CC BY
80
A.S., Polovinkina V.S., Kulikalova E.S., Afanas'ev M.V. Molecular genetic analysis of epidemic dangerous imported Vibrio cholerae El Tor strains isolated in Siberian and Far Eastern regions of Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2012; 2: 13-20. (in Russian) 15. Lukashov V.V. Molecular evolution and phylogenetic analysis. Moscow: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2009. (in Russian)
Received 17.12.13
MULTILOCUS SEQUENCE-TYPING OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS WITH VARIOUS EPIDEMIC IMPORTANCE
L. V. Mironova, M. V. Afanas'ev, E. G. Goldapel, and S. V. Balakhonov Irkutsk Antiplague Research institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russia
The allele polymorphism of the housekeeping genes (dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, gmd) from the Vibrio cholerae strains with
different epidemic importance (n = 41) isolated in Siberia and at the Far East during the cholera pandemic VII was tested. All toxigenic strains isolated at the period of epidemic complications irrespective of time and source of isolation were characterized by the identical allele profile and belonged to the same sequence-type. Nine sequence types were detected in non-epidemic isolates. The dendrogram clustering was associated with the serogroup and in some cases with the territory and time of isolation. The structure heterogeneity of the non-toxigenic V. cholerae housekeeping genes was in most cases caused by the synonymous nucleotide replacements (Dn/Ds < 1) indicating the prevalence of the negative V. cholerae at the analyzed genome sites. The revealed distinctions in the structure of housekeeping genes of the V. cholerae with different epidemic importance can be regarded as evidence of various evolutional directions in these strain groups.
Key words: Vibrio cholerae, multilocus sequence-typing, MLST, housekeeping gene, allele polymorphism.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.842.23:579.25].083.3
Бывалов А.А.1,2, Дудина Л.Г.1,2, Чернядьев А.В.1, Конышев И.В.1,2, Литвинец С.Г.1, Оводов Ю.С.2
иммунохимическая активность б-антигена YERSINIA pseudotuberculosis
'Вятский государственный университет, г. Киров; 2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар
Получена панель гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к иммунохимически неидентичным антигенным эпито-пам белковой природы, расположенным на наружной мембране Yersinia pseudotuberculosis. Показано, что идентифицированный ранее Б-антиген, активная иммунизация которым защищает от экспериментальной чумы лабораторных животных, выявляется моноклональными антителами к указанным белковым детерминантам, равно как и детерминантам О-боковых цепей липопо-лисахарида. Б-антиген представляет собой компонент наружной мембраны Y. pseudotuberculosis, экскретируемый в виде везикул (OMVs) бактериями при выращивании в жидкой питательной среде.
Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis; Б-антиген; липополисахарид; моноклональные антитела; антигенные эпи-топы.
Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза, одного из сапрозоонозных заболеваний, природные очаги которого существуют во многих регионах России, странах Европы, Америки, Азии. Возбудитель чумы - филогенетически относительно «молодой» вид рода Yersinia, дивергировавший от Y. pseudotuberculosis 1,5-20,0 тыс. лет назад. Микробы двух названных видов генетически (и иммунохимически) очень близки (более 90% гомологии хромосомной ДНК). Вместе с тем эво-люционно закрепленные приобретения бактерий новообразованного вида, в первую очередь, носительство крупной (pFra) и малой (pPla) плазмид, обусловили появление иной, гораздо более тяжелой инфекции - чумной, патогенез и эпидемиология которой резко отличаются от таковых псевдотуберкулеза [1]. Одним из основных направлений совершенствования системы специфической профилактики чумы является разработка молекулярной чумной вакцины, так как высокоэффективная живая вакцина на основе штамма EV характеризуется выраженной реактогенностью, а цельноклеточные инакти-вированные вакцины, полученные из бактерий Y. pestis, низкоиммуногенны [2].
Ранее нами в культуральной жидкости Y. pseudotu-
berculosis был идентифицирован антиген (Б-антиген), который в качестве иммунизирующего препарата способен защищать от экспериментальной чумы (но не псевдотуберкулеза) морских свинок и, по-видимому, обезьян [3, 4]. Вместе с тем было показано, что иммунохимиче-ская экспрессия Б-антигена в клетках чумного микроба, выращенных in vitro, относительно низка. Антиген состоит из полисахаридного, белкового и липидного компонентов, достаточно прочно связанных между собой, имеет поверхностную локализацию в микробной клетке, способен экскретироваться в питательную среду при глубинном выращивании Y. pseudotuberculosis, характеризуется достаточно высокой молекулярной массой, его биосинтез детерминируется хромосомной ДНК [3, 4].
В настоящей работе была предпринята попытка дальнейшего изучения природы Б-антигена, в первую очередь, его иммунохимической активности. Один из методических подходов в такого рода исследованиях -применение моноклональных антител (МКАт). Имеются сообщения о получении гибридом, продуцирующих МКАт различной специфичности к поверхностным полипептидам Y. pseudotuberculosis [5-7]. Ранее мы сообщали о получении набора гибридом, продуцирующих МКАт к липополисахариду (ЛПС) Y. pseudotuberculosis [8].
Цель настоящей работы состояла в изучении имму-нохимической активности Б-антигена как биологически активного поверхностного антигена Y. pseudotuberculosis с помощью панели моноклональных антител.
