CC BY
253. Ge D., Fellay J., Thompson A.J. et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance. Nature. 2009, 461: 399-401.
4. Ghany M.G., Nelson D.R., Strader D.B. et al. An Update on Treatment of Genotype 1 Chronic Hepatitis C Virus Infection: 2011 Practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 2011, 54 (4): 1433-1444.
5. Grebely J., Petoumenos K., Hellard M. et al. Potential role for Interleukin-28B genotype in treatment decision-making in recent hepatitis C virus infection. Hepatology. 2010, 52: 1216-1224.
6. Lee M.H., Yang H.I., Lu S.N. et al. Chronic hepatitis C virus infection increases mortality from hepatic and extrahepatic diseases: a community-based long-term prospective study. J. Infect. Dis. 2012, 206 (4): 469-477.
7. Lin C.Y., Chen J.Y., Lin T.N. et al. IL28B SNP rs12979860 Is a critical predictor for on-treatment and sustained virologic response in patients with hepatitis c virus genotype-1 infection. PLoS ONE. 2011, 6 (3): e18322.
8. Marabita F., Aghemo A., De Nicola S. et al. Genetic variation in the interleukin-28B gene is not associated with fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C and known date of infection. Hepatology. 2011, 54: 1127-1134.
9. Mihm U., Ackermann O., Welsch C. et al. Clinical relevance of the 2'-5'-oligoadenylate synthetase/RNase L system for treatment response in chronic hepatitis. J. Hepatol. 2009, 50 (1): 49-58.
10. Neukam K., Nattermann J., Rallon N. et al. Different distributions of hepatitis C virus genotypes among HIV-infected patients with acute and chronic hepatitis C according to interleukin-28B genotype. HIV Medicine. 2011, 12: 487-493.
11. Rau M., Baur K., Geier A. Host genetic variants in the pathogenesis of hepatitis C. Viruses. 2012, 4: 3281-3302.
12. Rauch A., Kutalik Z., Descombes P. et al. Genetic variation in IL28B is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: a genome-wide association study. Gastroenterology. 2010, 138: 1338-1345.
13. Silverman R.H. Viral encounters with 2',5'-oligoadenylate synthetase and RNase L during the interferon antiviral response. J. Virol. 2007, 81 (23): 12720-12729.
14. Thomas D.L., Thio C.L., Martin M.P. et al. Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus. Nature. 2009, 461: 798-801.
15. Washenberger C.L., Han J.Q., Kechris K.J. et al. Hepatitis C virus RNA: dinucleotide frequencies and cleavage by RNase L. Virus Res. 2007, 130 (1-2): 85-95.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Мицура Виктор Михайлович, к.м.н.,
246000, Беларусь, Гомель, ул. Ланге, 5, р.т. (+375-232)51-67-28
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.В.Бренева1, М.В.Афанасьев1, М.Б.Шаракшанов1, А.С.Остяк1, Е.Ю.Киселева1, А.П.Самсонова2, Е.М.Петров2, Е.В.Викторова3, С.В.Балахонов1
MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ В ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LEPTOSPIRA
1Иркутский научно-исследовательский противочумный институт; 2НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи; 3Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, Москва
Цель. Разработка методологических подходов идентификации лептоспир с использованием технологии прямого белкового профилирования MALDI-TOF. Материалы и методы. Проведен анализ клеточных белков 34 штаммов лептоспир на приборе Microflex LT с использованием программного обеспечения «MALDI Biotyper 3.0 для идентификации и классификации микроорганизмов». Результаты. Сгенерированы и импортированы в базу данных MALDI Biotyper 3.0 19 референсных спектров эталонных штаммов лептоспир 7 видов. Проведена идентификация 6 штаммов с неопределенным таксономическим положением. Заключение. Апробированная методика позволяет определять вид лептоспир с достоверностью, зависящей от адаптации их к питательным средам, способа подготовки и условий хранения образцов для масс-спектро-метрии.
