Vol. 45. P. 179-186.
28. Маслова М. Н., Солдатов А. А., Тавровская Т. В. Сезонная динамика состояния системы красной крови некоторых черноморских рыб // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1988. Т. 24. С. 516-521.
29. Маслова М. Н., Тавровская Т. В. Динамика сезонных изменений в системе красной крови низших позвоночных: сезонная динамика эритропоэза у форели Salmo gairdneri // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1991. Т. 27. С. 796-798.
30. Values of haematological indices of wells (Silurus glanis L.) in relationship to the level of nutrition during the pre-spawning period / Svobodova Z., Kolarova J., Modra H., Vajcova V., Hamackova J., Kouril J., Kozak P. // Acta Vet. Brno. 1998. Vol. 67. P. 235-242.
Статья поступила в редакцию 13 июня 2013 г.