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. Штамм Y. pseudotuberculosis 1b получен из коллекции ФКУЗ РосНИИП-ЧИ «Микроб» (кат. № 474); вакцинный штамм Yersinia pestis EV получен из коллекции ООО «Агровет».
Бактерии Y. pseudotuberculosis выращивали в шуттелируе-мых колбах Эрленмейера с жидкой питательной средой на осно-
ве солянокислотного гидролизата казеина при температурах 10 и 37°С в течение 96 и 36 ч, соответственно, Y. pestis - при температуре 27°С в течение 30 ч. Культуры центрифугировали, осадки клеток использовали для получения препаратов ЛПС, из надосадочных жидкостей культур Y. pseudotuberculosis после их стерилизации микрофильтрацией и концентрирования ультрафильтрацией (далее они обозначены как КЖ-10 или КЖ-37 в зависимости от температуры выращивания бактерий) выделяли препараты Б-антигена. Микробные клетки для оценки их анти-генности методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) инактивировали 0,5 % формальдегидом.
Выделение ЛПС и Б-антигена. Препараты ЛПС выделяли из культур иерсиний методом водно-фенольной экстракции [9] и очищали трехкратным ультрацентрифугированием (105 000 g, 3 ч). В качестве контроля использовали коммерческий препарат ЛПС, выделенный из клеток Escherichia coli 055:В5 («Difco», США). Препараты Б-антигена выделяли из КЖ-10 (или КЖ-37) методом аффинной хроматографии [3], используя колонку с CNBr-активированной сефарозой («Sigma», США), конъюгиро-ванной с полученными ранее МКАт1 [10].
Моноклональные антитела. Для получения гибридом мышей линии BALB/с подкожно трехкратно (с интервалом в 21 сут) иммунизировали препаратом Б-антигена-37, сорбированным на геле гидроокиси алюминия в возрастающих дозах: 50, 100, 200 мкг антигена. Выбранным животным с максимальной серо-конверсией за 4 сут до гибридизации вводили внутрибрюшинно по 100 мкг Б-антигена. Гибридизацию спленоцитов с миелом-ными клетками P3-X63-Ag8.653 проводили с использованием полиэтиленгликоля с ММ4000 («Serva», Германия). Первичный скрининг культуральных жидкостей проводили методом ИФА в планшетах, сенсибилизированных препаратом Б-антигена (10 мкг/мл). Из числа первично позитивных культур были отобраны 5 линий гибридных клеток с максимальной продукцией антител. После клонирования методом предельных разведений и пассирования в условиях in vitro и затем in vivo была установлена стабильность полученных гибридом по антителопродуцирую-щим и пролиферативным свойствам. Культуры гибридом вводили внутрибрюшинно в дозе 2-4 млн живых клеток на животное мышам линии BALB/с, через 8-12 сут отсасывали и центрифугировали асцитные жидкости. В работе использовали препараты надосадочных жидкостей, обозначенные как МКАт5-МКАт9.
Электрофорез. Электрофорез антигенных препаратов с их предварительным 5-минутным кипячением выполняли по Лэммли [11] c Na-ДДС с помощью Protean II xi Cell («Bio-Rad», США) при постоянной мощности 15 Вт в 12,5% ПААГ размером 164x170x1,5 мм. Окрашивание геля проводили Кумасси R-250 (рис. 1, а) или нитратом серебра (см. рис. 1, б) [12].
Иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение препаратов выполняли как описано выше с добавлением в ПААГ 4 М мочевины. Обработку антигенных препаратов перйодатом натрия проводили, как описано ранее [10]; обработку протеиназой К - по Хичкок и Браун [13]. Нагрузка на дорожки (шириной 5 мм) препаратов ЛПС и Б-антигена составляла 12,5 мкг и 30 мкг соответственно, бактерий - 200x106 микробных клеток. Пробы перед нанесением в ПААГ кипятили в течение 5 мин в литическом буфере. Перенос на нитроцеллюлозу и последующие стадии осуществления метода описаны ранее [10].
Твердофазный иммуноферментный анализ. Методика постановки изложена ранее [10]. Дополнительно: концентрация ЛПС, Б-антигена и КЖ в качестве сенситина лунок планшета в ИФА составляла 10 мкг/мл. Предшествующая ИФА обработка антигенных препаратов перйодатом Na проводилась, как и ранее [10], Б-антигена - так же, как и ЛПС. После обработки препарата Б-антигена (в концентрации 100 мкг/мл) протеиназой К, проводившейся по условиям обработки цельноклеточных препаратов, отмывку не проводили.
Дот-вариант ИфА. Б-антиген-10 в концентрации 500 мкг/мл в течение 1 ч при температуре 60°С инкубировали в фосфатном буферном растворе, pH 7.3, с протеиназой К (0,2 мг/мл) или подвергали кипячению в течение 3 и 10 мин в литическом буфере для образца, используемом для электрофореза. Эти препараты, а также препарат Б-антигена необработанный, «нативный» в буфере для переноса наносили по 5 мкл на лист нитроцеллюлозы. Последующие стадии анализа проводили по идентичной схеме и
Рис. 1. Электрофореграммы Б-антигена и препаратов сравнения: а- окрашивание Кумасси Я-250, б - нитратом серебра.