Журн.микробиол., 2014, № 4, С. 36—43
Ключевые слова: лептоспиры, идентификация, масс-спектрометрия
N.V.Breneva1, M.V.Afanasiev1, M.B.Sharakshanov1, A.S.Ostyak1, E.Yu.Kiseleva1, A.P.Samsonova2, E.M.Petrov2, E.V.Viktorova3, S.V.Balakhonov1
MALDI-TOF MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF CELL PROTEINS DURING IDENTIFICATION OF LEPTOSPIRA GENUS MEMBERS
Irkutsk Research Institute of Plague Control; 2Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology; 3Russian State Centre of Quality and Standardization of Medicinal Agents for Animals and Forage, Moscow, Russia
Aim. Development of methodological approaches for identification of leptospira by using MALDI-TOF direct protein profiling technology. Materials and methods. Analysis of cell proteins of 34 leptospira strains was carried out in Microflex LT by using «MALDI Biotyper 3.0 for identification and classification of microorganisms» program. Results. 19 reference spectra of reference leptospira strains from 7 species were generated and imported into MALDI Biotyper 3.0 database. Identification of 6 strains with undetermined taxonomic position was carried out. Conclusion. The approved method allows determination of leptospira species with accuracy that depends on their adaptation to nutrient media, preparation approach and sample storage conditions for mass-spectrometry.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 4, P. 36—43
Key words: leptospira, identification, mass-spectrometry
ВВЕДЕНИЕ
Лептоспирозы остаются актуальной патологией в мире и в России [1], ежегодно выделяются уникальные культуры, идентификация которых затруднена в связи с усложненной систематикой лептоспир, их удивительной гетерогенностью, а также постоянным появлением новых сероваров. В последнем издании определителя Берджи 2010 г. на основании анализа ДНК и 16S рРНК род Leptospira подразделяется на 19 видов [10], из них 8 патогенных, 6 промежуточных и 5 сапрофитических. Недавно классифицирован еще один патогенный вид L. kmetyi [12]. Основной таксономической единицей по-прежнему остается серовар, среди патогенных лептоспир насчитывается более 250 сероваров, сапрофитических — 65. По гомологии поверхностного О-антигена серовары объединены в 25 и 38 серогрупп соответственно. Причем штаммы одной серогруппы и даже одного серовара могут относиться к разным видам лептоспир.
Времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ ионизацией (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight, MALDI-TOF) — новый метод в диагностике инфекционных заболеваний и изучения их возбудителей, отличающийся высокой чувствительностью, скоростью, низкой стоимостью расходных материалов, а также широкими возможностями анализа белков, липидов, нуклеиновых кислот и других соединений. Наибольшее применение получил анализ клеточных белков (прямое белковое профилирование) как в идентификации микроорганизмов [4], так и в протеомном анализе [8, 13]. За рубежом появились первые публикации по MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации представителей рода Leptospira [7, 11], однако метод окончательно не разработан. Классическая идентификация включает дифференциацию патогенных и непатогенных лептоспир с помощью длительных по времени бактериологических тестов, определение серогруппы в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми сыворотками, определение серовара в РМА с панелью моноклональных антител или в перекрестной РМА с гипериммунными сыворотками. Коммерческие групповые сыворотки для ветеринарного применения выпускает единственное предприятие в России, а моноклональные антитела — единственное учреждение в мире [14]. Определение вида лептоспир требует наличия высокотехнологичного оборудования и специальных дорогостоящих реактивов для мультило-кусного секвенирования (MLST) или мультиплексной лигазной реакции с гибридизацией
Таблица 1. Штаммы лептоспир, использованные в работе
