CC BY
17
Вып. 1-2(71-72). - С. 104-112. - 38. Суров B.C., Суриков
H.H., Тараненко Т.М.// Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1978. - Вып. 3(61). - С. 9-12. - 39. Суров B.Ö., Тараненко Т.М., Суриков H.H..// Пробл: особо опасных инф. - Саратов, 1979.. - Вып. 1 (65). - С. 9-12. - 40: Тараненко Т.М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. -Саратов, 1988. - 41 с. - 41. Тараненко Т:М., Бахрах Е.Э., Гольдфарб JI.M. и др.//Пробл. особо опасных инф.- Саратов, 1977. — Вып. 6 (58). - С. 17-20. - 42. Тараненко Т.М., Вейнблат В.И. // Иммунохим: и лаб.'диагн. особо опасных инф. - Саратов, 1985. - С. 7-15. - 43. Тараненко Т.М., Гусева Н.П., Ермакова Г.В. и др. И Матер, науч.-практ. конф., поев. 100-летию образов, противочумн. службы России,- Саратов, 1997.- Т. 1. - С. 246-247. - 44. Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М., Бахрах Е.Э. и др.//Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1972. - Вып. 3 (25). - С. 93-98. -45. Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М., Боровикова Т.П. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1972. -Вып. 1 (2j). - С. 37-41. - 46. Федорова В. А., Девдариани 3.JI. // Мол. генет. - 2002. - № 4. - С. 22-27. - 47. Федорова В.А., Хомяков A.E., Девдариани 3.JI. и др.//Сб. науч. тр., поев. 50-летию Дагестанской противочумн. ст. - Махачкала, 2002. - С. 63-66. - 48. Шульгина И.В., Малюкова Т. А. // Матер, межгос. науч. конф:, поев. 100-летию открытия возбудит, чумы,- Алматы, 1994. — С. 158. - 49. Anderson G.W. , Heath D.G., Bolt-Ch.R. et al. Il Am. J. Trop. Med:. Hug. - 1998.-Vol. 58, N 6. - P. 77-83. - 50. Girard G. Il C. R. Soc. Biol. - 1941. - Vol. 135. - P. 1577-1579. - 51.Luderitz
O./l Am. Soc. Microbiol. - N.Y., 1977. - P. 239-246. -52. Mäkela P.H., Mayer H.// Bacteriol. Rev. - 1976. -Vol. 40. - P. 591-596. - 53. Perry R.D., Fetherston J.D. // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 10, N 1. - P. 35-66. -
54.Rick P.D., Mayer H., Neumeyer B.A. el al.il J. Bacteriol. - 1985. - Vol. 162, N2. -P. 494-503. - 55. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. // Mol. Microbiol. - 2000. —Vol. 37. -P. 316-330. - 56. Vinogradov E.V., Knirel Y.A., Tho-mas-Oates J.E. et al. II Carbohydr. Res. - 1994. - Vol. 258. -P. 223-232. ,
T.M.Taranenko, C.M.Dalvadyants, M.N.Kireyev, N.P.Gusseva, V.A.Feodorova, Z.L.Devdariani •
Peculiarities of Structure and Function . . of the Main Somatic Antigen of the Plague Pathogen
Russian.Anti-Plague Research Institute "Microbe”, Saratov
Presented in the paper are recent observations on the chemical nature, structural organization and immunobiologic properties of the main somatic antigen (MSA) of Yersinia pestis, derived from the cells by the extraction technique as described by. Boivin. MSA, a serologically active glycoprotein, acts as a vehicle of the specific characters common for the related plague and pseudotuberculosis yersinia in the state of R form dissociation. Involved into the initiation of the cell-type immune response, MSA is used as a component to develop a chemical anti-plague.vaccine (FlplusMSA). The authors come out with a suggestion that MSA with its unique structure of a cyclic hetero-glycane, might be a common antigen of enterobacteria that is substituted for the О specific polysaccharide, bearing no association to thé core moiety of Y. peslis lipopolysaccharide molecule. . ' ' •
' Поступила 22.04.04
ИММУНОЛОГИЯ, ПАТОГЕНЕЗ, ЛЕЧЕНИЕ
УДК 616.981.452-.636.91
А.А.Бывалов, И.В.Дармов, В.И.Евстигнеев, Е.В.Пименов
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНА, ЗАЩИЩАЮЩЕГО МОРСКИХ СВИНОК ОТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЫ
Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров .
