CC BY
14УДК 57.083.18:579.832
О.В. Евдокимова, В.Е. Мямин, Л.Н. Валентович
ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS С ПОМОщЬю
ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР
ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220141, г. Минск, ул. акад. В.Ф. Купревича, 2
Разработан метод идентификации бактерий Bacillus pumilus на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий быстро детектировать данные микроорганизмы, в том числе в почвенных образцах. Сконструированы две пары видоспецифичных праймеров, дающие ампликоны размером 1149 и 553 п.н., соответственно. Специфичность праймеров протестировали на 7 коллекционных штаммах и 27 изолятах, выделенных из пораженных растений. Продукт ПЦР был получен только при использовании ДНК бактерий B. pumilus в качестве матрицы. Результаты показали, что ПЦР с разработанными праймерами обеспечивает быстрый, простой и надежный метод обнаружения и идентификации B. pumilus.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, ПЦР, праймеры.
Введение
Грамположительные, аэробные, образующие эндоспоры бактерии Bacillus pumilus широко распространены в окружающей среде, и на основании филогенетического анализа строения гена 16S рРНК принадлежат к группе Bacillus subtilis [1]. Как и большинство представителей этой группы, B. pumilus имеют важное промышленное значение, т.к. являются продуцентами ферментов [2-4], биосурфактантов [5], метаболитов c антибактериальной активностью [6, 7]. Большой интерес представляют штаммы B. pumilus, которые потенциально могут использоваться как стимуляторы роста растений [8, 9], деструкторы широкого спектра углеводородов в процессах очистки промышленных сточных вод [2], для создания пробиотических препаратов [10]. Однако выяснилось, что данные микроорганизмы могут обладать и патогенными свойствами. В клинической практике зафиксировано несколько случаев развития инфекционных заболеваний, вызванных бактериями B. pumilus, у пациентов с ослабленной иммунной системой [11-13]. Есть сведения, что некоторые штаммы B. pumilus способны вызывать заболевания у растений: выявлены случаи заражения растений манго в Египте [14], листьев, побегов груши [15] и корневищ имбиря в Китае [16], листьев фасоли в Испании [17], плодов фруктовых деревьев в Турции [18], клубней картофеля в Мали [19]. Фитопа-
тогенные штаммы B. pumilus обнаруживают и на территории Беларуси. Так, за последние годы были выделены и идентифицированы более 30 культур B. pumilus из пораженных клубней картофеля [20], растений сосны обыкновенной [21], растений огурца и томата. В связи с этим становится актуальной необходимость разработки точных, надежных и быстрых методов обнаружения бактерий B. pumilus.
В большинстве случаев идентификация бактерий B. pumilus осуществляется на основании физиолого-биохимических тестов в совокупности с секвенированием последовательности рибосомных генов [14, 16, 17] или анализом профиля метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) [14, 18]. Методики на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) являются альтернативой классическим микробиологическим методам, а ПЦР с видоспецифичными праймерами по специфичности, чувствительности, быстроте проведения анализа превосходит МЭЖК и, когда дело касается близкородственных видов с небольшой степенью вариабельности строения гена 16S рРНК, становится предпочтительнее секвенирова-ния [22]. Доступность баз данных, хранящих информацию о структуре генов различных организмов, дает возможность при разработке видоспецифичных праймеров наиболее полно учитывать и использовать вариабельность анализируемых последовательностей
нуклеотидов, что позволяет обеспечить высокую специфичность диагностических систем, создаваемых на их основе [23].
Целью настоящей работы являлось создание видоспецифичных праймеров для выявления и идентификации бактерий B. pumilus методом ПЦР.
Материалы и методы
В работе использовали изоляты бактерий B. pumilus, выделенные из пораженных растений на территории Беларуси и коллекционные штаммы B. pumilus из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (табл. 1).