Название штамма Bun Серовар Серогруппа Место и год выделения
Референтные штаммы
М20 1 L. interrogans copenliageni Icterohaemorrhagiae Дания, 1938
Moskva V1 L. kirschneri grippotyphosa Grippotyphosa Россия, 1928
Каширский 1 L. interrogans canicola Canicola Россия, 1939
Pomona 1 L. interrogans pomona Pomona Австралия, 1937
Перепелицин1 L. borgpetersenii tarassovi Tarassovi Россия, 1938
Ballico 2 L. interrogans australis Australis Австралия, 1934
Patoc 11 L. biflexa patoc Semaranga Италия, 1961
Ёж-12 L. interrogans bratislava Australis Россия, 1954
3705 - L. interrogans woffii Sejroe Индонезия, 1924
М84 L. borgpetersenii sejroe Sejroe Дания, 1937
Akiyami А2 L. interrogans autumnalis Autumnalis Япония, 1922
HS 262 L. kirschneri djatzi Bataviae Пуэрто-Рико, 1950
Castellón 3 1 L. borgpetersenii castellonis Ballum Испания, 1955
Vleermuis 3868 L. kirschneri cynopteri Cynopteri Индонезия, 1938
Salinem2 L. interrogans pyrogenes Pyrogenes Индонезия, 1923
Veldrat L. borgpetersenii ¡avanica Javanica Индонезия, 1938
Batavia 46 2
Kabura L. kirschneri kabura Hebdomadis Конго, 1958
Hebdomadis L. interrogans liebdomadis Hebdomadis Япония, 1916
Djasiman L. interrogans djasiman Djasiman
RGA2 L. interrogans icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae
LSU1945 L. noguchii louisiana Louisiana
102 L. inadai lyme Lyme
Sari L. borgpetersenii mini Mini
CZ 2142 L. noguchii panama Panama
5621 L. interrogans mozdok Pomona
Sarmin2 L. weilii sarmin Sarmin
Индонезия, 1938 Бельгия, 1915 США, 1945 Великобритания, 1986 Италия, 1940 Панама, 1962 Россия, 1965 Индонезия, 1939
Автор
Откуда получен, год
Borg-Petersen Тарасов
Терских
Clayton
Тарасов
Cotter, Sawers
Babudieri
Ананьин
Wolff
Borg-Petersen
Koshima
Alexander
Babudieri
Collier, Machtar
Baerman
Esseveld-Mochtar
Человек Человек
Человек Человек Человек Человек Вода
Ёж европейский
Человек Человек Человек
Apodenшs Бу^айсш Apodenшs Бу^айсш Летучая мышь Человек Черная крыса
НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2010
НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 1983
ВГНКИ, 2013
Van Riel Ido, Ito, Wani
Kotter
Uhlenhuth, Fromme Roth et al. Schmid et al. Mino Gale et al. Семенова Wolff, Broom
Человек Человек
Человек
Человек
Броненосец
Человек
Человек
Опоссум
Microtus arvalis
Человек
НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2013 («удаленный» анализ)
& H
С
S Er E S
S £
S X
s ® К ¡x
с
s?
с
I
«
с 3
с 3
te g
ce
и S
о с Ц о
S ¡s a
g p
о с Ц о S s a
О CN CN
о о о
CN CN CN
g g g
о о о
о о о
о 0- о 0- о 0-
& £
J3
ê с a a x
с
с
J
с a a
•b
ce
.c
•1 ce
S s
as ai t
ю ю à ч
и U U ff
а M
И (С
о с
& &
н н
ооо os
оооо оооо ооос
СмРнРнР-
cöcört '«à
J3J3J3
с
о с В Е
s s s «
•¡3 'iE
ад зд
I I
а
о
о о.
о Q
Л с
о &
•й
-а g
К t
о с
с
Е-
1 1С
с &
g g
, t
и S О £
fc
с &
У
s É о t
OJ
а
о
•e
OJ
а к
g £
О cc
n S
ta 8.
s u
к S
rt Ë
№ Ö
Ü i1
S а
s Й
л ^
с ?
SS^Ê
(MLPA) [5, 6]. Имеющиеся трудности в диагностике лептоспирозов диктуют необходимость разработки и внедрения современных лабораторных методов, в том числе для идентификации патогенных лептоспир.
Цель исследования — разработка методологических подходов идентификации лептоспир с использованием технологии прямого белкового профилирования MALDI-TOF.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали 34 штамма лептоспир (табл. 1): 25 референтных патогенных, 1 референтный непатогенный (Patoc-I), выделенные в России из различных объектов, 6 патогенных и 1 промежуточный, а также 1 непатогенный, выделенный из воды в Туркмении (Байрам Али). Все культуры инкубировали в течение семи—девяти дней при 28°С на среде EMJH (Ellinghausen-McCullough-John-son-Harris, Becton Dickinson, USA), после чего проверяли рост микроско-пированием в темном поле. Культуры концентрировали в микропробирках Eppendorf 1,5 мл центрифугированием при 12 — 17 000 g в течение 5 — 15 минут до получения видимого осадка диаметром 2 — 5 мм.