Представлены результаты экспериментальных исследований, направленных на выявление в культурах патогенных иерсиний антигенной субстанции, способной индуцировать специфическую невосприимчивость к возбудителю чумы у морских свинок. Показано, что при «глубинном» культивировании бактерий Yersinia .pseudotuberculosis в питательную среду экскретируется высокомолекулярный антиген (Б-антиген), общий для патогенных иерсиний; его биосинтез кодируется хромосомной ДНК. Однократная подкожная иммунизация препаратом Б-антигена, выделенным из культуральной жидкости и депонированным в неполном адъюванте Фрейнда, вызывает развитие специфической резистентности морских свинок к экспериментальной чуме. !■ • •
Как известно, чумная живая вакцина способна индуцировать у экспериментальных животных и людей выраженную специфическую невосприимчивость к чумной инфекции. Защитное действие живой вакцины основано на способности микробов вакцинного штамма приживаться и распространяться в прививаемом макроорганизме' и, как следствие, на накоплении достаточных количеств протектив-ных антигенов, обеспечивающих развитие иммунных реакций. Однако тонкие механизмы формирования иммунитета к возбудителю чумы с помощью живой вакцины до настоящего времени изучены недостаточно. Конструирование новых средств специфической профилактики чумы, и тем более молекулярной (или субъединичной) вакцины, невозмож-
но без углубленного исследования антигенной структуры Yersinia pestis, роли отдельных антигенов в проявлении чумным микробом патогенных и имму-ногенных свойств. ,
Изучение протективных свойств отдельных компонентов бактерий У. pestis началось вскоре после открытия возбудителя чумы, однако начало целенаправленных усилий в этой области было положено работами H.Schutze [18], а затем, в первую очередь, K.F.Meyer с соавт. Последней группе исследователей удалось выделить в очищенном! виде и охарактеризовать физико-химические и иммунобиологические свойства фракции I (Ф1-антигена, Ф1), первого из идентифицированных «моноантигенов» чумного микроба [12, 13]. '
Иммуногенные свойства фракции I для экспериментальных животных,, зараженных культурой возбудителя чумы, исследованы во многих лабораториях. Не вызывает сомнений способность препаратов Ф1-антигена индуцировать активную защиту от чумы у белых мышей [6, 13], белых крыс [13] и, в меньшей степени, у обезьян нескольких видов [6, 15], а также эффективная пассивная иммунизация белых мышей с помощью антител к Ф1 [27].
Приведенные данные литературы позволяют рассматривать Ф1-антиген в качестве одного из основных иммуногенов чумного микроба, обязательного для включения в состав разрабатываемой молекулярной вакцины, но не единственного. Общепринятым считается, что препараты Ф1 не индуцируют выраженной невосприимчивости морских свинок к заражению ФГ- и, тем более ФГ-варианта-ми чумного микроба, а авирулентные штаммы У. pestis, вне зависимости от способности продуцировать Ф1-антиген, могут предохранять животных этого вида от заражения культурами вирулентных штаммов возбудителя чумы как синтезирующими, так и не синтезирующими фракцию I [3, 9].
В качестве второго протективного антигена в состав создаваемой молекулярной вакцины предлагались различные антигены Y. pestis: ЛПС, ОСА, Р1а и др. В этом смысле особый интерес в последние годы вызывают белковые антигены, особенно экс-кретируемые, биосинтез которых кодируется ДНК плазмиды кальцийзависимости (pCad) патогенных иерсиний, такие как V-антигён, Yops. Значимый им-мунизаторный эффект в отношении экспериментальной чумы регистрировался при иммунизации мелких лабораторных животных препаратами V-антигена, выделенными из биомассы чумного микроба или' «рекомбинантного» [10]. Показаны выраженные протективные свойства для мышей и морских свинок препарата, включающего «рекомбинантные» антигены Ф1 и V [17].
