CC BY
32© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
Ю.В.Останкова1, А.В.Семенов1, Н.А.Стоянова1, Н.К.Токаревич1, Н.Е.Любимова1, О.А.Петрова1, Ю.В.Ананьина2, Е.М.Петров2
ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ LEPTOSPIRA SPP. НА ОСНОВЕ 16S рРНК
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; 2 Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Сравнительное типирование коллекции штаммов Leptospira spр. на основе анализа 16S фрагмента РНК. Материалы и методы. Для ПЦР использовали две пары прай-меров, совместно фланкирующих фрагмент размером 1423 п.о. Для филогенетического анализа были использованы последовательности штаммов 16S рРНК Leptospira sрp., представленные в международной базе данных. Результаты. Показано высокое сходство, в том числе межвидовое, 16S фрагмента у штаммов Leptospira spp., независимо от источника получения, серовара и серогруппы. Обсуждаются гетерогенность первичной матрицы, спонтанные мутации горячих точек и ошибочные спаривания нуклеотидов, характерные для 16S последовательности патогенных штаммов Leptospira spp. Получена молекулярно-генетическая характеристика некоторых референсных штаммов Leptospira sрp. по 16S последовательности. Заключение. Результаты исследований свидетельствуют о целесообразности введения в клиническую практику идентификацию штаммов Leptospira sрp. по 16S последовательности непосредственно из клинического материала, что позволит значительно сократить время идентификации, отказаться от сложных типоспецифических сывороток и иных трудоемких методов.
Журн. микробиол., 2016, № 1, С. 35—39
Ключевые слова: лептоспироз, зооантропонозы, 16S РНК секвенирование
Yu.V.Ostankova1, A.V.Semenov1, N.A.Stoyanova1, N.K.Tokarevich1, N.E.Lyubimova1, O.A.Petrova1, Yu.V.Ananina2, E.M.Petrov2
TYPING OF LEPTOSPIRA SPP. STRAINS BASED ON 16S rRNA
1Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg; 2Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
Aim. Comparative typing of Leptospira spp. strain collection based on analysis of 16S RNA fragment. Materials and methods. 2 pairs of primers were used for PCR, that jointly flank 1423 b.p. sized fragment. Sequences of Leptospira spp. strain 16S rRNA, presented in the international database, were used for phylogenetic analysis. Results. A high similarity, including interspecies, of the 16S fragment in Leptospira spp. strains was shown independently of the source, serovar and serogroup. Heterogeneity ofthe primary matrix, spontaneous mutations of hotspots and erroneous nucleotide couplings, characteristic for 16S sequence of pathogenic Leptospira spp. strains, are discussed. Molecular-genetic characteristic of certain reference Leptospira spp. strains by 16S sequence is obtained. Conclusion. Results of the studies give evidence on expedience of introduction into clinical practice of identification of Leptospira spp. by 16S sequence directly from the clinical material, that would allow to significantly reduce identification time, dismiss complex type-specific sera and other labor-intensive methods.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 1, P. 35—39
Key words: leptospirosis, zoo anthroponoses, 16S RNA sequencing
ВВЕДЕНИЕ
Лептоспироз — широко распространенная в мире зооантропонозная инфекция. Наиболее высокий уровень заболеваемости людей отмечается в странах с влажным субтропическим и тропическим климатом, где регистрируется вспышки, возникающие в сезон дождей и охватывающие сотни человек [2, 8]. В России более чем в 50 субъектах федерации ежегодно выявляются заболевания лептоспи-розом, и летальность при этой инфекции на некоторых территориях превышает 20%, что позволяет рассматривать лептоспироз в одном ряду с особо опасными инфекциями [1].