Концентраты культур (осадки) отмывали два—три раза стерильным фос-фатно-солевым буфером (PBS) или забуференным физиологическим раствором (ЗФР), для этого к осадку добавляли 1,5 мл буфера, встряхивали на вортексе и центрифугировали при 12 — 17 000 g в течение 5 — 15 минут. Экстракция белка из отмытых концентратов и нанесение образцов на MSP-чип осуществлялись по протоколу для изолированных колоний бактерий [9]. Метод «прямого нанесения» заключался в суспендировании осадка культуры в зависимости от его величины в 20 — 60 мкл бидистиллированной воды и нанесении на MSP-чип 1 мкл суспензии с последующим наслаиванием 1 мкл матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). При экстракции муравьиной кислотой (formic acid — FA) и ацетонитрилом количество добавляемых реактивов рассчитывалось также исходя из величины осадка культуры.
На базе НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи подготовку образцов к исследованию осуществляли двумя способами: нанесение на MSP-чип под матрицу и приготовление спиртовых препаратов. MSP-чипы с нанесенными белками хранили и транспортировали при комнатной температуре в течение четырех дней. Спиртовые препараты получали добавлением к концентратам культур 300 мкл стерильной бидистиллированной воды и после перемешивания — 900 мкл перегнанного спирта, хранили при температуре не выше минус 20°C и транспортировали по «холодовой цепи», непосредственно перед исследованием завершали экстракцию белка по стандартному протоколу [9].
Для получения библиотек спектров образцы исследовались в 10 — 12 повторах на масс-спектрометре Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) с использованием программы Flex Control 3.3. Параметры работы прибора были оптимизированы для диапазона отношения массы иона к его заряду (m/z) от 2000 до 20 000. Спектры снимали при напряжении Ion Source 1 (IS1) 20,0 кВ, Ion Source 2 (IS2) 18,05 кВ, напряжении на фокусирующей линзе
— 6,00 кВ, частоте азотного лазера — 60 Гц. Каждый спектр получался путем суммирования 6 одиночных спектров (240 импульсов лазера). В качестве калибровочного стандарта и положительного контроля анализа использовался белковый экстракт штамма Escherichia coli DH5a (ref. № 255343; Bruker Daltonics, Германия).
Анализ спектров, построение дендрограмм, генерацию референсных библиотек и идентификацию выполняли с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0. Для получения референсных спектров семидневные культуры концентрировали при 17 000 g и экстрагировали белки муравьиной кислотой [11]. При идентификации заключение о таксономической принадлежности осуществлялось на основании значения индекса совпадения (score value — SV): SV >2,3 — достоверная идентификация до вида; SV менее 2,299, но более 2,000 — достоверная идентификация до рода, вероятная идентификация до вида; SV в диапазоне 1,7 — 1,999 — вероятная идентификация до рода и менее 1,7 — недостоверный результат [9]. Для оценки достоверности различий значений SV применялся U-критерий Уилкоксона для независимых выборок (ранговый критерий Манна и Уитни) [2]. РЕЗУЛЬТАТЫ
Для первичной апробации метода идентификации представителей рода Leptospira в базу данных MALDI Biotyper 3.0 были импортированы 7 референсных спектров, сгенерированных при анализе белковых экстрактов референтных штаммов лептоспир разных видов (табл. 1). Полученные белковые спектры лептоспир обладали абсолютной специфичностью по сравнению со спектрами 4127 микроорганизмов из базы данных. Результаты идентификации референтных штаммов соответствовали виду, значения SV приведены в табл. 2. Штамм Vleermuis 3668 некорректно идентифицировался как L. interrogans с SV до 2,6. Возможно, при длительном хранении и частых пересевах на жидких питательных средах произошли значительные изменения свойств штамма, кроме того, на дендрограм-ме L. interrogans и L. kirschneri не обнаруживают больших отличий.
Апробированы различные варианты и выбраны оптимальные методы подготовки культур лептоспир для масс-спектрометрического анализа. Идентификация прошла до вида как при «прямом нанесении» культур лептоспир на MSP-чип, так и после экстракции белка муравьиной кислотой, в то же время SV в большинстве случаев был достоверно выше при методе белковой экстракции (табл. 2). После сравнения методов пробоподготов-ки в базу данных были добавлены еще 12 референсных спектров, в том числе L. inadai и L. weilii (табл. 1).