Вместе с тем очевидным, на наш взгляд, является существование другого (или других) антигена, биосинтез которого не связан с pCád, и обладающего протективной активностью для морских свинок. Поиск такого антигена и явился целью настоящих исследований. 1
Материалы и методы
В работе использованы штаммы Y. pseudotuberculosis 164/84 (pCad+) и Yersinia enterocolitica Е9 (pCad+), содержащие собственную плазмиду кальцийзависимости, а также их изогенные производные с элиминированной, плазмидой кальцийзависимости - соответственно 164/84 (pCad~) и Е9 (pCad") из коллекции музея НИИМ МО РФ. Культуры выращивали на твердой питательной среде на основе перевара Хоттингера при температуре (27±1) °С в течение 2 сут или в колбах Эрленмейера с обогащенной жидкой питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса с добавлением 20 мМ оксалата Na и 20 мМ MgCl2, при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. «Глубинное» культивирование микробов проводили также в ферментерах МД-300 («Marubishi», Япония) в жидкой питательной среде аналогичного состава в условиях аэрации при скорости вращения мешалки 300 об./мин и температуре (37±1) °С. Культуральную жидкость освобождали от микробных клеток путем центрифугирования (5Ó00g, 20 мин) с
последующей микрофильтрацией через нитроцеллю-лозный фильтр с диаметром пор 0,3 мкм. При необходимости стерильный фильтрат культуральной жидкости концентрировали ультрафильтрацией (пороговое значение молекулярной массы ~ 20000 Да). В опытах использовали беспородных морских свинок и белых мышей обоего пола массой 250-350 и 18-20 г соответственно. Приготовление препаратов инактивированных клеток иерсиний для иммунизации, морских свинок осуществляли по методике получения «убитой» чумной вакцины USP [16]. Подкожное инфицирование животных культурой штамма 1300 У. pestis проводили через три недели после иммунизации. Антигенный состав препаратов оценивали в реакции диффузионной преципитации с «моносыворотками» к отдельным антигенам иерсиний, полученными с помощью иммуносорбции. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с известными рекомендациями [1]. '
Результаты и обсуждение
Источником получения протективного антигена служила ' биомасса У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica. Такой выбор определялся тем, что, в отличие от живой вакцины EV, «убитые» вакцины, приготовленные из микробов вирулентного ‘ и авирулентного штаммов У. pestis, обладают невысокой протективной активностью в отношении экспериментальной чумы. Вероятной причиной такого резкого различия представлялась неспособность к выработке клетками вакцинного штамма значимых количеств искомого иммуногена в условиях in vitro и, напротив, экспрессией указанного свойства в макроорганизме. С учетом ранее показанной возможности сообщать прививаемым культурами У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica лабораторным животным' специфической резистентности к чуме [8, 11] мы надеялись, что названное различие.в меньшей степени характерно для микробов этих видов ввиду их относительно низкой «склонности» к паразитическому существованию по сравнению с возбудителем чумы. ' .