Таблица 1
Штаммы бактерий B. pumilus, использованные в работе
Штамм Источник выделения Место выделения
19.6 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Эмоушен» КСУП «Светлогорская овощная фабрика», Светлогорский район, Гомельская область
36.2 Растения огурца (Cucumis sativus) сорт «Кураж» УП ПТКУП «Минский парниково-тепличный комбинат», Минский район, Минская область
39.2 39.3 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Раиса» УКАП Фирма «Днепр», Могилевский район, Могилевская область
32.8 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Бомакс»»
44.2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Раиса»
37.7 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Раиса» ЧУП «Озерицкий - Агро», Смолевичский район, Минская область
38.2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Зук»
51.2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Раиса»
40.2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Старбак» КУП «Минская овощная фабрика», Минский район, Минская область
41.2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Раиса»
61.2 61.3 T1 Т2 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Жеронимо»
33.4 33.5 Растения томата (Solanum lycopersicum) сорт «Барселона» РУП «Витебскэнерго филиал «Весна - энерго», Полоцкий район, Витебская область
11-1-1* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Зарница» Бобруйский район, Могилевская область
33-3* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Журавинка» РУП «Институт защиты растений», Минский район, Минская область
21-3* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Янка»
17-2* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Выток» РСДУП «Экспериментальная база Зазерье», Пуховичский район, Минская область
6-5-2* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Здабытак»
Продолжение табл. 1
Штамм Источник выделения Место выделения
63-1-3* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Бриз» РУСП «Экспериментальная база Натальевск», Червеньский район, Минская область
63-2-2*
65-4* Клубни картофеля (Solanum tuberosum) сорт «Атлант» РУСП «Экспериментальная база Дашковка», Могилевский район, Могилевская область
43-3-1* Неизвестно Личное подсобное хозяйство д. Туры, Сталинский район, Брестская область
71-4-1* Неизвестно Неизвестно
БИМ В-106 Не указано Получен из ИБФМ, г. Пущино, Россия
БИМ В-171 Дерново-подзолистая почва Полесский государственный радиационно-экологический заповедник, д. Кулажин, Гомельская область
БИМ В-211 Почва березового леса Полесский государственный радиационно-экологический заповедник, д. Лесок, Гомельская область
БИМ В-369 Дерново-подзолистая почва Полесский государственный радиационно-экологический заповедник, Гомельская область
БИМ В-373 Дерново-подзолистая почва Прилукский заказник, Минский район, Минская область
БИМ В-401 Садово-огородная почва
БИМ В-394 Дерново-подзолистая почва д. Соколище, Россонский район, Витебская область
* - штаммы предоставлены сотрудниками кафедры микробиологии Белорусского государственного университета.
Бактериальные культуры выращивали на поверхности агаризованной полноценной среды LB при температуре 30 °С. Геномную ДНК бактерий выделяли с помощью набора реагентов Bacteria DNA Preparation Kit (Jena Bioscience GmbH) согласно инструкции производителя или методом с использованием ЦТАБ [24]. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на приборе MiSeq (Illumina) с использованием комплекта реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina). Полногеномные последовательности бактерий B. pumilus заимствовали из представленных в свободном доступе нуклеотидных последовательностей базы данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI) США. Множественное выравнивание полногеномных последовательностей осуществляли с помощью программы Mauve 20150226 (http://gel.ahabs.wisc. edu/mauve/) [25], для выравнивания отдельных кодирующих последовательностей при подборе праймеров использовали программу ClustalX 2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) [26]. Подбор праймеров проводили вручную,
термодинамические параметры олигонуклео-тидов и возможность образования вторичных структур анализировали с помощью программы ОлигоКальк (http://www.bio.bsu.by/ molbiol/oligocalc.html) [27].
Для постановки ПЦР использовали реактивы и праймеры производства ОДО «Прайм-тех». ПЦР проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей АМ-буфер с MgCl2, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,4 мкМ праймеров, 1 ед. Taq-полимеразы, ДНК-матрицу. В отрицательный контроль ДНК-матрицы не добавляли. Для проверки праймеров на специфичность использовали препараты тотальной ДНК бактерий Escherichia coli XL1-Blue, Bacillus thuringiensis 787, Bacillus amyloliquefaciens I22, Bacillus subtilis 72, B. thuringiensis 5081, Shewanella baltica, Xanthomonas campestris, Pseudomonas lun-densis, Pectobacterium sp. из рабочей коллекции лаборатории «Центр аналитических и генно-инженерных исследований» Института микробиологии НАН Беларуси. В качестве положительного контроля ПЦР при проверке матриц ДНК использовали универ-
сальные праймеры к гену 16S рРНК прокариот - 8F (5' agagtttgatcctggctcag-3') и 1492R (5'-ggttaccttgttacgactt-3') [28].
Оптимальную температуру отжига сконструированных видоспецифичных праймеров определяли экспериментально постановкой ПЦР с градиентом температур 45-55 °С. Оптимизированный протокол амплификации для праймеров bp1K-F и bplKR включает следующие стадии: начальная денатурация - 3 мин при 95 °С; 35 циклов (денатурация - 30 с при 95 °С, отжиг праймеров - 30 с при 52 °С, элонгация - 1 мин 10 с при 72 °С) и заключительная элонгация - 5 мин при 72 °С. Амплификацию с праймерами bp05K-F и bp05K-R проводили по аналогичному протоколу, за исключением температуры отжига (49 °С) и длительности элонгации внутри цикла (40 с). ПЦР проводили в амплификаторе Т100 ThermoCycler (Bio-Rad). Разделение продуктов амплификации проводили путем горизонтального электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) с использованием ТАЕ-буфера. Для документирования результатов электрофореза применяли систему цифровой визуализации изображения ChemiDoc MP (BioRad). Размер фрагментов ДНК устанавливали на основании их электрофоретической подвижности в ага-розном геле, в качестве маркера молекулярного веса ДНК использовали GeneRuler™ DNA Ladder Mix (ThermoScientificBio).