1 - Б-антиген-37 (30 мкг), 2 - КЖ-37, из которой выделен препарат Б-антигена (40 мкг), 3 - Б-антиген (25 мкг), ЛПС-37 (12,5 мкг).
одновременно с осуществлением иммуноблоттинга (рис. 2), начиная со стадии инкубации с МКАт.
Просвечивающая электронная микроскопия. Исследуемые препараты наносили на медные сеточки (200 меш, SPI Supplies, США), покрытые углеродной пленкой-подложкой, сорбировали 2 мин, убирали избыток жидкости фильтровальной бумагой, сушили препарат. Снимки получали на электронном микроскопе JEM-2100 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 160 кВ. Фотографирование осуществляли с использованием CCD камеры Keen View («Olympus», Германия). Для микроскопической оценки антигенной активности препаратов КЖ и Б-антигена готовили конъюгат коллоидного золота и иммуноглобулинов поликлональной антисыворотки к Б-антигену Y. pseudotuberculosis. Кратко: при комнатной температуре суспензию коллоидного золота 20 мин инкубировали с указанными антителами в конечной концентрации 100 мкг/мл, добавляли бычий сывороточный альбумин (БСА) до конечной концентрации 0,12% и через 1 ч центрифугировали при 18 000 g в течение 30 мин. Осадок дважды отмывали в фосфатном буферном растворе при тех же условиях центрифугирования. К осадку конъюгата добавляли БСА до конечной концентрации 0,1% и консервировали в 0,01% азида натрия. Перед микроскопией антигенный препарат термостатировали при 37°С с конъюгатом в объемном соотношении 1:1 и наносили на медные сеточки.
Результаты и обсуждение
Рис. 1, а характеризует полипептидный состав препаратов Б-антигена и культуральной жидкости, из которой его выделили; наиболее интенсивная линия Б-антигена соответствовала белку с молекулярной массой ~15,5 кД. Окрашивание ПААГ нитратом серебра (см. рис. 1, б) выявило сходство электрофоретической картины по-
M, kD
III
IV
97,466,2"
45,0-
31,0-
21,5-
14,4-
1
А
12345 12 345
12345 12345 123 45
Рис. 2. Иммуноблоты антигенов иерсиний с моноклональными антителами.
I, II, III, IV, V - МКАт 5,6,7,8,9 соответственно; 1 - клетки Y. pseudotuberculosis, выращенные при 10°С, 2 - то же при 37°С, 3 -клетки Y. pseudotuberculosis, выращенные при 37°С и обработанные протеиназой К, 4 - клетки Y. pestis EV, выращенные при 27°С, 5 -Б-антиген-10.
лисахаридной составляющей препаратов Б-антигена и ЛПС.
В табл. 1 представлены результаты определения им-мунохимической активности Б-антигена и антигенных препаратов сравнения (ЛПС и цельноклеточных) в ИФА с МКАт линий 5-9. С наибольшей эффективностью в ИФА на основе всех 5 линий МКАт определялись препараты Б-антигена, которые использовались в качестве целевого антигена при получении гибридом. Следует отметить отсутствие в ИФА с применением МКАт5-8 существенных различий в антигенности препаратов Б-антигена, которые выделяли из культур штамма-продуцента, выращенных при двух температурных режимах; исключение составили МКАт9, которые выявляли «холодовой» вариант антигена значительно хуже.
Бактерии Y. pseudotuberculosis, выращенные при температуре 10 °С, выявляются МКАт всех 5 линий при прочих равных условиях значительно менее эффектив-
но по сравнению не только с клетками этого же штамма Y. pseudotuberculosis, которые культивировали при температуре 37 °С, но и микробами близкородственного штамма Yersinia pestis EV. В целом значения ОП492 для всех 4 использованных препаратов ЛПС, полученных из бактерий Y. pseudotuberculosis, Y. pestis и E. coli, были приблизительно одинаковыми и меньшими, чем значения ОП4 тов (см. табл. 1).
Для изучения химической природы эпитопов, распознаваемых МКАт5-9, использовали известные методические подходы, основанные на обработке антигенных препаратов протеазами либо перйодатом натрия. Из представленных в табл. 2 данных следует, что обработка перйодатом Na резко повышает значение ОП492 в лунках с бактериями Y. pseudotuberculosis, выращенными при температуре 10°С, по сравнению с соответствующими контролями, характеризующимися невысокой активностью (см. табл. 1). Аналогичная, но менее выраженная зависимость при использовании МКАт всех 5 линий зарегистрирована для микробов Y. pestis. Значения ОП492 для клеток Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 37°С, после перйодатного окисления, напротив, несколько снизились. Обработка перйодатом Na вызывала в целом некоторое повышение исходно низкой активности в ИФА всех 4 препаратов ЛПС, более выраженное для ЛПС, выделенного из «холодовой» культуры Y. pseudotuberculosis.
Следует подчеркнуть, что перйодатное окисление не оказало влияния на регистрируемую активность Б-антигена, в отличие от препарата культуральной жидкости, из которой его выделили (см. табл. 2). Причина названного различия может состоять в пространственной доступности для взаимодействия с МКАт5-9 белковых эпитопов очищенного Б-антигена и их экранированием внеклеточными микробными метаболитами или компонентами питательной среды углеводной природы в составе культуральной жидкости, ослабляемым перйо-датным окислением.