Предварительно в опытах на мелких лабораторных животных оценили иммуногенность жизнеспособных клеток выбранных штаммов У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica, содержащих и не содержащих собственную плазмиду кальцийзависмости. Как свидетельствуют данные, представленные в табл. Г, исследуемый штамм псевдотуберкулезного микроба характеризуется большей, по сравнению с таковым У. enterocolitica, иммуногенностью для лабораторных животных обоих видов. Это согласуется с многочисленными данными литературы о более тесной филогенетической близости У. peStis и У. pseudotuberculosis [14]. Обращает на себя внимание существенно более высокая иммуногенность культур У. pseudotuberculosis для морских свинок, чем бельк мышей. Названное различие выражено не столь ярко при иммунизации животных живой чумной вакциной на основе микробов' штамма EV, что, по-видимому, объясняется их способностью к биосинтезу Ф1-антигена, протективные свойства которого, как известно, выше для белых мышей. Следует также подчеркнуть, что такой уровень специфической невосприимчивости морских свинок к экспериментальной чуме (по цоказателю 1шД5о), который достигается
Таблица 1
Влияние наличия плазмиды кальцийзависимости на иммуногенность жизнеспособных клеток У. р5еийоШЬегсиШ1з и У. еШегосоИНса для морских свинок и белых мышей, зараженных культурой возбудителя чумы
Группа животных, Значение 1т03о:К95 (КОЕ) для
иммунизированных культурой морских свинок | белых мышей
У. р5еиёо1иЬегси1о$15 164/84 (рСасГ) 100:1,4 4,9-104: 2,4
164/84 (рСасГ) 79:1,7 >2,4-106
У. емегосоИйса Е9 (рСасГ) 17-106:1 >1180-106
‘ Е9 (рСасГ) > 1980-106 >826-106 -
Примечания: I. Животных подкожно однократно иммунизировали микробными культурами, выращенными на плотной питательной среде при температуре (27±1)°С в течение двух суток, в нарастающих дозах. 2. Морских свинок и белых мышей заражали подкожным способом культурой возбудителя чумы в дозах 1000-2000 ЛД50 и 500-1000 ЛД50 соответственно.
иммунизацией клетками штамма 164/84 У. рзеиёош-Ьегси1оз1з, не удается индуцировать при использовании в качестве вакцинирующего препарата культуры штамма ЕУ. Как видно из представленных в табл. 1 данных, жизнеспособные плазмиднесущие клетки штамма У. рзеис1ошЬегси1оз18 сообщают белым мышам резистентность к чуме значительно более высокого уровня, чем микробы его ,изогеиного бесплаз-мидного производного. В то же время в опытах на морских свинках такой разницы не обнаружено.
В табл. 2 представлены результаты изучения протективных свойств . микробов вышеуказанных вариантов иерсиний, инактивированных методом, используемым для приготовления «убитой» вакцины ШР. Как следует из данных табл. 2, «убитые» микробы У. р.чеис1о1иЬегси1о.ч1.^ и У. реМ1,<; индуцируют слабо выраженную защиту морских свинок от чумной инфекции. Если и можно говорить о несколько большем протективном эффекте вакцины ШР, то, по-видимому, он обусловлен присутствием в препарате Ф1-антигена (культура вирулентного штамма 195Р выращивается при 37 °С).
С целью изыскания более благоприятных условий для биосинтеза протективных антигенов иерсиний был проведен ряд исследований, связанных с использованием режимов культивирования, в большей степени имитирующих внутреннюю среду организма восприимчивых к чуме животных. Однако ни добавление в жидкую питательную среду сыворотки интактных морских свинок, ни выращивание У. р$eudotu.beгси1о$15 в полупроницаемой капсуле, имплантированной в брюшную полость животных, ни культивирование микробов непосредственно ин-траперитонеально в организме морских свинок не обеспечило повышения иммуногенности препаратов на единицу биомассы в виде инактивированных бактерий или соответствующих супернатантов.
Вместе с тем было обнаружено, что увеличение сроков «глубинного» культивирования псевдотуберкулезных микробов как в шуттелируемых колбах Эрленмейера, так и в ферментерах приводило к повышению содержания протективного вещества в среде выращивания. Так, из представленных в табл. 3 данных видно, что культуральная жидкость, полученная в результате выращивания бактерий У. pseudotuberculosis 164/84 (рСасГ), вне зависимости от времени взятия проб практически не защищала морских свинок от экспериментальной чумы. Препараты культуральной жидкости, полученные через 36 и 48 ч выращивания бактерий бесплазмид-
Таблица 2
Протективные свойства препаратов инактивированных микробов иерсиний для морских свинок, зараженных культурой возбудителя чумы
Группа животных, иммунизированных инактивированными микробами Кол-во . выживших животных из числа зараженных Доля выживших животных, % Средняя продолжи-; тсльность жизни павших животных, ХютиДы., Сут
У. р5еш1ошЬегси1о511 164/84 (рСас)+) 2/10 ' 20,0 ' 7,9
164/84 (рСасГ) 1/10 10,0 9,0
У: ешегосоИЧса Е9 (рСасГ) 0/7 0,0 '9,6
Е9 (рСасГ) ОП 0,0 ' 8,4
У. резня 195Р (вакцина ЦБР) 2/6 33,3 - 8,8
Контроль 0/7 0,0 8,0
(животных не иммунизировали)
Примечания: 1. Препараты для иммунизации готовили методом, аналогичным принятому в производстве вакцины и8Р. 2. Животных иммунизировали подкожно препаратами в объеме 1 мл. 3. Морских свинок заражали подкожным способом культурой возбудителя чумы в дозе 30 ЛД50.