Результаты и обсуждение
При постановке специфичной ПЦР необходимо иметь положительный контроль - ДНК целевого организма. В нашем распоряжении имелись коллекционные штаммы B. pumilus, однако они не подвергались молекулярно-генетической реидентификации и не могли служить гарантированным положительным контролем. Секве-нирование последовательностей рибосомных генов 16S рРНК, 23S рРНК и участков внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) широко применяется для идентификации бактерий [29]. Поэтому на начальном этапе работы нами были определены нуклеотидные последовательности генов рРНК и ряда других диагностически важных локусов изолятов 11-1-1 и 63-2-2, отнесенных по физиолого-биохимическим свойствам к виду B. pumilus. Полученные последовательности сравнили с записями из базы данных
GenBank с помощью программы BLAST [23] и установили, что они идентичны на 99-100% с представленными в GenBank нуклеотидны-ми последовательностями бактерий B. pumilus. Также было выявлено, что некоторые штаммы родственных видов рода Bacillus и даже других родов имеют очень схожее строение гена 16S рРНК: последовательности Bacillus strato-sphericus B89 и JN179 (код доступа GenBank LN890265.1 и KF687090.1) имеют 100%-ную идентичность с последовательностями изолятов 11-1-1 и 63-2-2; Geobacillus stearothermophilus PPL-SSC5 (KM226938.1), B. xiamenensisMCCC 1A00008 (JX680066.1), B. altitudinis Asd M5-2B (FM955870.1), B. aerophilus 20E (KC329821.1) -99%. Результаты секвенирования в совокупности с физиолого-биохимической характеристикой изолятов 11-1-1 и 63-2-2 позволили подтвердить их принадлежность к виду B. pumi-lus, и в дальнейшей работе обе ДНК-матрицы использовали в качестве положительного контроля при постановке ПЦР. Однако данный способ идентификации (секвенирование последовательностей) довольно трудоемкий, и при определении некоторых близкородственных представителей рода Bacillus на видовом уровне только по строению гена 16S рРНК могут возникать трудности из-за высокого сходства последовательностей.
Следующим этапом работы стал подбор видоспецифичных олигонуклеотидов для разработки экспресс-метода ПЦР-детекции бактерий B. pumilus. На данный момент опубликована информация об одной паре прай-меров, специфичных к гену целлюлазы бактерий B. pumilus; получаемый ампликон имеет размер -1500 п.н. [30]. При разработке собственных оригинальных праймеров мы руководствовались следующими критериями: размер ампликона не должен значительно превышать 1000 п.н., т.к. небольшой размер получаемого продукта позволяет сократить время амплификации, в то же время, получаемый размер ПЦР-продукта должен быть не менее 150 п.н. для удобства при электрофоре-тическом методе детекции. Также учитывали возможность использования разрабатываемых праймеров в мультиплексной ПЦР со специфичными праймерами к другим возбудителям бактериозов растений [31] или с универсальными праймерами к прокариотам [28].
Одним из наиболее важных этапов при разработке высокоспецифичных праймеров является выбор участков хромосомной ДНК, практически одинаковых у всех бактерий одного вида и обладающих низким уровнем сходства с близкородственными видами. Для поиска таких локусов у B. pumilus использовали геномные последовательности 8 штаммов данного вида, находящиеся в открытом доступе в базе данных GenBank (табл. 2). Выравнивание геномов проводили в программе Mauve 20150226 [25], которая сопоставляет схожие области в анализируемых геномах и визуализирует их как одинаково окрашенные локальные блоки. Программа также отображает степень вариабельности нуклео-тидной последовательности на гомологичном участке цепи ДНК. На основании компьютерного анализа были выбраны несколько рамок
считывания, нуклеотидные последовательности которых относительно консервативны у сравниваемых штаммов B. pumilus.
По результатам сравнения выбранных ну-клеотидных последовательностей с записями из базы данных GenBank в качестве мишеней для подбора специфических праймеров решено было использовать две кодирующие последовательности: ГО12_10475 длиной 1475 п.н., кодирующая белок СгИ - фитоин-дегидрогеназу, и ГО12_08725 длиной 1758 п.н., кодирующая белок, содержащий WD-домен (номера кодирующих последовательностей указаны для генома B. pumilus GR-8). Эти участки хромосомной ДНК присутствуют во всех депонированных в GenBank геномах бактерий B. pumilus и имеют низкие значения сходства с последовательностями других видов (табл. 3, 4).
