CC BY
16© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
Е.В.Зуева', НА.Стоянова1, Н.К.Токаревич', Арег А. Тотолян1-2
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СЕРОВАРОВ LEPTOSPIRA МЕТОДОМ MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
'НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, С.-Петербург, 2Первый С.-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова
Цель. Попытка использования метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации изолятов лептоспир на уровне сероваров. Материалы и методы. В исследование были включены 8 референсных штаммов Leptospira spp. и 11 штаммов лептоспир, выделенных от больных лептоспирозом и инфицированных животных в Северо-Западном регионе России. Масс-спектры всех исследуемых штаммов получали прямым профилированием клеточных экстрактов. Созданные главные спектральные профили (MSP) референсных штаммов использовали для идентификации изолятов. Оценку идентификации осуществляли путем вычисления коэффициентов совпадения отдельных спектров каждого изолята с MSP всех референсных штаммов. Результаты. Результаты идентификации показали схожесть спектров изолятов, относящихся к серогруппам Pomona, Ictero-haemorrhagiae и Canicola, с MSP сапрофитного штамма L. biflexa Patoc I. Предполагается, что спектры исследуемых штаммов содержали в своем составе пики полисахаридных О-антигенов. При этом максимальные средние значения коэффициентов совпадения между спектрами изолятов и MSP патогенных референсных штаммов лептоспир правильно совпадали с типом серовара изолята. Заключение. Дальнейшие расширенные исследования могут быть положены в основу разработки быстрого и простого метода типирования возбудителей лептоспироза на уровне сероваров с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Журн. микробиол., 2017, № 1, С. 42—49
Ключевые слова: Leptospira spp., серотипирование, серовары, MALDI-TOF масс-спектрометрия
E.V.Zyeva', N.A.Stoyanova1, N.K.Tokarevich', Areg A.Totolyan'-2
IDENTIFICATION OF LEPTOSPIRA SEROVARS BY MALDI-TOF MASS-SPEC-TROMETRY
'Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 2Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Russia
Aim. An attempt to use MALDI-TOF mass-spectrometry method for identification of lep-tospiral isolates on the serovar level. Materials and methods. 8 reference Leptospira spp. and 11 leptospira strains isolated from leptospiral patients and infected animals in the North-Western region of Russia were included into the study. Mass-spectra of all the studied strains were obtained by direct profiling of cell extracts. The created main spectral profiles (MSP) of reference strains were used for identification of isolates. Evaluation of identification was carried out by calculating coefficients of matching rate of separate spectra of each isolate with MSP of all the reference strains. Results. Results of identification have shown the similarity of spectra of isolates belonging to Pomona, Icterohaemorrhagiae and Canicola serogroups, with MSP of saprophyte strain L. biflexa Patoc I. It is assumed that spectra of the studied strains contained peaks of polysaccharide O-antigens. Wherein maximum mean values of matching rate coefficients between spectra of isolates and MSP of pathogenic reference strains of leptospira correctly matched serovar type of the isolate. Conclusion. Further extended studies may form the base of development of a simple and rapid method of typing of leptospirosis causative agents on the level of serovars using MALDI-TOF mass-spectrometry.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 1, P. 42—49 «
Key words: Leptospira spp., serotyping, serovars, MALDI-TOF mass-spectrometry ВВЕДЕНИЕ
Лептоспироз — зоонозное бактериальное заболевание, наиболее распространенное в районах с высоким уровнем осадков и теплым климатом. Ежегодно лептоспирозом заболевают около одного миллиона человек и регистрируется до 60 ООО смертей среди населения планеты. При этом наибольшая заболеваемость и летальность отмечаются в самых бедных регионах мира, а также в местах, где санитарно-эпидемиологический надзор осуществляется не на должном уровне [12]. Согласно данным глобальных исследований Международного общества по лептоспирозу, ежегодно регистрируется 350 ООО — 500 ООО тяжелых случаев течения заболевания [9]. Эти оценки свидетельствуют о значимости лептоспироза как одного из ведущих зоонозных заболеваний. Ожидается, что в ближайшие десятилетия лептоспироз станет важной эпидемиологической проблемой в связи с изменениями климата и демографии нашей планеты. Факторами риска повышения заболеваемости лептоспирозом могут стать глобальное потепление, частые экстремальные климатические явления, урбанизация, миграция [14].