ного варианта 164/84 (рСасГ), обладали достаточно выраженными протективными свойствами. ¡Снижение иммуногенности культуральной жидкости указанного варианта к 60-му часу выращивания объясняется, возможно, отмиранием клеток и соответствующим усилением гидролитического расщепления экстрацеллюлярного иммуногена. Обращает на себя внимание то, что инактивированные плазмиднесущие клетки штамма 164/84 (рСас1+), в отличие, от таковых его бесплазмидного производного,1 обладают определенной протективностью (по-видимому, за счет V-антигена), снижающейся по мере «старения» культуры.
Наличие препарата, содержащего относительно высокое количество протективного вещества в водорастворимом виде .(последнее обстоятельство чрезвычайно важно для идентификации иммуногена и отработки метода его выделения и очистки), позволило приступить к исследованиям по фракционированию препарата стерильной отдиализованной культуральной жидкости с целью выявления и выделения искомого протективного антигена. Для этого нами были опробованы известные препаративные приемы ступенчатого фракционирования: высаливание сульфатом аммония, изоэлектрйческое (кислотное) осаждение и ультрафильтрация через мембранные фильтры с последовательно уменьшающимися размерами пор. Полученные фракции исследовались на протективность для морских свинок и серологическую активность в реакции диффузионной преципитации (РДП) с 9 «моносыворотками» к отдельным антигенам иерсиний, наличествовавшим в исходном препарате культуральной жидкости. Одной из этих «моносывороток» являлась Б-антисыворотка, схема приготовления которой нами была отработана специально, поскольку в предшествовавших исследованиях иммуногенности различных субклеточных фракций иерсиний была обнаружена связь между наличием указанной линии преципитации в РДП с рядом поливалентных сывороток и протективностью антигенных препаратов для морских свинок. . .
Изучение иммуногенных свойств фракций, полученных путем ступенчатого сульфатно-аммонийного высаливания с шагом 0,1а (от 0,1а до 1,0а), установлено, что максимальное количество протек-
Таблица 3
Протективные свойства препаратов культуральной жидкости и инактивированных формалином микробных клеток, полученных из «глубинных» культур У. ртеы<й><ы6вгси/<ми, для морских свинок, зараженных возбудителем чумы
Таблица 4
Протективные свойства культуральной жидкости У. /юеш/о<нйегсц/<ий 164/84 (рСа(Г) и выделенного из нее Б-антигена для морских свинок, зараженных возбудителем чумы
Иммунизирующий препарат Штамм, вариант, использо-- ванный для приготовления иммунизирующего препарата Время отбора проб культур для приготовления иммунизирующего : препарата, ч Кол-во-выживших животных - из числа зараженных . Доля выживших животных, %
Культуральная 164/84 . 24 0/8 0
жидкость /.'(рСасГ)
.36 . \п , 14-
48 0/7 о ■
60 , 1/7 . .1.4
, 164/84 (рСа<Г) 24 , ; , 2/8 ,-г25
. .36 5/7 71 .
48 5/8 . :• 63
60 2/8 25
Инактивированные 164/84 24 4/7 57
формалином (рСасГ)
микробные - 36 2/6 33
клетки 48- 1/6 17
. 60 1/6 ' 17
164/84 (рСасГ) :24 1/6 17
- 36 0/5 0 .