Таблица 2
Геномы, использованные для выравнивания в программе Mauve
Штамм Длина генома, п.н. Код доступа в GenBank
Bacillus pumilus MTCC B6033 3 763 493 CP007436.1
Bacillus pumilus GR-8 3 674 849 CP009108.1
Bacillus pumilus W3 3 745 123 CP011150.1
Bacillus pumilus TUAT1 3 723 433 AP014928.1
Bacillus pumilus NJ-V2 3 787 818 CP012482.1
Bacillus pumilus NJ-M2 3 793 419 CP012329.1
Bacillus pumilus SAFR-032 3 704 641 CP000813.4
Bacillus pumilus SH-B11 3 860 091 CP010997.1
Штамм Покрытие, % Ошибка Степень идентичности, % Код доступа
Bacillus pumilus GR-8 100 0 100 CP009108.1
Bacillus pumilus C4 100 0 99 CP011109.1
Bacillus pumilus ku-bf1 100 0 99 CP014165.1
Bacillus pumilus TUAT1 100 0 99 AP014928.1
Bacillus pumilus SH-B11 100 0 99 CP010997.1
Bacillus pumilus MTCC B6033 100 0 99 CP007436.1
Bacillus pumilus NJ-V 100 0 99 CP012330.1
Bacillus pumilus NJ-V2 100 0 99 CP012482.1
Bacillus pumilus NJ-M2 100 0 99 CP012329.1
Таблица 3
Результаты сравнения кодирующей последовательности ГО12_10475 с нуклеотидными последовательностями базы данных GenBank
Продолжение табл. 3
Штамм Покрытие, % Ошибка Степень идентичности, % Код доступа
Bacillus pumilus W3 100 0 99 СР011150.1
Bacillus pumilus PDSLzg-1 100 0 88 СР016784.1
Bacillus sp. WP8 100 0 88 СР010075.1
Bacillus pumilus SH-B9 100 0 86 СР011007.1
Bacillus pumilus SAFR-032 100 0 86 СР000813.4
Fictibacillusphosphorivorans G25-29 56 1e-28 67 СР015378.1
Bacillus megaterium Q3 74 1e-27 67 СР010586.1
Bacillus sp. IHB B 7164 51 7e-25 67 СР015226.1
Таблица 4
Результаты сравнения кодирующей последовательности ГО12_08725 с нуклеотидными последовательностями базы данных GenBank
Штамм Покрытие, % Ошибка Степень идентичности, % Код доступа
Bacillus pumilus GR-8 100 0 100 СР009108.1
Bacillus pumilus W3 100 0 99 СР011150.1
Bacillus pumilus TUAT1 100 0 99 АР014928.1
Bacillus pumilus ku-bf1 100 0 99 СР014165.1
Bacillus pumilus SH-B11 100 0 99 СР010997.1
Bacillus pumilus MTCC B6033 100 0 99 СР007436.1
Bacillus pumilus C4 100 0 99 СР011109.1
Bacillus pumilus NJ-V 100 0 99 СР012330.1
Bacillus pumilus NJ-V2 100 0 99 СР012482.1
Bacillus pumilus NJ-M2 100 0 99 СР012329.1
Bacillus pumilus PDSLzg-1 100 0 88 СР016784.1
Bacillus sp. WP8 100 0 88 СР010075.1
Bacillus pumilus SH-B9 100 0 87 СР011007.1
Bacillus pumilus SAFR-032 100 0 87 СР000813.4
Megamonas hypermegale ART12/1 2 0,67 84 FP929048.1
Nippostrongylus brasiliensis NBR scaffold0001863 1 2,3 100 LM435297.1
Hymenolepis diminuta HDID scaffold0000213 2 2,3 87 LM383746.1
Из табл. 3 и 4 видно, что уровень внутривидового сходства последовательностей ло-кусов ГО12_10475 и ГО12_08725 составляет 86-99% и 84-99%, соответственно, а область покрытия - 100%, что, с учетом длины анализируемых фрагментов, предполагает наличие достаточно продолжительных консервативных участков, подходящих для кон-
струирования прямого и обратного прайме-ров, фланкирующих участок ДНК длиной не менее 500 нуклеотидов. Для поиска районов, пригодных для конструирования видоспе-цифичных праймеров, последовательности аналогичных локусов 14 штаммов B. pumilus выравнивали с использованием программы С^а1Х 2.1.