Данные табл. 3 указывают на ингибирующее влияние 3 протеаз на активность в ИФА клеток Y. pseudotuberculosis. Очевидно, можно говорить о меньшей резистентности к действию протеиназы К бактерий этого вида, которые культивировали при повышенной (37°С) температуре, а также, по-видимому, клеток Y. pestis штамма EV. Указанные различия можно объяснить
Таблица 1
Специфическая активность моноклональных антител в ИФА с антигенами иерсиний
Антигенный препарат Значение ОП492* в ИФА
МКАт5** МКАтб** МКАт7** МКАт8** МКАт9**
Б-антиген-37*** (n > 4) 2,218 2,001 2,434 2,110 1,274
Б-антиген-10*** (n = 1) 2,290 1,768 2,650 2,106 0,536
Клетки Y. pestis EV-27 (n = 2) 0,955 1,223 1,182 1,054 0,596
ЛПС Y. pseudotuberculosis-10*** (n > 4) 0,255 0,552 0,210 0,492 0,175
ЛПС Y. pseudotuberculosis-37*** (n > 4) 0,147 0,499 0,265 0,506 0,093
ЛПС Y. pestis EV-27*** (n = 2) 0,171 0,470 0,288 0,641 0,081
ЛПС E. coli (n > 2) 0,133 0,499 0,320 0,712 0,080
Клетки Y. pseudotuberculosis-10*** (n > 5) 0,201 1,126 0,470 0,632 0,135
Клетки Y. pseudotuberculosis-37*** (n > 5) 1,505 1,897 1,820 1,615 1,132
* Представлены средние арифметические значения;
** МКАт5, 7 и 9 использовали в разведении 1:2000, МКАтб - 1:500 и МКАт8 - 1:100;
***10, 27, 37 - температура выращивания культуры, из которой получали антигенные препараты.
Таблица 2
Влияние перйодата Na на иммунохимическую активность антигенов иерсиний в ИФА с использованием МКАт
Антигенный препарат Значение ОПо*/ОПк** ± 1^*** (число определений)
МКАт5 МКАтб МКАт7 МКАт8 МКАт9
Б-антиген-37 1,04 ± 0,09 (4) 1,04 ± 0,08 (5) 1,06 ± 0,05 (4) 1,03 ± 0,05 (5) 0,91 ± 0,37 (4)
Б-антиген-10 1,02 (1) 1,04 (1) 1,07 (1) 1,05 (1) 0,59 (1)
КЖ-10 н/о 1,96 (1) 4,01 (1) 2,61 (1) н/о
ЛПС Y. pseudotuberculosis-10 1,23 ± 0,30 (5) 1,70 ± 0,30 (4) 1,47 ± 0,30 (4) 1,53 ± 0,68 (4) н/о****
ЛПС Y pseudotuberculosis-37 н/о 1,23 ± 0,22 (6) 1,25 ± 0,20 (6) 1,07 ± 0,09 (6) н/о
ЛПС Y. pestis EV-27 н/о 1,34 ± 0,05 (2) 1,43 (1) 1,58 (1) н/о
ЛПС E. coli н/о 1,38 ± 0,03 (2) 1,10 ± 0,18 (3) 1,01 ± 0,31 (3) н/о
Клетки Y. pseudotuberculosis-10 3,44 ± 1,51 (6) 1,85± 0,52 (5) 3,66 ± 0,97 (6) 1,93 ± 0,35 (6) 3,46 ± 0,94 (4)
Клетки Y. pseudotuberculosis-37 0,82 ± 0,38 (4) 0,80 ± 0,19 (4) 0,77 ± 0,30 (4) 0,76 ± 0,16 (4) 0,71 ± 0,29 (4)
Клетки Y. pestis EV-27 1,73 (1) 1,51 (1) 1,58(1) 1,21(1) 2,62 (1)
ОП* - оптическая плотность в лунке с обработанным перйодатом Па (100 мМ) антигенным препаратом; ** ОПк - контроль с необработанным препаратом; *** 195 - доверительный интервал для р = 0,95; **** и/о - значения ОП,, были менее 0,2.
наличием у микробов «холодовой» культуры слоя поверхностно расположенных О-боковых цепей ЛПС, препятствующих инактивирующему воздействию фермента. У клеток Y. pseudotuberculosis, которые выращивали при температуре 37°С, выраженность этого слоя низка
[14], а у бактерий Y. pestis О-боковые цепи отсутствуют
[15]. Нужно отметить относительно небольшое, по сравнению с цельноклеточными препаратами, ингибирова-ние протеиназой К активности Б-антигена, во всяком случае, выявляемого МКАт6 и МКАт8 (см. табл. 3).
Данные табл. 2 и 3 указывают на то, что детерминанты, выявляемые МКАт5-9, имеют белковую природу. Такое предположение было подтверждено результатами иммуноблотинга. Как видно на рис. 2, предваряющая электрофорез обработка клеток Y. pseudotuberculosis и Y. pestis протеиназой К приводит к исчезновению окрашенных полос на блотах, полученных с использованием всех пяти МКАт. Косвенным указанием на полипептидную природу этих эпитопов является и то, что при получении соответствующих гибридом скрининг куль-туральных жидкостей в ИФА проводили по наличию высокой активности с препаратом Б-антигена, включаю-
щего значимое количество белковой составляющей, при минимальной активности с препаратами ЛПС. В предшествующей работе [10] были получены гибридомы, секретирующие МКАт1-4 к О-антигену ЛПС, которые, как оказалось, с высокой активностью в ИФА взаимодействовали и с Б-антигеном, а именно с его углеводным компонентом, визуализируемым в виде «лестницы», характерной для О-боковых цепей ЛПС (результаты иммуноблотинга не проиллюстрированы). Эти данные позволяют утверждать, что в состав Б-антигена входят иммунохимически активные белковый и липополисаха-ридный компоненты.