Идентификация свежевыделенной в 2012 г. от бурозубки в г. Иркутск культуры 5-И серогруппы Javanica была успешной только после второго пассажа на EMJH (табл. 2), при этом вероятная идентификация до вида прошла в одном из 12 повторов, в десяти повторах
— вероятная идентификация до рода и в одном случае SV составил менее 1,7. Рост штаммов 4-И и 5-И при первичных пассажах был скудным, но при удлинении сроков инкубации для накопления биомассы был получен недостоверный результат. В дальнейшем при пассировании на EMJH в течение нескольких месяцев удалось достичь как массивного роста, так и достоверной идентификации штаммов 4-И и 5-И до вида L. borgpetersenii. Подобную картину наблюдали при исследовании двух поступивших в 2012 г. референтных штаммов, хранившихся на среде ВГНКИ без доступа воздуха. SV был достоверно выше
Таблица 2. Результаты идентификации штаммов лептоспир в зависимости от хранения образцов для «удаленного» анализа, методов пробоподготовки и нанесения на MSP-чип
Название штамма Диапазон SV SV ср. Диапазон SV SV ср.
Хранение на MSP-чипе (4 дня) Хранение спиртовых препаратов (до двух недель) Р
Djasiman 1.729 - 1.928 1.821 2.040 - 2.401 2.265 <0,001
Hebdomadis 1.884 - 2.162 1.995 2.011 - 2.492 2.276 <0,001
M20-11 1.768 - 1.786 1.777 2.011 - 2.328 2.180 <0,001
Sari 1.5 - 1.898 1.671 1.687 - 2.112 1.945 <0,001
М20-17 Не идентиф. 1.694 - 2.151 1.819
493 Не идентиф. 1.862 - 2.097 1.942
«Прямое нанесение» FA
HS-26 1.199 - 2.404 2.128 1.812 - 2.310 2.153 >0,1
Salinem 2.086 - 2.414 2.312 2.320 - 2.483 2.419 <0,01
3705 2.301 - 2.566 2.427 2.485 - 2.669 2.545 <0,001
Akiyami A 2.325 - 2.490 2.398 2.555 - 2.685 2.597 <0,001
Ёж-1 2.154 - 2.436 2.324 2.409 - 2.605 2.528 <0,001
Ballico 2.177 - 2.45 2.336 2.283 - 2.585 2.483 <0,001
Цф 12 100 g 5 мин, FA Цф 17 000 g 10 мин, FA
M 84 1.704 - 2.264 2.074 1.998 - 2.328 2.129 >0,1
Ballico 2.041 - 2.295 2.211 2.177 - 2.45 2.336 <0,01
Первый пассаж на EMJH Второй пассаж на EMJH
5-И Не идентиф. 1.756 - 2.159 2.026
Kabura 1.348 - 2.069 1.769 1.819 - 2.214 2.138 < 0,001
VB 46 1.662 - 2.420 1.994 2.050 - 2.430 2.284 < 0,001
Инкубация 8 суток, ЗФР, Цф 12 100 g 15 мин Инкубация 2—3 недели, Цф 17 000 g 10 мин
4-И 2.328 - 2.536 2.446 Не идентиф.
5-И 2.112 - 2.466 2.297 Не идентиф.
Примечание. FA — экстракция муравьиной кислотой; Цф — центрифугирование, ЗФР — отмывка за-буференным физиологическим раствором.
при втором пассаже на EMJH, чем при первом, однако в обоих случаях прошла вероятная идентификация штамма Kabura до вида L. kirschneri и достоверная идентификация штамма Veldrat Batavia 46 до вида L. borgpetersenii. Следовательно, при масс-спектрометрическом анализе клеточных белков лептоспир необходимо обязательно учитывать адаптацию к питательным средам. Выделенный в 2010 г. от рыжей полевки в Пермской области штамм 1322 П идентифицирован как L. kirschneri с диапазоном SV от 1,877 до 2,195. Выделенный из воды штамм Байрам Али идентифицирован с недостоверным результатом, на дендро-грамме он находится на одной ветке с непатогенным штаммом вида L. biflexa. Субкультура М20-17 и штамм 493 определены до вида L. interrogans ориентировочно, а субкультура М20-11 — достоверно с индексом соответствия более 2,3 в трех из двенадцати повторов.