W3_VT48_052 80 GR-8_ID12_10475 MTCCB6 03 3BW1S05800 ku-bfl_ASM07 04990 SH-B11_UP15_05465 C4_VP59 04720 HJ-V2_AMR71_14570 NJ-M2 AX06S182 55 UJ-V_AK066_14575 TUAT1 BTDAT1 10260 SAFK-32 BPUM^04115 SH-B9UP1205410 PDSLzq-l_BEN31_10600 WP8_QR42_05215
Primers
AAAATGAA GG T GG GGGAGj TTG TTTTGT . GTGAGAAAGGA.TATAAA AAAATGAA GG Г № GGGAGA TTG TTTTGT.V. GTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG T GG GGGAGA TTG TTTTGTA GTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG T GG GGGAGA :TTG TTTTGTACGTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG T GG GGGAGA TTG TTTTGTACGTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG-T GG .'GGGAGA TTG TTTTGTA GTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG . T GG GGGAGA .'TTG TTTTGTA GTGAGAAAGOATATAAA AAAATGAA GG T GG GGGAGA TTG TTTTGTA' GTQAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GGCTCGG CGGGAGAOTTG TTTTGTA GTGAGAAAGGATATAAA i AAAATGAA GGCT GG GGGAGA TTG TTTTGT ACGTGA GAAAGGA TA TAAA AAAACGAG.G/i TTGG GGAAGA TTG TTTTGTACGTGÄGAAAGGATATAAA AAAATGAA GA:TTGGCGGAAGA TTG TTTTGTA GTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAGCGÄCTTGGCGGAAGACTTGCTTTTGTACGTGAGAAAGGATATAAA AAAATGAA GG TTGG.GGGAGA TTG TTTTGTACGTGAGAAAGGATATAAA .....................GACTTGCTTTTGTACGTGAG------------
GAG; . A GAATGATT AATGCGAGAAGGATTGTTTGAAGG GG GAGAACACCGAATGATT AATGCeAGAAaOATTGTTrGAAGG GG GAGAACAC GAATGATT AATGi GAGAAGGATTGITTG' -GG GG GAGAACAC GAATGATT: AATG- GAGAAGGATTGTTTGAAGG GG GAGAACAC GAATGATT AATQCGAGÄAGGGTTGTTTGAAGG GG GAGAACACCGAATGATT AATaCGAGAAGGATTGTTTGAAGG GG GAGAACACCGAATGATTCÄATG -GAŒAAGGATTGTTTGJ GG GG GAGAACACCGAATGATT: AATO GAGAAGGATTGTTTQA AGG GG'l ■ • GAGAACACCGAATGATT AATGCGAGAAGGATTGTTTGAAGG GG OAOAACACCGAATGATTCAATGCGAG GG TTGTTTG GG GG CAGAACACCAAATGATT. CTTGCGAGAAGGATTGITTGAAGG GG GAGAACAC : AAATGATT TTG GGG-'.-' GGGTTGTTTGAAGG GG CAGAACAC AAATGATT CTTGCGAGAAGGATTGTTTGAAGGCGG СAGGACACCAAATGATT" TG GAGAAGGATTGTTTGAAGG GG ---------------------G .'GAGAAGGATTGTTTGAAG-----
100.
.110.
. 120.
.13 0.
.140.
. 150
1230......1240......1250......1250.
.1270..
Рис. 1. Расположение пары праймеров Ьр1К-Р и Ьр1К-Я на участках локуса ГО12_10475 и гомологичных
последовательностях штаммов Б. pumilus
Рис. 2. Расположение пары праймеров Ьр05К-Р и Ьр05К-Я на участках локуса ГО12_08725 и гомологичных
последовательностях штаммов Б. ритИш'
Были выявлены консервативные участки, которые по своим параметрам (ГЦ-состав, расположение, длина) подходили для подбора праймеров. На рис. 1 представлены области расположения прямого и обратного праймеров bp1K на последовательности гена, кодирующего фитоин-дегидрогеназу. Регион, фланкированный bp1K-F (5'-gacttgcttttgtacgtgag-3') и bp1K-R (5'-cttcaaacaatccttctcgc-3'), составляет 1109 нуклеотидов. Оба праймера содержат 45% ГЦ-нуклеотидов и имеют температуру плавления 55 °С (по данным программы Primer-BLAST). На участке локуса ID 12_08725 была подобрана пара олигонуклеотидов bp05K (5 '-aaacgtattgtgaatggtc-3 ') в качестве прямого и (5 '-tcatttaacagctctgtcg-3 ') в качестве обратного праймеров, окаймляющие регион длиной 515 нуклеотидов (рис. 2). ГЦ-состав прямого и обратного праймеров составляет 36,8% и 42,1%, соответственно, разница в температуре плавления не более 1,8 °С (по данным программы Primer-BLAST). Предварительный анализ специфичности праймеров bp1K и bp05K in silico с помощью Primer-BLAST показал наличие продуктов амплификации только с хромосомными ДНК различных штаммов B. pumilus.
Сконструированные праймеры были проверены на специфичность с использованием образцов ДНК коллекционного штамма B. pumilus БИМ B-106, идентифицированного на основании анализа нуклеотидных последовательностей B. pumilus 11-1-1, а также изолятов 6-5-2, 17-2, 21-3 и 33-3, отнесенных к виду B. pumilus по совокупности физиолого-биохимических характеристик. Обе пары праймеров позволили получить хорошо детектируемое количество ПЦР-продукта, размер полученных ампликонов соответствовал ожидаемому, неспецифические продукты реакции отсутствовали (рис. 3).