Возбудителями лептоспироза являются бактерии рода Leptospira, принадлежащие к самостоятельному семейству Leptospiraceae в порядке Spirochaeta-les. Генетическая классификация, основанная на методе ДНК-ДНК гибридизации, насчитывает 21 вид лептоспир [18], которые можно разделить на три эволюционные ветви: 1) патогенные виды, 2) промежуточные, которые являются патогенно-подобными видами, 3) сапрофиты [Picardeau М., 2014]. Согласно традиционной серологической классификации, основанной на структурной неоднородности полисахаридных О-антигенов. входящих в состав липополисахаридов (ЛПС) клеточной мембраны грамотрицательных бактерий, представители рода лептоспир подразделяются более чем на 300 сероваров, которые сгруппированы в 29 серогрупп в соответствии с антигенным родством [11,16].
Лептоспироз имеет широкое географическое распределение из-за большого спектра млекопитающих (грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные), являющихся хозяевами инфекционного агента и выделяющих его с мочой в окружающую среду. Распространение различных сероваров лептоспир связано с одним или несколькими хозяевами, которые служат в качестве резервуара инфекции. Например, крысы служат в качестве резервуара для сероваров icterohaemorragiae, в то время как собаки, чаще всего, могут быть источником серовара canicola. [1, 6, 19]. В России наибольшее эпидемиологическое значение имеют возбудители серовариантов icterohaemorrhagiae, copenhageni, canicola, grippotyphosa, pomona, tarassovi, sejroe [2, 6], относящиеся к трем геномным видам: L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpetersenii. Таким образом, идентификация штаммов лептоспир, выделенных от больных и инфицированных животных, на уровне сероваров и серогрупп важна для решения эпидемиологических задач и понимания распространенности лептоспир в различных регионах.
В настоящее время таксономическое типирование подвидов лептоспир базируется на классических серологических методах, таких как реакция микроскопической агглютинации (РМА) для определения серогруппы и тест-перекрестной агглютинации-абсорбции для идентификации сероваров. Серо-типирование изолятов лептоспир является сложной процедурой, которая
может быть выполнена только в референсных центрах. По этой причине в качестве альтернативы были предложены различные молекулярно-генетические методы [9], среди которых наиболее часто используемыми являются секвенирование гена 16S рибосомальной РНК и мультилокусное секвенирование-типирование. Эти методы генотипирования позволяют дифференцировать лептоспиры на уровне видов и в настоящее время используются преимущественно в качестве инструмента популяционного филогенетического анализа для более глубокого понимания эволюции лептоспир [5,8, 10,15, 20].
Таким образом, серотипирование лептоспир до сих пор остается чрезвычайно ценным инструментом эпидемиологических исследований, который нуждается в новых подходах к их идентификации и простых в исполнении современных методах типирования штаммов лептоспир на уровне серо-варов.
В последнее десятилетие для идентификации бактерий и грибов стал использоваться метод матрикс-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Появились единичные литературные данные, свидетельствующие о том, что MALDI-TOF масс-спектрометрия может быть быстрым и надежным методом идентификации лептоспир путем создания библиотеки спектров [3,13]. Кроме того, показано, что масс-спекгрометрия позволяет идентифицировать штаммы лептоспир на уровне видов аналогично методам секвенирования [18], определена возможность применение этого метода для категоризации штаммов лептоспир на патогенные и непатогенные группы [21 ], а также для лабораторного контроля пересева эталонных штаммов Leptospira, используемых в РМА [4].