Возбудителями лептоспироза являются микроорганизмы Leptospira interrogans sensu lato, принадлежащие к порядку Spirochaetales, самостоятельного семейства Leptospiracea, рода Leptospira. Один и тот же серовар лептоспир у разных людей может вызывать разное по течению и симптоматике заболевание. Однако L. icterohaemorrhagiae в большинстве случаев протекает более тяжело с высоким процентом летальности. В настоящее время систематика и номенклатура лепто-спир включает две различные классификационные системы: серологическую и генотипическую. Таксономическим критерием для серологической системы служит антигенный состав, и основным таксоном является серовар. В настоящее время насчитывается более 268 серологических вариантов патогенных лептоспир. В основе генотипической классификации лептоспир лежит различие в размере и структуре генома. В ряде случаев генотипическая классификация не всегда корреспондирует с серологической — лептоспиры одной серогруппы могут принадлежать к разным геномовидам [Paul N., Levett P., 2001]. В настоящее время как за рубежом, так и в России проводятся активные исследования по изучению генома и генетического разнообразия лептоспир, а также по определению возможности использования молекулярно-генетических методов для решения диагностических и эпидемиологических задач.
В связи с этим, целью данной работы являлось сравнительное типирование коллекции штаммов Leptospira sрp. на основе анализа 16S фрагмента РНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для работы стали международные референс-штаммы, используемые в лаборатории зооантропонозных инфекций Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера для диагностики лептоспироза в реакции микроагглютинации, а также новый штамм № 350 «А», выделенный в 2013 году из крови человека (табл.). Штамм «А» депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ — Оболенск» для целей национальной патентной процедуры (№ В-7745 от 05.11.2014).
Для исключения контаминаций и иных ошибок человеческого фактора в качестве контроля из музея лептоспир Центра Минздрава России по лептоспирозам при ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи методом случайной выборки были взяты четыре референсных штамма, аналогичных исследованным в работе. Контейнеры с полученными штаммами были открыты единственный раз непосредственно перед выделением нуклеиновых кислот (НК). Таким образом, исключали возможные заносы в процессе пересевания и роста культур. Полученные последовательности 16S полностью совпадали с соответствующими последовательностями аналогичных штаммов, культивированных в нашей лаборатории.
Серологическое типирование штаммов проведено с помощью перекрестной реакции микроагглютинации (РМА) по методике, предложенной в [5].
Выделение НК проводили двумя методами, принцип действия которых основан на лизисе клеток и денатурации клеточных белков с помощью раствора, содержащего гуанидин тиоцианат, и последующим осаждением нуклеиновых кислот
Штаммы Leptospira spp., ипользованные в работе
Штамм Серогруппа Серовар ГДе, когда, кем выделен
Akiyami A Autumnalis Autumnalis Япония, 1925, Koshina et al.
Castellon-3 Ballum Castellonis Испания, 1955, Babudieri
Veldrat Bataviae 461 Javanica Javanica Индонезия, 1938, Esseveld, Mochtar
Mus-242 Sejroe Saxkoebing Дания, 1942, Borg-Petersen
M-84 Sejroe Sejroe Дания, 1937, Borg-Petersen, Christensen
3705 Wolffi Sejroe Индонезия, 1937, Wolff
М-20 Icterohaemorrhagiae Copenhageni Дания, 1935, Borg-Petersen
Hond Utrecht 1V3 Canicola Canicola Голландия, 1931, Klarenbeck, Schuffner
Pomona Pomona Pomona Австралия, 1936, Clayton et al.
56214 Pomona Mozdok СССР, 1961, Семенова
Salinem Pyrogenes Pyrogenes Индонезия, 1922, Vervoort
Ballico Australis Australis Австралия, 1937, Lumley
Van Tienen Bataviae Bataviae Индонезия, 1925, Walch
Moskva-V Grippotyphosa Grippotyphosa СССР, 1928, Тарасов
Perepelicin Tarassovi Tarassovi СССР, 1938, Киктенко, Ананьин
Абайдуллаев № 350 Icterohaemorrhagiae Copenhageni Россия, 2013, Стоянова
Примечание. Источник выделения: 1 черная крыса, 2 желтогорлая мышь, 3 собака, 4 полевка обыкновенная, в остальных случаях — человек.