При сопоставлении результатов исследования образцов с использованием разных методов пробоподготовки в большинстве случаев выявлена значимая зависимость SV от метода (табл. 2). При хранении образцов в течение нескольких дней на MSP-чипе идентификация прошла только до уровня рода. Концентрирование культур при 12 100 g в течение 5 минут дало сопоставимые результаты с предложенным ранее методом [7, 11], удлинение времени центрифугирования до 15 минут позволило улучшить качество анализа. Более эффективно концентрирование культур при 17000 g в комплексе с экстракцией белка муравьиной кислотой и хранение образцов в виде спиртовых препаратов при
минус 20°C в случае «удаленного» анализа. В то же время, необходимо отметить, что выполнить идентификацию удалось при широком варьировании метода пробоподготовки: возраст культуры 7 — 9 дней соответствует стационарной фазе роста лептоспир на альбуминовых средах, после 10 дня начинается отмирание бактериальной популяции [3]; для отмывки подходит любой буфер с оптимальным рН 7,0 — 7,4; центрифугирование при 12 100 — 17 000 g в течение 5 — 15 минут способствует удалению примесей питательных сред.
На построенной нами дендрограмме строго дифференцировались непатогенные, промежуточные и патогенные лептоспиры, а также другие представители порядка Spiro-chaetales семейств Spirochaetaceae (рода Borrelia) и Brachyspiraceae (рода Brachyspira). Отдельный кластер формировал патогенный вид лептоспир L. borgpetersenii, к которому были отнесены свежевыделенные культуры 4-И и 5-И. В серогруппе Javanica известно 17 сероваров, из которых восемь принадлежат к виду L. borgpetersenii, что сужает поиск при дальнейшем определении серовара изучаемой культуры. ОБСУЖДЕНИ Е
Предлагаемая методика идентификации представителей рода Leptospira с использованием технологии MALDI-TOF масс-спектрометрического белкового профилирования дает возможность: 1. Дифференцировать патогенные, промежуточные и сапрофитические виды лептоспир. 2. Определять вид лептоспир. 3. Достоверность определения таксономической принадлежности представителей рода Leptospira зависит от условий культивирования, методики пробоподготовки и видовых отличий клеточных белков лептоспир. Минимальные видовые отличия наблюдаются у L. interrorgans и L. kirschneri. 4. Идентифицировать свежевыделенные культуры лептоспир при условии приспособления их к питательным средам.
Метод «прямого нанесения» по эффективности в отдельных случаях не уступает методу экстракции муравьиной кислотой, достоверная идентификация до вида проходит в обоих случаях. Стандартный протокол экстракции белка муравьиной кислотой обязателен при получении референсных спектров, при идентификации культур можно ограничиться методом «прямого нанесения».
Для «удаленного» анализа предпочтительно транспортировать образцы не нанесенными на MSP-чип (не подлежат хранению вне вакуума), а в виде спиртовых препаратов по «холодовой цепи» (хранение при минус 200C).
Таким образом, результаты исследования позволяют рассматривать методику идентификации лептоспир с использованием технологии прямого белкового профилирования MALDI-TOF как альтернативную MLST и MLPA. Значительная стоимость оборудования компенсируется высокой производительностью, быстротой и простотой метода, а также низкой стоимостью расходных материалов. Необходима стандартизация метода, особенно в отношении свежевыделенных культур.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы людей и животных: тенденции распространения и проблемы профилактики. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010, 2:13-16.
2. Закс Л. Статистическое оценивание. Под ред. Ю.П. Адлера, В.Г. Горского. М., Статистика, 1976.
3. Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л. Лептоспироз животных. Ярославль, ДИА-пресс, 2001.
4. Маянский Н.А., Калакуцкая А.Н, Мотузова О.В. и др. MALDI-TOF масс-спектрометрия в рутинной работе микробиологической лаборатории. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011, 3 (5): 20-25.