В целом результаты проведенных исследований свидетельствуют о существенных различиях в антигенности поверхностных структур бактерий Y. pseudotuberculosis, выращенных при различных температурных условиях. Клетки «холодовой» культуры псевдотуберкулезного микроба окружены количественно достаточно выраженным и иммунохимически активным слоем углеводной природы - О-боковыми цепями ЛПС, с той или иной (в зависимости от концентрации и локализации соответствующих эпитопов) степенью интенсивности вы-
Таблица 3
Влияние протеаз на иммунохимическую активность антигенов иерсиний в ИФА с использованием МКАт
Антигенный препарат Фермент Значение ОПо*/ОПк** ± 195*** (число определений)
МКАт5 МКАт6 МКАт7 МКАт8 МКАт9
Б-антиген-37 Протеиназа К 0,82 (1) 0,94 (1) 0,86(1) 0,98 (1) 0,63 (1)
Клетки Y. pseudotuberculosis-37 Протеиназа К 0,19 ± 0,06 (7) 0,26 ± 0,16 (5) 0,23 ± 0,10 (7) 0,37 ± 0,11 (7) 0,17 ± 0,07 (7)
Трипсин 0,55 (1) 0,59 (1) 0,56 (1) 0,76 (1) 0,52(1)
Пепсин 0,71 (1) 0,72 (1) 0,77 (1) 0,84 (1) 0,76 (1)
Клетки Y. pestis EV-27 Протеиназа К 0,21 (1) 0,49 (1) 0,38 (1) 0,34 (1) 0,34 (1)
Клетки Y. pseudotuberculosis-10 Протеиназа К н/о**** 0,48 ± 0,28 (4) 0,68 ± 0,28 (4) 0,69 ± 0,30 (4) н/о
Трипсин н/о 0,37 (1) 0,58 (1) 0,85 (1) н/о
Пепсин 0,72 (1) 0,38 (1) 0,39 (1) 0,63 (1) н/о
ОПО* - оптическая плотность в лунке с обработанным ферментом антигенным препаратом; ** ОПК - контроль с необработанным препаратом; *** I - доверительный интервал для р = 0,95; **** н/о - значения ОПК были менее 0,2.
Рис. 3. Результаты дот-ИФА препаратов Б-антигена-10 с моно-
клональными антителами. Препараты Б-антигена: 1 - необработанного, 2 - обработанного про-теиназой К, 3, 4 - кипяченого в литическом буфере в течение 3 и 10 мин соответственно. I - МКАтб, II - МКАт7, III - МКАт1.
являемыми МКАт1-4 [10]. Как показано для других грамотрицательных бактерий [16], наличие О-антигена в структуре ЛПС снижает степень экспонирования на поверхности клетки иных, в том числе белковых компонентов наружной мембраны. Этот слой, как можно судить по данным табл. 2, экранирует белковые детерминанты, становящиеся доступными для взаимодействия с комплементарными МКАт5-9 после перйодатного окисления. Некоторое снижение значений ОП для клеток культуры, выращенной при температуре 37°С и обработанной перйодатом № (см. табл. 2), можно объяснить конформационными изменениями углеводсодержащих поверхностных структур бактерии, не влияющими на химический состав эпитопов, специфичных для МКАт5-9, но препятствующими реакции антиген - антитело.
При изучении антигенности Б-антигена обращают на себя внимание его иммунохимическая инертность при достаточно большой нагрузке на дорожку (около 30 мкг) в иммуноблоттинге (см. рис. 2) и, напротив, высокая активность в ИФА в концентрации 10 мкг/мл (см. табл. 1) при использовании МКАт5-8, в меньшей степени МКАт9. Указанное различие объясняется, очевидно, инактиви-рующим действием кипячения в литическом буфере образцов перед проведением электрофореза на выявляемые МКАт5-9 эпитопы в составе электрофоретически разделенных полипептидных компонентов Б-антигена, но не
цельноклеточных препаратов. Об этом же свидетельствуют и результаты параллельно проводившегося дот-ИФА (рис. 3). Результаты опыта показали полную или почти полную инактивацию иммунохимической активности препарата Б-антигена после его кипячения в литическом буфере, в отличие от «нативного» препарата Б-антигена, дававшего ярко окрашенное пятно при использовании МКАтб и МКАт7. Наряду с упомянутыми МКАт в идентичных условиях использовали МКАт1, выявляющие полисахаридную детерминанту, расположенную на О-боковых цепях ЛПС Y. pseudotuberculosis; о получении соответствующей гибридомы мы сообщали ранее [10]. Оказалось, что кипячение препарата Б-антигена в лити-ческом буфере лишь незначительно снижало интенсивность окрашиваемого посредством МКАт1 (в отличие от МКАт5-9) пятна на нитроцеллюлозе. Вместе с тем МКАт1 обеспечивали приблизительно такую же высокую, как и МКАт5-9, чувствительность детекции «нативного» Б-антигена методом ИФА (ОП492~2.0). Отмеченное различие объясняется, очевидно, ингибирующим действием пробоподготовки - кипячения в литическом буфере - на белковые эпитопы Б-антигена (но не цельных клеток), комплементарные МКАт5-9, и отсутствием ее выраженного влияния на детерминанты углеводной природы, выявляемые МКАт1.