,48 1/7 ' 14
• 60 0/6 0 '
Иммунизирующий препарат Доза иммуни-: зирующего препарата, ЕА* Кол-во выживших животных из числа зараженных Средняя продолжи- тельность жизни' павших животных ^аоиймч СуГ 1шОзо:К95, ЕА
Культуральная 0,80 5/6 15,0
жидкость 0,20 5/6 17,0 0,052:3,21
0,05 4/5 8,0
' 0,01 1/6 9,6
Б-антиген ■ • 0,80 6/6 -
0,20 6/6 _
' 0,05 2/6 12,3 ’ 0,058:1,79
0,01 1/5 и,з
Контроль (животных' • 0/8 9,3
Примечания:.!. Выращивание культур проводили в ферментерах МД-300 («МагиЫяЫ») с кальцийдефицитной средой на основе перевара Хоттингера. 2. Животных подкожно однократно иммунизировали препаратами стерильной концентрированной культуральной жидкости в неполном адъюванте Фрейнда в дозе, эквивалентной 5 мл надоса-дочной жидкости культуры, а также инактивированными микробами в дозе, которая соответствует количеству клеток, содержащихся в О, I мл культуры. 3. Морских свинок на 21-е сутки после иммунизации заражали подкожным способом культурой возбудителя чумы в дозе 20 ЛД50.
тивной для морских свинок субстанции «высаливается» при степени насыщения а=0,1; указанная фракция содержала, по данным РДП, практически весь антиген, преципитировавший с Б-антисыворот-кой, и малую долю антигена 62, основная масса которого наличествовала во фракциях а=0,9 и а=1,0. В последующих экспериментах показано, что водорастворимая форма Б-антигена могла «высаливаться» и при больших значениях , насыщения (до а=0,3), что, по-видимому, объясняется использованием различных условий культивирования клеточной биомассы, особенностями подготовки посевной культуры и др.
Результаты кислотного фракционирования культуральной жидкости, имевшей исходное значение pH 8,1, от 6,0 до 3,5 с шагом 0,5 ед. pH свидетельствовали о том, что максимум содержания про-тективной и преципитировавшей с Б-антисыворот-кой субстанции зарегистрировано во фракции, характеризовавшейся потерей водорастворимости при pH 5,0 (в указанной фракции содержались в разных количествах еще 5 из 9 оцениваемых моноантигенов).
Наконец, анализ протективных свойств и пре-ципитирующей активности фракций, полученных в ходе ступенчатой ультрафильтрации, показали, что моноантигены культуральной жидкости с молекулярной массой ниже 60 КДа, среди которых не было Б-антигена, оказались неспособны защищать морских свинок от экспериментальной чумы.
Достаточно строгие, на наш взгляд, доказатель-
неиммунизировали) " '
Примечания: 1. Исходные препараты культуральной жидкости и Б-антигена, использованные для приготовления «разводок» с шагом 4, имели одинаковую серологическую активность в РДП с антисывороткой к Б-антигену, равную 8 ЕА. 2. * За дозу иммунизирующего препарата принимали его количество, соответствующее серологической активности (ЕА) в РДП с антисывороткой к Б-антигену. 3. Иммунизирующие препараты в неполном адъюванте Фрейнда вводили однократно подкожно в объеме 1 мл за 21 сут до инфицирования. 4. Животных заражали подкожным способом культурой возбудителя чумы в дозе -30 ЛДзо- .
ства протективности Б-антигена для морских свинок были получены в опытах, результаты которых представлены в табл. 4 и 5. Из культуральной жидкости, полученной при выращивании бактерий У. р$еи<1ошЪегси1ощ 164/84 (рСасГ) в ферментере МД-300 и освобожденной от микробных клеток центрифугированием и далее микрофильтрацией, с помощью осаждейия сульфатом аммония, последующих растворения в забуференном фосфатами физиологическом.растворе КаС1 (pH 7,2) и диализа против данного буферного раствора количественно был выделен Б-антиген. «Разводками» полученного препарата, а также эквивалентными по серологической активности дозами исходной культуральной жидкости иммунизировали морских свинок. Результаты заражения животных культурой возбудителя чумы (табл. 4) показали, что вся протективная активность последнего препарата обусловлена наличием в нем Б-антигена: соответствующие значения показателя 1гтгЬ50 составили 0,052:3,21 ЕА и 0,058:1,79 ЕА.