Специфичность сконструированных прай-меров дополнительно была подтверждена при использовании образцов ДНК близкородственных видов бактерий рода Bacillus и представителей других родов (рис. 4). В данных экспериментах вводили дополнительный положительный контроль - ПЦР с универсальными праймерами к гену 16S рРНК, позволяющий подтвердить пригодность используемой матрицы ДНК для полимеразной реакции.
Номера лунок соответствуют штаммам: 1, 9 - B. pumilus 111-1; 2, 10 - B. pumilus 6-5-2; 3; 11 - B. pumilus 17-2; 4, 12 -B. pumilus 21-3; 5, 13 - B. pumilus 33-3; 6, 14 - B. pumilus В106; 8 - маркер молекулярного веса ДНК; 7, 15 - отрицательный контроль
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с применением праймеров bp1K-F и bp1K-R (1-7)
и bp05K-F и bp05K-R (9-15) и ДНК бактерий B. pumilus
1 Z 3 4 5 6 7 6 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 19
1-3 - B. pumilus 11-1-1; 4-6 - отрицательный контроль; 7-9 - B. thuringiensis 787; 11-13 - B. amyloliquefaciens I22; 14-16 - B. subtilis 72; 17-19 - B. thuringiensis 5081; 2022 - Shewanella baltica; 23-25 - Xanthomonas campestris; 26-28 - Pseudomonas lundensis; 30-32 - Pectobacterium sp.; 10, 29 - маркер молекулярного веса ДНК; 1, 4, 7, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 30 - праймеры bp1K-F и bp1K-R; 2, 5, 8, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 31 - праймеры bp05K-F и bp05K; 3, 6, 9, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 32 - праймеры 8f и 1492r
Рис. 4. Электрофореграммы продуктов ПЦР, полученные с использованием праймеров bp1K и bp05K и ДНК
бактерий разных видов
Из рис. 4 видно, что продукты ПЦР с разработанными парами праймеров Ьр1К и Ьр05К были получены только при использовании в качестве матрицы ДНК В. ритПш, в то время как продукт амплификации гена 16S рРНК присутствовал в ПЦР смеси с ДНК-матрицами каждого обазца.
На следующем этапе работы с помощью сконструированных видоспецифичных прай-меров была подтверждена таксономическая принадлежность 27 бактериальных культур, выделенных из пораженных бактериозом растений, и 7 коллекционных штаммов, отнесенных на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков к виду В. ритПт (пример электрофореграммы - на рис. 5).
На заключительном этапе работы сконструированные праймеры были проверены на способность выявлять присутствие бактерий B. pumilus в природных образцах. Известно, что представители рода Bacillus являются преобладающими почвенными бактериями благодаря способности формировать устойчивые эндоспоры [32]. В связи с этим, вероятность обнаружить B. pumilus в почве представлялась нам достаточно высокой. Для проверки этого предположения использовали 5 метагеномных препаратов ДНК, выделенных из образцов по-чвогрунта, собранного в различных районах г. Минска (№ 1 с территории Института микробиологии НАН Беларуси, № 2 с парковой территории Театра оперы и балета, № 3 с дворовой
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1, 2 - БИМ В-106; 5, 6 - БИМ В-171; 7, 8 - БИМ В-211; 9, 10 - БИМ В-369; 11, 12 - БИМ В-373; 13, 14 - БИМ В-394; 15, 16 - БИМ В-401; 17,18 - 43-3-1; 19, 20 - 63-1-3; 21, 22 - 63-2-2; 23, 24 - 65-4; 25, 26 - 71-4-1; 3, 4 -отрицательный контроль; М - маркер молекулярного веса ДНК; праймеры bp1K-F и bp1K-R - нечетные лунки,
праймеры bp05K-F и bp05K - четные лунки Рис. 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами Ьр1К и bp05K на матрицах ДНК бактерий B. pumilus
Дорожки 1-11 - праймеры bp05K; дорожки 12-20 - bp1K; номера соответствуют: 1, 12 - препарат ДНК, выделенный из образца почвы № 1; 2, 13 - препарат ДНК, выделенный из образца почвы № 2; 3, 14 - препарат ДНК, выделенный из образца почвы № 3; 4, 15 - препарат ДНК, выделенный из образца почвы № 4; 5, 16 - препарат ДНК, выделенный из образца почвы № 5; 6, 17 - смесь ДНК Escherichia coli, Pseudomonas sp., Shewanella baltica, B. subtilis; 7, 18 - смесь ДНК E. coli, Pseudomonas sp., Sh. baltica, B. subtilis, B. pumilus; 8,10, 19 - отрицательный
контроль; 9, 11, 20 - ДНК B. pumilus Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами bp№ и bp05K
территории по ул. Народная, № 5 с территории Московского кладбища) и г. Клецка (образец № 4). В качестве дополнительных контролей в этом эксперименте использовали смесь нуклеиновых кислот, искусственно созданную из препаратов ДНК, выделенных из чистых бактериальных культур, при этом в один вариант смеси вносили ДНК В. ритИш, а во второй -нет. Целевые продукты ПЦР были обнаружены в 4 из 5 препаратов ДНК, выделенных из почвы, а также в смеси ДНК с добавлением ДНК В. ритИш (рис. 6). Было выявлено, что в ходе ПЦР с метагеномной ДНК могут образовываться неспецифические продукты амплификации, однако такие продукты легко отличимы от целевых по электрофоретической подвижности.