Методом трансмиссионной электронной микроскопии мы оценивали морфологические особенности препаратов КЖ и Б-антигена. Так, микроскопия препарата Б-антигена-37 с конъюгатом на основе коллоидного золота показала наличие в нем везикул, имевших в основной массе округлую форму и характеризовавшихся значительной вариабельностью по размерам (6-50 нм); частицы коллоидного золота выявляли, как правило, в местах скопления везикул (рис. 4, а). Анализ препаратов показал способность везикул к агрегированию с образованием разнообразных по конфигурации и размерам структур, имеющих часто округлую форму; возможно, этому процессу способствует внеклеточный матрикс. Везикулы Б-антигена, выделенного из «холодовой» культуры Y pseudotuberculosis, были представлены в препаратах в виде небольших агрегатов округлой формы, их отличали от таковых Б-антигена-37 несколько меньшие средние размеры и вариабельность геометрических параметров (см. рис. 4, б, в).
Известно, что многие грамотрицательные бактерии при «глубинном» выращивании способны выделять в питательную среду дериваты наружной мембраны, OMVs (outer membrane vesicles), сферической или округлой формы размером 20-250 нм, включающие помимо мембран-связанных компонентов растворимые периплазматиче-ские белки. Физиологическая значимость OMVs состоит в целевой доставке эффекторов, обеспечивающих вы-
Рис. 4. а - везикулы (OMVs) в препарате Б-антигена-37.
Стрелкой помечены частицы коллоидного золота. б и в - агломераты везикул в препаратах Б-антигена-37 и 10 соответственно.
Трансмиссионная электронная микроскопия.
живаемость бактерий во внешней среде; они участвуют в образовании биопленок, передаче генетической информации, питании микроорганизмов и др. [17, 18].
На основании имеющихся экспериментальных данных изучения свойств Б-антигена, представленных здесь и полученных ранее [3] (иммунохимически выявляемое поверхностное расположение в микробной клетке, способность к экскреции при глубинном культивировании, электронно-микроскопическая картина, сходство с ЛПС, полученным водно-фенольным методом, по жирнокис-лотному, углеводному составам (данные не проиллюстрированы), но более высокое, по сравнению с ЛПС, содержание белка (5-8%), высокая иммунохимическая активность с МКАт к эпитопам не только полисахарид-ной, но и белковой природы), позволяют считать, что Б-антиген представляет собой OMVs - везикулы, продуцируемые клетками Y. pseudotuberculosis в культуральную жидкость. Можно также предположить, что показанная ранее эффективность активной иммунизации препаратом Б-антигена лабораторных животных в отношении экспериментальной чумы [4] определяется его белковой составляющей. Во всяком случае, это не присутствующие в препаратах Б-антигена О-боковые цепи, так как чумной микроб не способен к их образованию [15]. Маловероятно также, что защитный эффект Б-антигена определяется высококонсервативными компонентами наружной мембраны, соответствующими кору и липиду А ЛПС, поскольку препараты ЛПС, выделенные из клеток Y. pestis, не способны сообщать лабораторным животным иммунитет к чуме [2]. Однако вполне вероятно, что липополи-сахаридная составляющая Б-антигена обеспечивает пре-зентирующий, адъювантный эффект для заключенного в полость везикулы протективного белка (белков).
Таким образом, с помощью набора полученных моно-клональных антител в препаратах Б-антигена и на поверхности бактерий Y. pseudotuberculosis выявлены неидентичные эпитопы полипептидной природы, локализованные на различных участках белковой составляющей наружной мембраны. Каждый из эпитопов специфически выявляется МКАт лишь одной из 5 полученных линий. Два из них, по-видимому, являются общими для семейства энтеробактерий. Иммунохимическая активность цельных клеток Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 10 °С, в основном определяется О-боковыми цепями ЛПС, существенно экранирующими белковые детерминанты наружной мембраны. Термоиндуцибель-ных различий при ИФА препаратов Б-антигена с использованием МКАт5-8 выявлено не было. Показано, что Б-антиген Y. pseudotuberculosis представляет собой так называемые OMVs. Высказано предположение, что про-тективность Б-антигена в отношении экспериментальной чумы определяется его белковой составляющей, а в первичной презентации везикул Б-антигена иммунокомпе-тентным структурам макроорганизма принимает участие их липополисахаридный компонент.
Работа поддержана грантом Программы Президиума РАН № 5 «Фундаментальные науки - медицине» № 12-П-4-1051, а также грантом на НИР по заданию № 2014/66 на выполнение государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России.