изопропанолом и/или этанолом: хлороформ-солевая экстракция и с помощью тест-системы «АмплиПрайм Рибо-преп» (ЦНИИЭ). Выход рРНК при использовании тест-системы был меньше, однако достаточный для дальнейшей работы с полученной НК. Обратная транскрипция проводилась на неспецифичных прай-мерах. Для ПЦР использовали две пары праймеров, совместно фланкирующих фрагмент размером 1423 пар оснований (п.о.), сконструированных на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК. При этом одна из пар специфична для лептоспир.
Постановку ПЦР для каждой пары праймеров осуществляли по следующей схеме: в пробирке объемом 1,5 мл смешивали 16,6 мМ сульфата аммония; 67 мМ трис HCl, рН 8,8; 6,7 мМ MgCl2; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 6,7 мкМ ЭДТА; 0,17 мг/мл бычьего сывороточного альбумина; 1 мМ смеси четырех дезоксинуклео-тидтрифосфатов; 1 ед. активности Taq ДНК-полимеразы и по 30 пМ каждого олигопраймера. В полученную смесь для ПЦР добавляли 1 мкг исследуемого образца. Амплификацию проводили при условиях: после денатурации (94°C, 5 мин) устанавливали 40 циклов амплификации в режиме 94°C — 30 сек. (денатурация); 55°C — 30 сек (отжиг праймеров); 72°C — 1 мин 30 сек (синтез). Финальный синтез при 72°C длился 7 мин.
Качество ПЦР определяли визуально в 2% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием.
Продукты первичной амплификации и секвенирующей реакции очищали по следующей методике: смесь из 2 мкл 3М ацетата натрия, 2 мкл 0,125М EDTA и 1 мкл гликогена вносили в 20 мкл продукта амплификации и инкубировали при комнатной температуре в присутствии охлажденного 96% этилового спирта 15 минут. Центрифугировали при 14 000 об/мин, 4°C 15 мин супернатан удаляли и дважды промывали осадок охлажденным 70% этиловым спиртом, повторяя процедуру центрифугирования на холоде. Промытый осадок сушили.
Для анализа качества очищения осадок растворяли в 30 мкл ТЕ-буфера и визуализировали в агарозном геле. Очищенный фрагмент достаточной концентрации использовали для постановки секвенирующих реакций с прямого и обратного праймеров. Для анализа продукта секвенирующей реакции очищенный осадок растворяли в SLS-буфере, содержащем формамид, и помещали в генетический анализатор.
Анализ фрагментов проводили на генетическом анализаторе GenomeLab GeXP.
Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей проводили с помощью программы NCBI Blast. Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы MEGA5, используя алгоритм ClustalW Поскольку для фрагмента 16S показана высокая консервативность, для филогенетического анализа рассматривали расстояния между последовательностями методом невзвешенной попарной группировки с усреднением (UPGMA). Для оценки достоверности построенных деревьев проведен бутстреп (bootstrap) анализ для 500 повторностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получены фрагменты размером 1423 п.о., для которых определены последовательности НК. Данные последовательности приняты к депонированию в международную базу данных.
Согласно международной базе данных, для большинства исследуемых в нашей работе штаммов (14 образцов) была показана наибольшая идентичность со штаммами L. interrogans, независимо от источника получения, серогруппы и серовара. При этом группа разделялась на две подгруппы, одна из которых включала как некоторые штаммы, полученные от человека, так и все штаммы, полученные от животных (рис.). Филогенетическое древо построено по результатам сравнительного анализа последовательности 16S гена рРНК фрагментов Leptospira spp. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью bootstrap анализа 500 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%). Интересно отметить, что два штамма, относящиеся к серогруп-пе Sejroe (штамм Mus-24 серовар Saxkoebing и штамм M-84 серовар Sejroe) относились к одной подгруппе, а штамм 3705 серовар Sejroe серогруппы Sejroe к другой. Штаммы, относящиеся к серогруппе Pomona (штамм Pomona серовар Pomona и штамм 5621 серовар Mozdok), также оказались в разных подгруппах.