Заключение
Сконструированы две пары праймеров Ьр1К и Ьр05К, видоспецифичных для бактерий B. pumilus. Специфичность разработанных праймеров подтверждена тестированием in silico с использованием доступных геномных последовательностей B. pumilus, а также экспериментально с использованием образцов ДНК чистых культур B. pumilus и других, в том числе близкородственных, видов бактерий и образцов метагеномной ДНК, выделенной из почвы. Сконструированные праймеры могут быть использованы для идентификации бактерий B. pumilus и для их экспресс-детекции в природных образцах.
Авторы выражают благодарность ассистенту кафедры микробиологии биологического факультета БГУКомар Е.И. за предоставленные штаммы бактерий B. pumilus, а также м.н.с. лаборатории «ЦАГИИ» Института микробиологии НАНБеларуси Сацункевич Н.Е. за разрешение использовать препараты тотальной ДНК, выделенные из образцов почвы.
Список использованных источников
1. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives / R. Berkeley [et al.] - Blackwell Science Ltd, 2008. - P. 133.
2. Efficient secretory production of CotA-laccase and its application in the decolorization and detoxification of industrial textile wastewater / Z.-B. Guan [et al.] // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. - 2015. - Vol. 22, N 12 - P. 9515-9523.
3. Balasubramanian, N. Bacillus pumilus S124A carboxymethyl cellulase; a thermo stable enzyme with a wide substrate spectrum utility / N. Balasubramanian, N. Simôes // Int. J. Biol. Macromol. - 2014. - Vol. 67 - P. 132-139.
4. Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease with dehair-ing function from Bacillus pumilus / Q. Huang [et al.] // Curr. Microbiol. - 2003. - Vol. 46, N 3 - P. 169-173.
5. De Oliveira, J.G. Properties of a biosur-factant produced by Bacillus pumilus using vinasse and waste frying oil as alternative carbon sources / J.G. de Oliveira, C.H. Garcia-Cruz // Braz. Arch. Biol. Technol. - 2013. - Vol. 56, N 1 - P. 155-160.
6. Aunpad, R. Pumilicin 4, a novel bacteriocin with anti-MRSA and anti-VRE activity produced by newly isolated bacteria Bacillus pumilus strain WAPB4 / R. Aunpad, K. Na-Bangchang // Curr. Microbiol. - 2007. - Vol. 55, N 4 - P. 308-313.
7. Antibacterial metabolites and bacteriolytic enzymes produced by Bacillus pumilus during bacteriolysis of Arthrobacter citreus / C. Brack [et al.] // Mar. Biotechnol. N.Y.N. - 2015. -Vol. 17, N 3 - P. 290-304.
8. Plant growth-promoting rhizobacteria inoculation to enhance vegetative growth, nitrogen fixation and nitrogen remobilisation of Maize under greenhouse conditions / K.B. Kuan [et al.] // PLOS ONE. - 2016. - Vol. 11, N 3 - P. 1-19.
9. Bacillus pumilus ES4: candidate plant growth-promoting bacterium to enhance estab-
lishment of plants in mine tailings / L.E. de-Bashan [et al.] // Environ. Exp. Bot. - 2010. -Vol. 69, N 3 - P. 343-352.
10. Characterization of Bacillus probio-tics available for human use / L.H. Duc [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 4 - P. 2161-2171.
11. Bentur, H. Central venous catheter infection with Bacillus pumilus in an immunocompetent child: a case report / H. Bentur, A. Dalzell, F. Riordan // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. -2007. - Vol. 6 - P. 12.
12. Bacillus spp. among hospitalized patients with haematological malignancies: clinical features, epidemics and outcomes / V. Ozkocaman [et al.] // J. Hosp. Infect. - 2006. - Vol. 64, N 2 -P. 169-176.
13. Cutaneous infection due to Bacillus pumilus: report of 3 cases / D. Tena [et al.] // Clin. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 44, N 4 - P. 40-42.