Сведения об авторах
Бывалов Андрей Анатольевич - д-р мед.наук, проф., зав. лаб. физиологии микроорганизмов ИФ Коми НЦ УрО РАН, проф. каф. биотехнологии ВятГУ e-mail: byvalov@ nextmail.ru
Дудина Любовь Геннадьевна - мл. науч. сотр. лаб. физиологии микроорганизмов ИФ Коми НЦ УрО РАН, аспирант ВятГУ
Чернядьев Александр Вячеславович - канд. биол. наук., ст. науч.сотр. НОЦ «Нанотехнологии» ВятГУ
Конышев Илья Владимирович - мл.науч.сотр. лаб. физиологии микроорганизмов ИФ Коми НЦ УрО РАН, аспирант ВятГУ
Литвинец Сергей Геннадьевич - канд. сельскохозяйственных наук, доцент, проректор по науке и инновациям ВятГУ
Оводов Юрий Семенович [(Ovodov Yu.S.) - д-р хим. наук, акад. РАН, директор института.
ЛИТЕРАТУРА
1. Carniel E. Evolution of pathogenic Yersinia, some lights in the dark. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 3-12.
2. Titball R.W., Williamson E.D. Second and third generation plague vaccines. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 397-406.
3. Бывалов А.А., Дармов И.В., Евстигнеев В.И., Пименов Е.В. Идентификация и выделение антигена, защищающего морских свинок от экспериментальной чумы. Проблемы особо опасных инфекций. 2005; 89: 54-8.
4. Бывалов А.А., Крупин В.В., Гаврилов К.Е. Иммуногенность Б-антигена при экспериментальной чуме и псевдотуберкулезе лабораторных животных. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006; 3: 49-53.
5. Feodorova V.A., Samelija J.G., Devdariani Z.L. Heat-stable sero-group-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis. J. Med. Microbiol. 2003; 52 (5): 389-95.
6. Jain R., Tuteja U., Batra H.V. Characterization and utilization of monoclonal antibodies reactive to Yersinia pseudotuberculosis. Southeast. Asian J. Trop. Med. Publ. Hlth. 2003; 34 (4): 839-44.
7. Zhao T., Zhao P., Doyle M.P. Detection and isolation of Yersinia pestis without fraction 1 antigen by monoclonal antibody in foods and water. J. FoodProt. 2012; 75 (9): 1555-61.
8. Бывалов А.А., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Еременко Ю.Д., Лобастов В.С., Борисевич И.В. Получение и характеристика моноклональных антител к липополисахариду Yersinia pseudotuberculosis. Биотехнология. 2010; 3: 78-83.
9. Westphal O., Jan K. Bacterial lipopolysaccharides.Meth. Carbohydr. Chem. 1965; 5: 83-91.
10. Бывалов А.А., Дудина Л.Г., Литвинец С.Г., Новикова О.Д., Хо-менко В.А., Портнягина О.Ю., Оводов Ю.С. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител. Прикладная биохимия и микробиология. 2014; 50 (2): 203-10.
11. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5.
12. Tsai C.-M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrilamide gels. Analyt. Biochem. 1982; 119 (1): 115-9.
13. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained poly-acrylamide gels. J. Bacteriol. 1983; 154 (1): 269-77.
14. Skurnik M. Molecular genetics, biochemistry and biological role of Yersinia lipopolysaccharide. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 187-97.
15. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. Characterization of the O-antigen gene clusters of Yersinia pseudotuberculosis and the cryptic O-anti-gen gene cluster of Yersinia pestis shows that the plague bacillus is most closely related to and has evolved from Y pseudotuberculosis serotype O:1b. Mol. Microbiol. 2000; 37 (2): 316-30.
16. Lu Q., Wang J., Faghihnejad A., Zeng H., Liu Y. Understanding the molecular interactions of lipopolysaccharides during E. coli initial adhesion with a surface forces apparatus. Soft Matter. 2011; 20: 1-15.
17. Kulp A., Kuehn M. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 163-84.
18. Murphy K., Park A.J., Hao Y., Brewer D. Influence of lipopolysaccharides on biofilm development and outer membrane vesicles biogenesis Pseudomonas aerugenosa PAO1. J. Bacteriol. 2014; 196: 1306-17.
Поступила 03.07.14
REFERENCES
1. Carniel E. Evolution of pathogenic Yersinia, some lights in the dark. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 3-12.
2. Titball R.W., Williamson E.D. Second and third generation plague vaccines. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 397-406.
3. Byvalov A.A., Darmov I.V., Yevstigneev V.I., Pimenov E.V. Identification and isolation of the antigen, protecting guinea pigs from experimental plague infection. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2005; 89: 54-8. (in Russian)
4. Byvalov A.A. Krupin V.V., Gavrilov K.E. Immunogenecity of B-antigen in experimental plague and pseudotuberculosis. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, immunologii. 2006; 3: 49-53. (in Russian)
5. Feodorova V.A., Samelija J.G., Devdariani Z.L. Heat-stable serogroup-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis. J. Med. Microbiol. 2003; 52 (5): 389-95.
6. Jain R., Tuteja U., Batra H.V. Characterization and utilization of monoclonal antibodies reactive to Yersinia pseudotuberculosis. Southeast. Asian J. Trop. Med. Publ. Hlth. 2003; 34 (4): 839-44.
7. Zhao T., Zhao P., Doyle M.P. Detection and isolation of Yersinia pestis without fraction 1 antigen by monoclonal antibody in foods and water. J. FoodProt. 2012; 75 (9): 1555-61.