Цель данной работы — попытка применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации штаммов Leptospira, выделенных от больных лептоспирозом людей и инфицированных животных, на уровне сероваров с использованием подхода построения библиотеки эталонных спектров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали набор референсных штаммов Leptospira spp., применяемый в РМА, включающий 4 штамма вида L. interrogans, 1 штамм вида L. borgpetersenii, 2 штамма вида L. kirschneri и 1 сапрофитный штамм L.biflexa, а также 11 штаммов лептоспир, выделенных в Северо-Западном регионе России. Все исследуемые штаммы были из коллекции С.-Петербургского НИИ им. Пастера. Предварительная характеристика изолятов была проведена на уровне определения серогруппы методом РМА и сероваров методом перекрестной агглютинации-абсорбции. Три штамма исследуемых изолятов относились к серогруппе Pomona (серовары mozdoc и рошопа), два штамма — к серогруппе Icterohaemorrhagiae (серовары copenhageni), два штамма—к серогруппе Canicola, два штамма — к серогруппе Grippotyphosa и два штамма — к серогруппе Tarassovi. Референсные штаммы и штаммы изолятов культивировали в течение 14 дней в фосфатно-сывороточной среде Терских при 28°С. Масс-спектры клеточных экстрактов были получены на масс-спектрометре «Microflex RLF» (Bruker Daltonics, Германия) с использованием в качестве калибратора бактериального тест-стандарта (Bruker Daltonics, Германия). Эталонные спектры 8 референсных штаммов получены путем объединения не менее 15 отдельных спектров каждого штамма в главный спектральный профиль (MSP). Кластерный анализ спектров осуществляли
методом главных компонент и путем построения MSP дендрограммы с помощью программного обеспечения «Biotyper 3.1» (Bruker Daltonics). Оценка идентификации 11 штаммов Leptospira, выделенных от людей и инфицированных животных, осуществлялась путем вычисления коэффициентов совпадения не менее 6 отдельных спектров каждого изолята со всеми эталонными спектрами. Результаты сравнительной идентификации обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism v.6.0. Различие между коэффициентами совпадения спектров изолятов с референсными штаммами оценивали однофакторным дисперсионным анализом AN OVA методом множественного сравнения с использованием критерия Даннета при а= 0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Для создания библиотеки эталонных масс-спектров был проведен масс-спектрометрический анализ семи хорошо охарактеризованных патогенных референсных штаммов Leptospira spp., входящих в диагностический набор для постановки РМА, и одного непатогенного штамма Patoc I. Оценка отдельных спектров, включенных в состав эталонного спектра каждого референсного штамма, проведенная с помощью кластерного анализа методом главных компонент (рис. 1), показала четкое разделение отдельных спектров на кластеры согласно соответствующим сероварам. Визуализация результатов анализа представлена в виде 3-мерного графика, в котором система координат (основные компоненты) отражает линейную комбинацию коэффициентов корреляции Тау-Кендалла между множеством значений интенсивности пиков в спектрах. Как видно на рис. 1, отдельные спектры каждого референсного штамма, представленные в виде точек, имели близкие коэффициенты корреляции и группировались в кластеры согласно соответствующим сероварам. При этом спектры сероваров pomona, со-penhageni, icterohaemorrha-giae, grippotyphosa и ta-rassovi давали четкое разделение на однородные кластеры. В то же время, спектры сероваров patoc, canicola и mozdoc, хотя и образовывали отдельные кластеры, но коэффициенты корреляции между их пиками не имели достаточного различия для удовлетворительного визуального расхождения их кластеров.
Для определения сход-
Рис. 1. Анализ масс-спектров референсных штаммов Leptospira spp. методом главных компонент.
Значения по осям координат соответствуют коэффициентам корреляции Тау-Кендалла между спектрами. Кластеры: 1— L.interrogans copenhageni st. М20, 2 — L.interrogans icterohaemorrhagiae st. RGA, 3 — L.interrogans pomona st. Pomona, 4 — L.biflexa patoc st. Patoc I, 5 — L.kirschneri mozdoc st. 5621, 6 — L.interrogans canicola st. Hond Utrecht IV; 7 — L.kirschneri grippotyphosa st. Moskva V, 8 — L.borgpetersenii tarassovi st. Perepelitsin.
MSP Dendrogram
st 329 К 1
st Moskva V V 1
st 338 М J
st Perepelicin
st 282 T > II
st 288 Б J
st Patos 1 \
st 5621
stCel 85
st Pomona
st RGA
SIM20 \
st Hond Utrecht >lll
st С2000
st 334 M
stKp.1
st 125 А
st 278 P
st Kp.3
1000 900 800 700
600 500 400 Distance Level
300 200 100 0
ства и таксономиеского родства между референсными штаммами и исследуемыми изолятами Leptospira spp. был проведен анализ их главных спектральных профилей с помощью построения дендро-граммы (рис. 2), представляющей собой иерархию всех 18 штаммов. Видно, что профили всех штаммов группировались в три подгруппы, дистанция между которыми, обозначенная пунктирными линиями, составляла около 130, 160 и 220 арбитральных единиц. При этом подгруппа I включала штаммы, относящиеся к серогруппе Tarassovi, подгруппа II включала штаммы серогруппы Grippoty-phosa. Подгруппа III содержала профили штаммов серогрупп Pomona, Icterohaemorrhagiae, Canicola, а также непатогенного штамма Patoc I.