14. Galal, A.A. Bacillus pumilus, a new pathogen on Mango plants / A.A. Galal, A.A. ElBana, J. Janse // Egypt J Phytopathol. - 2006. -Vol. 34, N 1 - P. 17-19.
15. Association of a bacillus species with leaf and twig dieback of Asian pear (Pyrus Pyrifolia) in China / B. Li [et al.] // J. PLANT Pathol. -
2009. - Vol. 91, N 3 - P. 705-708.
16. Peng, Q. Bacillus pumilus, a novel ginger rhizome rot pathogen in China / Q. Peng, Y. Yuan, M. Gao // Plant Dis. - 2013. - Vol. 97, N 10 - P. 1308-1315.
17. First report of Bacillus pumilus on Phase-olus vulgaris in Spain / M.I. Font [et al.] // Plant Pathol. - 2010. - Vol. 59, N 2 - P. 400.
18. Kotan, K. R. Identification and patho-genicity of bacteria isolated from pome fruit trees in the Eastern Anatolia region of Turkey / K.R. Kotan, F. Sahin, A. Ala // J. Plant Dis. Prot. - Vol. 113, N 1 - P. 8-13.
19. Bathily, H. Bacillus pumilus a new pathogen on potato tubers in Mali / H. Bathily, A.H. Babana, F. Samake // South Afr. J. Econ. -
2010. - Vol. 4, N 20 - P. 2067-2071.
20. Комар, Е.И. Характеристика возбудителей бактериальных гнилей картофеля на территории Беларуси / Е.И. Комар, А.Г. Пес-някевич // Вестник БГУ Серия 2. - 2013, № 1 - С. 54-60.
21. Kovaleva, V. Bacillus pumilus - a new phytopathogen of Scots pine: Short Communica-
tion / V. Kovaleva // J. For. Sci. - 2015. - Vol. 61, N 3 - P. 131-137.
22. Specific oligonucleotide primers for detection of endoglucanase positive Bacillus subtilis by PCR / S. Ashe [et al.] // 3 Biotech. -2014. - Vol. 4, N 5 - P. 461-465.
23. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction / J. Ye [et al.] // BMC Bioinformatics. - 2012. -Vol. 13 - P. 134.
24. Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria : 2 / K. Wilson // Curr. Protoc. Mol. Biol. - 2001 - P. 2.4.1-2.4.5.
25. Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements / A.C.E. Darling [et al.] // Genome Res. - 2004. -Vol. 14, N 7 - P. 1394-1403.
26. Clustal W and Clustal X version 2.0 / M.A. Larkin [et al.] // Bioinforma. Oxf. Engl. -2007. - Vol. 23, N 21 - P. 2947-2948.
27. Kibbe, W.A. OligoCalc: an online oli-gonucleotide properties calculator / W.A. Kibbe // Nucleic Acids Res. - 2007. - Vol. 35, N 2 -P. 43-46.
28. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis / S. Turner [et al.] // J. Eukaryot. Microbiol. - 1999. -Vol. 46, N 4 - P. 327-338.
29. Use of the 16S-23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity / J. García-Martínez [et al.] // J. Microbiol. Methods. - 1999. - Vol. 36, N 1-2 - P. 55-64.
30. Горовик, Ю.Н. ПЦР-диагностика бактерий Bacillus pumilus / Ю.Н. Горовик, А.Л. Лагоненко, А.Н. Евтушенков // Труды БГУ Ч. 1. - 2014. - Т. 9 - С. 162-166.
31. Комар, Е.И. Идентификация грам-отрицательных пектолитических фитопато-генных бактерий, вызывающих заболевания картофеля в Беларуси / Е.И. Комар, М.И. Ша-вель, А.Г. Песнякевич // Вестник БГУ. Серия 2. -2014. - № 2 - С. 54-60.
32. Amin, M. Isolation and identification of Bacillus species from soil and evaluation of their antibacterial properties / M. Amin, Z. Rakhisi, A.Z. Ahmady // Avicenna J. Clin. Microbiol. Infect. - 2015. - Vol. 2, N 1 - P. 1-4.
O.V. Yeudakimava, V.E. Miamin, L.N. Valentovich
IDENTIFICATION OF BACILLUS PUMILUS BACTERIA BY USING
SPECIES-SPECIFIC PCR ASSAY
Institute of Microbiology, National Academy of Sciences Belarus, 220141, Minsk, Kuprevich str. 2
A polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for rapid identification of Bacillus pumilus and from soil samples. Two pairs of primers were constructed to amplify 1149 and 553 bp DNA fragment. The specificity of the primers was tested with 7 collection strains and 27 isolates from infected plant. The PCR product was only produced with B. pumilus DNA. The results demonstrated that PCR with developed primers is a quick, simple and reliable method for detection and identification of B. pumilus bacteria.
Key words: Bacillus pumilus, PCR, primers.
Дата поступления статьи 3 октября 2016 г.