5. Ahmed A., Anthony R.M., Hartskeerl R.A. A simple and rapid molecular method for Leptospira species identification. Inf. Gen. Evol. 2010, 10: 955-962.
6. Ahmed N., Devi S.M., Valverde M.A. et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2006, 5 (28) (doi:10.1186/1476-0711-5-28).
7. Djelouadji Z., Roux V., Raoult D. et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry identification of Leptospira organisms. Vet. Microbiol. 2012, 158: 142-146.
8. Cullen P.A. Cordwell S.J., Bulach D.M. et al. Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar lai. Infect. Immun. 2002, 70 (5): 2311-2318.
9. MALDI Biotyper 3.0 User Manual. Revision 1, January 2011. Bruker Daltonics GmbH.
10. Paster B.J. Phylum XV. Spirochaetes Garrity and Holt 2001. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Springer, 2010.
11. Rettinger A., Krupka I., Grunwald K. et al. Leptospira spp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST). BMC Microbiology. 2012, 12 (185) (doi:10.1186/1471-2180-12-185).
12. Slack A.T, Khairani-Bejo S., Symonds M.L. et al. Leptospira kmetyi sp. nov., isolated from an environmental source in Malaysia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009, 59 (4): 705-708.
13. Vieira M.L. Pimenta D.C., de Morais Z.M. et al. Proteome Analysis of Leptospira interrogans virulent strain. Open Microbiology J. 2009, 3: 69-74.
14. http://www.kit.nl/kit/Leptospirosis-Reference-Centre (дата просмотра 11.02.13).
Поступила 17.10.13
Контактная информация: Бренева Н.В.,
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78, р.т. (395-2)22-01-43
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Г.Н.Бахтояров, И.С.Киселев, В.В.Зверев, Е.Б.Файзулоев
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Оценить разрешающую способность и диагностическую ценность метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (МП ПЦР-РВ) в качестве базисной платформы для создания тест-систем G/P генотипирования штаммов ротавирусов группы А. Материалы и методы. Конструирование праймеров и ДНК зондов для экспериментальной тест-системы на основе МП ПЦР-РВ проведено с помощью специализированных компьютерных программ на основе баз данных сиквенсов GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database и др. Экспериментальная тест-система генотипирования испытана на 116 клинических образцах с подтвержденной ротаврусной инфекцией и 14 биопробах, негативных по РНК ротавирусов группы А. В качестве референс-метода для проверочного определения генотипа ротавирусов в исследуемых образцах использовано выборочное секвенирование маркерных локусов генов VP7, VP6, VP4. Результаты. Установлено специфическое взаимодействие праймеров и ДНК зондов с генотип-специфическими локусами сегментов ротави-русных геномов и отсутствие ложноположительных сигналов, полное совпадение результатов генотипирования полученных методом МП ПЦР-РВ и секвенированием. Заключение. Разрешающая способность метода МП ПЦР-РВ позволяет проектировать на его основе тест-системы, способные уверенно идентифицировать генотипы ротавирусов с эффективностью 90% и выше.
Журн. микробиол, 2014, № 4, С. 43—49
Ключевые слова: ротавирусы группы А, генотипирование, мультиплексная ПЦР-РВ
G.N.Bakhtoyarov, I.S.Kiselev, V.V.Zverev, E.B.Faizuloev
EVALUATION OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR EFFECTIVENESS FOR GROUP A ROTAVIRUS GENOTYPING
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Evaluate resolution and diagnostic significance of real-time multiplex PCR (MP RT-PCR) as a platform for group A rotavirus G/P genotyping test-systems. Materials and methods. Primer and DNA probe construction for an experimental test-system based on MP RT-PCR was carried out by using specialized PC programs and sequence databases GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database etc. The experimental genotyping test-system was tested using 116 clinical samples with confirmed rotavirus infection and 14 biosamples negative for group A rotavirus RNA. Selective sequencing of VP7, VP6, VP4 gene marker loci was carried out as a reference method for verifying determination of rotavirus genotype. Results. Specific interaction between primers and DNA probes with genotype-specific loci of retrovirus genome segments and a lack of false-negative signals, complete match of genotyping results obtained by MR RT-PCR and sequenc-