При идентификации изолятов лептоспир для каждого исследуемого штамма был назначен контрольный эталонный спектр серовара, на уровне которого изолят был предварительно серотипирован. Из представленных в табл. результатов видно, что для всех изолятов при сопоставлении их спектров с
Результаты идентификации изолятов лептоспир методом MALDI-TOF масс-спектрометрии
Рис. 2. Иерархическая кластеризация спектров рефе-ренсных щтаммов и изолятов Leptospira.
Ось абсцисс — расстояние с баллами значений меры близости (расстояние Евклида) между спектральными профилями. Произвольные вертикальные пунктирные линии обозначают отсечение значений подобия между кластерами.
Серогр. изолята (PMA)
Штамм изолята
Среднее значение (М) коэффициента совпадения изолята с MSP контрольного серовара и отличие от него средних значений коэффициентов совпадения изолята с сероварами референсных штаммов
Pomona mozd. patoc canicola copenh. ictero,
grippot.
tarass.
Ictero.
Ictero.
Canicol.
Canicol.
Pomona
Pomona
Pomona
Grippot.
Grippot.
Tarass.
Tarass.
346A
278P
C2000
M480
Cb185
Kpl
Kp3
338M
329K
288Б
282T
0,15 0,32 0,13 1,6*** M=2,7
0,34 0,53 0,39* 0,09 0,50**
0,67*** M=2,3 0,66* M=2,3
0,15 0,77*** 0,55 1,1*8
0,52** 0,48** 0,79** 1,11*
-0,08 0,12 0,04 0,15 0,27 -0,07 -0,06 0,19 0,31* 1,4*** 1,20**
0,08 0,21 M=2,l M=2,4 0,57** 0,21 0,25 0,41*
M=2,2 M=2,3 0,40* 0,13 0,49* 0,50** 0,66* 0,27
0,04 0,16 0,23 0,38
0,56* 1,30***
1,09** 1,46***
0,42* 0,84***
0,23 2,0***
0,63*** 0,93*** 0,85***
0,30 0,38* 0,88***
0,13 0,52* 1,64***
0,39* M=2,l 0,65**
0,66*** 0,47** 0,95*** M=2,3 1,10***
0,94*** 0,89** 0,91*** 1,15*** M=2,2'
0,83 1,57*** 1,21** 1,47** M=2,0
Примечание. *Р<0,05; **Р<0,01; *** Р<0,001 — уровень значимости различия коэффициентов совпадения согласно тесту множественного сравнения с применением критерия Даннета.
MSP патогенных референсных штаммов наиболее высокие баллы коэффициентов совпадения регистрировались у соответствующих контрольных серова-ров. В то же время, при сопоставлении с сапрофитным штаммом Patoc I у изолятов 125А, Кр1 и КрЗ оценки совпадения с ним были немного более высокие, чем с соответствующими контрольными сероварами. Кроме того, не было достоверно значимого различия между оценками совпадения большинства изолятов с сапрофитом, за исключением изолятов, которые относились к серогруппам Tarassovi и Grippotyphosa. Наиболее достоверно значимые показатели классификации наблюдались у изолятов серогрупп Grippotyphosa, Pomona и Tarassovi, в то время как у изолятов серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae статистически значимое различие было только с сероварами tarassovi и grippotyphosa.
ОБСУЖДЕНИЕ
Методы серотипирования, такие как РМА и тест перекрестной агглютинации-абсорбции, являются трудоемкими, требующими наличия и поддержания коллекции эталонных штаммов, а также панелей стандартных кроличьих сывороток, специфичных к различным серогруппам и сероварам лептоспир. Поскольку патогенные Leptospira spp. насчитывают более 250 сероваров [11], то к большинству из них соответствующие антисыворотки отсутствуют, что ограничивает возможности этих методов по типированию эпидемиологически важных штаммов. В то же время, несмотря на прогресс в области молекулярно-генетических исследований в последние десятилетия, методы генотипирования пока не позволяют идентифицировать лептоспиры на уровне сероваров.