8. Byvalov A.A., Elagin G.D., Pechenkin D.V., Eremenko Yu.D., Lobastov V.C., Borisevich I.V. Obtaining and characterization of monoclonal antibodies to Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide. Biotekhnologiya. 2010; 3: 78 - 83.
9. Westphal O., Jan K. Bacterial lipopolysaccharides.Meth. Carbohydr. Chem. 1965; 5: 83-91.
10. Byvalov A.A., Dudina L.G., Litvinets S.G., Novikova O.D., Khomenko V.A., Portnyagina O.Yu., Ovodov Yu. S. Study of Yersinia pseudotuberculosis surface antigen epitopes using monoclonal antibodies. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2014; 50 (2): 203-10. (in Russian)
11. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5.
12. Tsai C.-M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrilamide gels. Analyt. Biochem. 1982; 119 (1): 115-9.
13. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 1983; 154 (1): 269-77.
14. Skurnik M. Molecular genetics, biochemistry and biological role
© СУ УДК
Сфингомиелинсинтаза 1 (SMS1) катализирует биосинтез сфин-гомиелина в эукариотических клетках. Ранее нами была определена структура гена SGMS1 человека, кодирующего данный белок, и ряда его альтернативных транскриптов, показана их тканеспецифическая экспрессия. Исследование уровня экспрессии белка sMs1 в тканях человека путем иммуноблоттинга экстрактов тканей, полученных в RIPA (Radio ImmunoPrecipitation Assay) буфере, выявило слабый сигнал в экстрактах коры почки, семенников, легкого и не детектировало sMs1 в экстрактах плаценты и лимфатического узла. В данной работе разработан новый метод получения белкового экстракта тканей, обогащенного SMS1, путем последовательной экстракции буфером, содержащим сапонин Quillaja saponaria в концентрациях 0,05 и 1 мг/мл, который позволил детектировать SMS1 во всех тестированных тканях. Сапониновый экстракт коры почки содержит примерно в 12 раз больше SMS1, чем экстракт, полученный в RIPA буфере.
Ключевые слова: сфингомиелинсинтаза 1; сапонин; им-муноблоттинг.
of Yersinia lipopolysaccharide. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 187-97.
15. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. Characterization of the O-antigen gene clusters of Yersinia pseudotuberculosis and the cryptic O-antigen gene cluster of Yersinia pestis shows that the plague bacillus is most closely related to and has evolved from Y. pseudotuberculosis serotype O:1b. Mol. Microbiol. 2000; 37 (2): 316-30.
16. Lu Q., Wang J., Faghihnejad A., Zeng H., Liu Y. Understanding the molecular interactions of lipopolysaccharides during E. coli initial adhesion with a surface forces apparatus. Soft Matter. 2011; 20: 1-15.
17. Kulp A., Kuehn M. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 163-84.
18. Murphy K., Park A.J., Hao Y., Brewer D. Influence of lipopolysaccharides on biofilm development and outer membrane vesicles biogenesis Pseudomonas aerugenosa PAO1. J. Bacteriol. 2014; 196: 1306-17.
Received 03.07.14
IMMUNOCHEMICAL ACTIVITY OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS B-ANTIGEN
A. A. Byvalov1,2, L. G. Dudina1,2, A. V. Chernyad'ev', I. V. Konyshev1,2, S. G. Litvinets1, \Yu. S. Ovodov2
1 Vyatka State University, Kirov, Russia; institute of Physiology, Komi Scientific Center, Urals Branch, Russian Academy of Sciences, Syktyvkar, Russia
A hybridoma panel producing monoclonal antibodies to immuno-chemically non-identical antigenic epitopes of the protein nature located in outer membrane of Yersinia pseudotuberculosis was obtained. It was revealed that the previously identified B-antigen protecting laboratory animals from experimental plague was detected using both monoclonal antibodies against mentioned protein determinants and the determinants of lipopolysaccharide O-side chains. The B-antigen is a component of the Y. pseudotuberculosis outer membrane, egested in the form of the vesicles (OMVs) by bacteria cultivated in fluid nutrient medium.
Key words: Yersinia pseudotuberculosis, B-antigen, lipopolysaccharide, monoclonal antibodies, antigenic epitopes.
Сфингомиелинсинтаза 1 (фосфатидилхолин:церамид холинфосфотраснфераза 1, SMS1) человека катализирует биосинтез фосфолипида сфингомиелина путем обратимого переноса фосфохолина с фосфатидилхолина на це-рамид с образованием сфингомиелина и диацилглицерола [1]. Сфингомиелинсинтазная ферментативная активность была известна достаточно давно [2], но соответствующий белок долгие годы не был выделен. Поиск белков, обладающих ферментативной активностью SMS, позволил двум независимым группам исследователей идентифицировать клоны кДНК, содержащие открытую рамку считывания, кодирующую белки с одинаковой ферментной активностью, обозначенные как SMS1 и SMS2 [3, 4]. В экспериментах in silico была определена предполагаемая аминокислотная последовательность обоих белков. Сфингомиелинсинтаза 1 (SMS1) локализуется в мембра-
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАРКИНА О.Ю., ДЕРГУНОВА Л.В., 2015 612.46.014.1.083.3
Сударкина О.Ю., Дергунова Л.В.
получение белкового экстракта тканей человека, обогащенного
сфингомиелинсинтазой 1
ФГБУ науки Институт молекулярной генетики РАН, 123182, г. Москва