Об этом же свидетельствуют данные опыта по оценке протективных свойств аффинно выделенной фракции Б-антигена (табл. 5). В этих исследованиях по известному методу [5] был получен иммуносорбент на основе СИБг-активированной сефарозы, конъюгированной с. иммуноглобулинами класса в кроличьей антисыворотки к Б-антигену с активностью 16ЕА, полученными риванольным методом [2]. После пропускания 6,5 мл стерильного концентрата культуральной жидкоста через гель аффинной колонки размером 2x85 см, его промывания буфером для хроматографии связавшийся с иммобилизованными антителами Б-антиген элюировали с помощью 3 М раствора роданита натрия. Полученны-
Таблица 5
Протективные свойства культуральной жидкости У. р5еи(1о1иЬегси1о$15 164/84 (рСасГ) и аффинно выделенных из нее фракций для морских свинок, зараженных возбудителем чумы
КЖ исходная 0,8 3/5 60
КЖ после аффинной 0,0 0/7 0
колонки**
Фракция 1 0,2 3/6 " 50
Фракция 2 0,1 1/6 17
Фракция 3 0,1 1/5 20
Фракция 4 0,0 0/6 0
Фракция 5 0,0 0/6 0
Фракция 6 0,0 0/6 0
Контроль (животных 0/6 0
не иммунизировали)
Примечания: 1. Примечания 2, 3 к табл. 4 справедливы для табл. 5. 2. ** Культуральную жидкость после аффинной колонки вводили в количестве, по объему соответствующему таковому исходной культуральной жидкости. 3. Животных заражали подкожным способом культурой возбудителя чумы в дозе -140 ЛД50.
ми фракциями, отобранными в объеме 2,5 мл, иммунизировали морских свинок. Кроме того, животным, вводили препараты исходной культуральной жидкости, а также культуральной жидкости, прошедшей через гель аффинной колонки и сконцентрированной до первоначального объема 6,5 мл.
Как показывают данные, представленные в табл. 5, концентрат культуральной жидкости, прошедшей через аффинную колонку, не взаимодействовал в РДП с антисывороткой, к Б-антигену и не защищал морских свинок от экспериментальной чумы. Исходный препарат культуральной жидкости обладал указанными серологической активностью и протективными свойствами. Вместе с тем первые фракции элюции (№ 1, 2, 3) связавшегося с аффинным иммуносорбентом материала культуральной жидкости, которые характеризовались способностью преципитировать с антителами антисыворотки к Б-антигену, одновременно оказались протективными для морских свинок.
С помощью антисыворотки к Б-антигену были оценены микробные культуры нескольких видов иерсиний на предмет наличия в них Б-антигена. Методом РДП было показано, что наибольшее количество этого антигена содержат клетки У. pseudotuberculosis, особенно штамма .164/84 (pCad+), в меньшей степени - его бесплазмидного производного варианта 164/84 (рСасГ), а также микробы ряда других исследованных штаммов этого вида микроорганизмов (9547, 147, 1179). В культурах нескольких штаммов чумного микроба (1300, 231, 166, EV линии НИИЭГ) Б-антиген не выявляется. Вместе с тем клетки изогенных вариантов штамма EV, а именно вариантов EV 105, EV 107 и EV 104 [4], в минимальном количестве содержат указанный антиген. Лишь в единичных случаях нам удалось зафиксировать наличие Б-антигена в культурах штамма У. enterocolitica Е9. Не обнаружено Б-антигена в культурах изученных штаммов кишечной палочки, сибиреязвенного, сапного, мелиоидозного, туляремийного, легионеллезного, бруцеллезного микробов, выращенных на плотной питательной среде при температуре (37±1) °С. Это позволяет
считать Б-антиген родоспецифическим антигеном, во всяком случае антигеном, общим для патогенных видов иерсиний (культуры непатогенных для человека видов иерсиний мы не исследовали).