Для определения возможности типирования лептоспир методом MALDI-TOF масс-спектрометрии был применен подход построения библиотеки эталонных спектров референсных штаммов Leptospira spp., относительно которых проведен сравнительный анализ спектров изолятов. Иерархия спектров всех исследуемых штаммов, представленная в виде дендрограммы, выявила дифференциацию их на три подгруппы, при этом две из них соответствовали серогруппам Tarassovi и Grippotyphosa. Третья подгруппа объединяла штаммы сразу нескольких серогрупп, включая и сапрофитный штамм Patoc I. Небольшое различие в баллах Евклидового расстояния между профилями спектров в этом кластере свидетельствует о значительной мере близости между патогенными штаммами серогрупп Pomona, Icterohaemorrhagiae, Canicola и непатогенным штаммом Patoc I. Эти результаты согласуются с хорошо известными данными о том, что сыворотки крови больных лептоспиро-зом имеют перекрестную реактивность в РМА с некоторыми сапрофитными штаммами [7,20]. Доказано, что иммунологический перекрест этих сапрофи-тов с патогенными сероварами обусловлен сходством строения их ЛПС, что позволило использовать полисахаридный антиген L. biflexa Patoc I в производстве диагностических наборов для определения IgG и IgM к основным возбудителям лептоспироза [17].
Результаты идентификации десяти изолятов также показали отсутствие достоверно значимых различий между оценками совпадения большинства их с сапрофитным штаммом Patoc I. Полученные результаты схожести патогенных штаммов, относящиеся к серогруппам Pomona, Icterohaemorrhagiae и Canicola, с непатогенным штаммом Patoc I позволили предположить, что как исследуемые спектры изолятов, так и эталонные спектры референсных штаммов содержат в своем составе пики не только белков, но и полисахаридных
О-антигенов, структурное различие которых обусловливает серологическую специфичность. По-видимому, присутствие в спектрах полисахаридных пиков обусловило получение максимальных значений коэффициентов совпадения изолятов с эталонными спектрами соответствующих сероваров патогенных штаммов, на уровне которых изоляты были серотипированы, и в целом позволило правильно идентифицировать изоляты согласно их серологической классификации.
Дальнейшие исследования по созданию библиотеки эталонных спектров с включением в нее широкого набора референсных штаммов Leptospira spp., совершенствованию протокола масс-спектрометрии, а также проведение испытания на большом количестве образцов выделенных штаммов могут способствовать применению быстрого, простого в исполнении метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации возбудителей лепто-спироза на уровне сероваров.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы в Российской Федерации: современные особенности эпидемического проявления природных и техногенных очагов. Ветеринарная патология 2004,4:54-57.
2. Ананьина Ю.В., Петров Е.М. Лептоспирозы в России: этиологическая структура и современная этиология. Пест-Менеджмент 2006,1: 8-10.
3. Бренева Н.В., Афанасьев М.В., Шаракшанов М.Б. и др. MALDI-TOF масс-спектро-метрический анализ клеточных белков в идентификации представителей Leptospira. Журн. микробиол. 2014,4: 36-43.
4. Зуева Е.В., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К., Тотолян Арег A. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ штаммов Leptospira spp., используемых в серодиагностике лептоспироза. Журн. микробиол. 2015,6: 28-36.
5. Останкова Ю.В., Семенов А.В., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. и др. Типирование штаммов Leptospira spp. на основе 16S rRNA. Журн. микробиол. 2016, 1: 35-39.
6. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний лептоспирозами. Методические указания 3.1.1128-02. М., МЗ РФ, 2002.
7. Addamiano L, Babudieri В. Water strains of Leptospira in the serodiagnosis of human and animal leptospirosis. Bull. World Health Organ. 1968, 39:925-934.
8. Ahmed A., Thaipadungpanit J., Boonsilp S. et al. Comparison oftwo multilocus sequence based genotyping schemes for Leptospira species. PLoS Negl. Trap. Dis. 2011, 5: el374.
9. Ahmed A., Grobusch M.P., Klatser P.R., Hartskeerl R.A. Molecular approaches in the detection and characterization of Leptospira. J. Bacterid. Parasitol. 2012, 3:1000133.
10. Boonsilp S., Thaipadungpanit J., Amornchai P. et al. A single multilocus sequence typing (MLST) scheme for seven pathogenic Leptospira species. PLoS Negl. Trap. Dis. 2013, 7 (1): el 954.
11.Cerqueira G.M., Picardeau M. A century of Leptospira strain typing. Infect. Genet. Evol. 2009,9:760-768.
12. Costa F., Hagan J. E., Calcagno J. et al. Global morbidity and mortality of leptospirosis: A systematic review. PLoS Negl. Trop. Dis. 2015, 9: e0003898.