Обращает на себя внимание, что столь высокое сходство с L. interrogans проявили также некоторые из штаммов, предположительно относящихся к иным видам — L. borgpetersenii и L. kirschneri.
Филогенетическое древо, построенное по результатам сравнительного анализа последовательности 16S гена рРНК фрагментов Leptospira spp. (UPGMA, bootstrap=500).
В связи с обнаруженной высокой схожестью 16S последовательностей штаммов разных видов, было высказано предположение о контаминации, так как известно, что содержание коллекций референсных штаммов нередко осложняется проблемой перекрестных заносов [3]. Однако использование в работе контрольных штаммов исключило эту вероятность. Проанализировав фрагменты НК штаммов, представленных в нашей работе и в международной базе данных, мы пришли к выводу, что их последовательности 16S имеют крайне незначительные межвидовые отличия на данных участках, которые легко могут быть отнесены к гетерогенности первичной матрицы или спонтанным мутациям горячих точек. То есть оценка только по 16S фрагменту не позволяет достаточно точно типировать Leptospira spp., что противоречит некоторым данным о высокой специфичности типирования Leptospira spp. по 16S [7], но совпадает с результатами, демонстрирующими необходимость дополнительного типирования штаммов по специфичным генам в связи с вероятной идентичностью результатов 16S типирования и метода серологического типирования [4].
Кроме того, возможной причиной сходства последовательностей могут являться ошибочные спаривания нуклеотидов, характерные для 16S последовательности патогенных штаммов Leptospira spp. [6].
Таким образом, очевидна необходимость идентификации Leptospira spp. по специфическим генам, что позволит контролировать качество работы лаборатории, а также будет способствовать сохранению коллекционных штаммов.
Результаты наших исследований свидетельствуют о целесообразности введения в клиническую практику идентификацию штаммов Leptospira sрp. по 16S последовательности непосредственно из клинического материала, что значительно сократит время идентификации и исключит необходимость использования типоспецифических сывороток и иных трудоемких методов. Использование для характеристики штаммов Leptospira sрp. метода секвенирования 16S рРНК с последующим филогенетическим анализом позволит выявить молекулярно-генетическую основу внутривидовой гетерогенности штаммов, а также с большим успехом решать такие эпидемиологические задачи, как поиск источника заражения, закономерности распространения инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы в Российской Федерации: современные особенности эпидемического проявления природных и техногенных очагов. Ветеринарная патология. 2004, 4: 54-57.
2. Стоянова Н.А., Токаревич Н.К., Ваганова А.Н. Лептоспирозы: пособие для врачей. Санкт-Петербург, 2010.
3. Chappel R.J., Goris M., Palmer M.F. Impact of proficiency testing on results of the microscopic agglutination test for diagnosis of leptospirosis. J. Clin. Microbiol. 2004, 42: 54845488.
4. Cerqueira G.M., McBride A.J.A., Queiroz A. et al. Monitoring leptospira strain collections: The need for quality control. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010, 82 (1): 83-87.
5. Faine S., Adler B., Bolin C. Leptospira and Leptospirosis. Melbourn, Australia, 1999.
6. Morey R.E., Galloway R.L., Bragg S.L. Species-specific identification of Leptospiraceae by 16S rRNA gene sequencing. J. Clin. Microbiol. 2006, 44: 3510-3516.
7. Postic D., Riquelme-Sertour N., Merien F. Interest of partial 16S rDNA gene sequences to resolve heterogeneities between Leptospira collections: application to L. meyeri. Res. Microbiol. 2000, 151 (5): 333-341.
8. Sagunan A. Risk factor associated with leptospirosis during an outbreak in Middle Andaman, India. Indian J. Med. Res. 2009, 130 (1): 114-116.
Поступила 10.04.15
Контактная информация: Останкова Юлия Владимировна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)232-81-22