Таким образом, в результате проведенных исследований идентифицирован и выделен родоспецифический антиген (Б-антиген), способный индуцировать специфическую невосприимчивость морских свинок к экспериментальной чуме. Б-антиген характеризуется достаточно высокой молекулярной массой, способен выделяться в питательную среду при глубинном культивировании микробов У. pseudotuberculosis, его биосинтез кодируется хромосомной ДНК. В настоящее время нами изучаются физико-химические, биохимические, им-мунохимические и иммунобиологические свойства Б-антигена.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в ^микробиологических исследованиях. - Л., 1962. -2. Брок И. Получение препаратов иммуноглобулинов // Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля / Пер. с нем. под ред. А.П. Тарасова. - М., 1987. - 3. Дроздов И.Г., Анисимов А.П., Андрющенко Б.Н. и др. // Иммунол. и специ-фич. профилакт. особо опасных инф.: Матер. Российск. науч. конф. - Саратов, 1993. - С. 169-170. - 4. Евстигнеев В.И., Абдуллин Т.Г., Смирнов Е.В. и др. // Мол, генет. -1991.- № 11. - С. 15-17. - 5. Иммуносорбенты :в< очистке белков / Под ред. Э. Руослахти // Пер. с англ. Л.И. Левченко. -М., 1979. - 6. Паутов В.Н., Чичерин Ю.В., Евстигнеев В.И. и др. // Журн. микробиол. - 1972. - № 10. - С. 37-42. -
7.Рыжко И;В., Алексеева Л.П-., Цураева Р.И. и др. // Иммунол. и специфич. профилакт. особо опасных инф.: Матер. Российск. науч. конф.- Саратов, 1993. - С. ;;56-57. -
8.Тимошек Г.М., Колесник Р.С., Домарадский И.В. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1962. - № 3. - С. 85-87. -
9. Шанина Л.Н. // Генет., биохим. и иммунохим. особо опас-
ных инф - Ростов н/Д, 1967. - Вып. 1. - С. 373-381. - 10. Anderson G. W. Ir., Leary S.E.C., Williamson E.D. et al. II Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64. - P. 4580-4585. -11. Alonso J.M., Hurtrel B., Mazigh D. et al. II Infect. Immun. - 1982,- Vol. 36. - P. 423-425. - 12. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et al. // Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. -1947. - Vol. 64. - P. 139-141. -13. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et al. II J. Immunol. - 1952. - Vol. 68. P. 131-145. - 14. Bercovier H., Mollaret H.H., Alonso J.M. et al. II Curr. Microbiol. - Vol. 4. - P. 225-229. - 15. Ehrenkranz N.J., Meyer K.F. // J. Infect. Diseases. - 1,955. - Vbl. 96. -P. 138-^144.- 16. Plague vaccine. Recomendation of the immunization practices Advisory Committee (IPAC) // Wkly. Epidem. Res.-1982.-Vol. 57.-P. 332-334.- 17. Titball R.W., Williamson E.D. // Advances in experimental medicine and;biology. The genus Yersinia. Entering the functional genomic era. - 2003. -Vol. 529. - P. 397-406. -18. Schutze H. // Brit. J. Exptl. Path. -1932.-Vol. 13.-P. 284-288. -
i
A.A.Byvalov, l.V.Darmov, V.l.Yevstigneyev, E.V.Pimenov
Identification and Isolation of the Antigen,
Protecting Guinea Pigs from Experimental Plague Infection
Microbiology Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov
Several pathogenic Yersinia cultures were used in the experimental studies aimed at the disclosure of an antigenic substance capable of inducing specific insusceptibility state in Guinea pigs against the plague infection agent. Submerged cultivation of Yersinia pseudotuberculosis wais shown to result in the excretion into the nutritional medium of a.high molecular antigen (B-antigen), common for all the pathogenic Yersinia, its synthesis being coded for by the chromosomal DNA. A single subcutaneous injection of B-antigen isolated, from the cultural fluids and deposited in incomplete Freund's adjuvant, induced the development of specific resistance to plague in Guinea pigs.
Поступила 01.12.04
Иммунизирующий препарат Доза иммунизирующего препарата, ЕА* Кол-во выживших животных из числа зараженных Доля выживших животных,’ %