13. Djelouadji Z., Roux V., Raoult D. et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry identification of Leptospira organisms. Vet. Microbiol. 2012, 6: 142-146.
14. Lau C.L., Smythe L.D., Craig S.B., Weinstein P. Climate change, flooding, urbanisation and leptospirosis: fuelling the fire? Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2010b, 104:631-638.
15. Leon A., Pronost S., Fortier G. et al. Multilocus sequence analysis for typing Leptospira interrogans and Leptospira kirschneri. J. Clin. Microbiol. 2010, 48 (2): 581-585.
16. Levett P.N. Leptospirosis. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14: 296-326.
17. Matsuo K., Isogai E., Araki Y. Control of immunologically crossreactive leptospiral infection by administration of lipopolysaccharides from a nonpathogenic strain of Leptospira biflexa. Microbiol. Immunol. 2000,44: 887-890.
18. Rettinger A., Krupka I., Grünwald К. et al. Leptospira spp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNAgene sequencing and multi locus sequence typing (MLST). BMC Microbiology 2012, 12:185.
19. Stoyanova N., TokarevichN., Gracheva L. et al. Leptospirosis in North-West Russia. EpiNorth. 2004, 2: 29-32.
20. Voronina O.L., Kunda M.S., Aksenova E.I. et al. The characteristics of ubiquitous and unique Leptospira strains from the collection of Russian centre for leptospirosis. BioMed Res. Int. 2014: 649034.
21. Xiao D., Zhang C., Zhang H. et al. A novel approach for differentiating pathogenic and nonpathogenic Leptospira based on molecular fingerprinting. J. Proteomics. 2015,119: 1-9.
Поступила 25.08.16
Контактная информация: Зуева Елена Викторовна, к.б.н., 197101, С.-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)232-31-55
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
И.В.Савельева1, С.Н.Тихонов2, В.Н.Савельев1, Д.А.Ковалев1, С.В.Писаренко1, Е.С.Котенев1, Б.В.Бабенышев1, Л.С.Зинич2, Н.Н.Пидченко2, А.Н.Куличенко1
РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ В УКРАИНЕ В 1994 - 2011 ГГ.
'Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, 2Противочумная станция Республики Крым, Симферополь
Цель. Ретроспективный анализ биологических и молекулярно-генетических свойств штаммов возбудителя холеры, выделенных в период эпидемий в Украине в 1994 — 2011 гг. Материалы и методы. С помощью традиционных бактериологических и генетических методов исследованы фенотипические и молекулярно-генетические свойства 5 штаммов холерных вибрионов биовара Эль Тор, выделенных от больных холерой, и 4 штамма — из объектов окружающей среды. Детекцию ДНК генов токсигенности и генов, присущих биовару Эль Тор или классическому, осуществляли методом ПЦР с использованием набора реагентов: «АмплиСенс-Vibrio cholerae FRT» и «Гены Vibrio cholerae ctxB-rstR-rstC, РЭФ» (экспериментальная тест-система). Секвенирование геномов 4 штаммов возбудителя холеры осуществляли на генетическом анализаторе Ion Torrent Personal Genome Machine. Результаты. Штаммы холерных вибрионов, идентифицированные в Украине в 1994 и 2011 гг. как типичный токсигенный биовар Эль Top (V.cholerae 01, El Tor, Ogawa, Hly-, ctxA+, tcpA+), содержат в своем геноме гены классического холерного вибриона и являются генетически измененными (гибридными) вариантами холерного вибриона биовара Эль Тор, продуцирующими энтеротоксин СТ1 и обладающими повышенной вирулентностью, что клинически выразилось в преобладании тяжелых форм течения холеры в Мариуполе Донецкой области в 2011 г. Геномные последовательности четырех исследуемых штаммов депонированы в международную базу данных DDBJ/EMBL/GenBank.3ao/oi/eHHe. По результатам сравнения геномных последовательностей исследуемых штаммов с геномами штаммов V. cholerae из международной базы данных GenBank установлено, что исследуемые изоляты входят в клад штаммов, ассоциируемых со вспышками холеры на Гаити и на Азиатском континенте, откуда в 2010 г. генетически измененные штаммы холерных вибрионов биовара Эль Тор были завезены на Гаити.
Журн. микробиол., 2017, № 1, С. 49—55
Ключевые слова: Vibrio cholerae, холера, ПЦР, генотипирование, гибридные варианты биовара Эль Тор
