CC BY
15OECD+WoS: 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2021-104-2-14962
Полнотекстовая статья
ПОДБОР ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ШТАММОВ XANTHOMONAS ARBORICOLA, ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЗЛАКОВЫХ И КАПУСТНЫХ КУЛЬТУР
Е.И. Кырова1*, А.Н. Игнатов2
'Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург 2Российский университет дружбы народов, Москва
* ответственный за переписку, e-mail: ekirova'9''@yandex.ru
Группа бактерий рода Xanthomonas, вирулентных для пшеницы, ржи, ячменя, томата, подсолнечника и капустных культур, была выделена в России в 2001-2008 гг. Анализ физиологических признаков и мультилокусное секвенирование показали принадлежность бактерий к виду Xanthomonas arboricola. Сравнение генома, представительного для данной группы штамма 3004, выделенного из ячменя, но также вирулентного для подсолнечника, китайской капусты и грецкого ореха, продемонстрировало отсутствие следов транспортной системы третьего типа T3SS и горизонтальный перенос ряда других генов вирулентности из отдаленно-родственных видов. Было предложено использовать гены транспортной системы четвертого типа T4SS в качестве мишени для группоспецифичного анализа этих патогенных штаммов. После проведения проверки, на основе фрагмента гена virD4, были разработаны праймерная пара и зонд для детекции в режиме ПЦР в реальном времени. Продукты амплификации были получены для всех штаммов Xanthomonas arboricola и не обнаружены у бактерий других видов ксантомонад и эпифитных бактерий, присутствующих на растениях-хозяевах. Разработанный диагностикум позволяет определять целевую группу Xanthomonas arboricola на пораженных растениях при прямом ПЦР или после периода роста на селективной питательной среде (био-ПЦР), и имеет чувствительность выше, чем у традиционного метода выделения бактерий на селективной питательной среде.
Ключевые слова: геномный анализ, гены вирулентности, подсолнечник, ПЦР в реальном времени, семенная инфекция
Поступила в редакцию: '0.03.202' Принята к печати: 30.05.202'
Россия находится на третьем месте в мире по производству зерновых злаков (сем. Poaceae) и капустных культур (сем. Brassicaceae). Только в 2019 году было собрано 99.4 млн тонн зерновых, а также 363.4 тыс. тонн капустных культур (FAO, 2020). Несмотря на высокие валовые показатели, наблюдается потеря значительной части урожая от заболеваний различной этиологии в период вегетации и хранения. В последние годы отмечается увеличение вредоносности бактериальных болезней (Евсеев, Карако-тов, 2021; Лазарев и др., 2017).
Бактериозами злаков, вызываемыми комплексом бактерий рода Xanthomonas, заражено до 50 % площадей зерновых злаков в мире. При ранней эпифитотии потери урожая восприимчивых сортов могут достигать 40 % (Kyrova, Ignatov, 2019). Сосудистый бактериоз капустных, вызываемый X. campestris, широко распространен во всем мире, включая Россию. Известны случаи, когда раннее заражение капустных культур от инфицированных семян вызывало потери 90 % потенциального урожая (Williams, 1980).
Начиная с 2000-х годов на территории РФ описано заражение растений обособленной группой штаммов X. arboricola (Игнатов и др., 2009; Игнатов и др., 2010). В рамках данного вида известны несколько специализированных и очень вредоносных патовариантов (патоваров): X. arboricola pv. arracaciae, X. arboricola pv. celebensis, X. arboricola pv. corylina, X. arboricola pv. fragariae,
X. arboricola pv. guizotiae, X. arboricola pv. juglandis, X. arboricola pv. poinsettiicola, X. arboricola pv. populi, X. arboricola pv. pruni и X. arboricola pv. zantedeschiae (Vauterin et al., 1995; Fischer-Le Saux et al., 2015).
Атипичные штаммыX. arboricola, не принадлежащие к ранее известным патоварам, способны поражать широкий круг культур: злаки, томаты, подсолнечник, рапс и капусту, в добавление к традиционным растениям-хозяевам этого вида (грецкий орех, фундук, косточковые плодовые, земляника, бананы, тополь и др.) (Игнатов и др., 2010). Факторы, обуславливающие широкий круг поражаемых растений у некоторых групп штаммов до сих пор неизвестны. Об оценке реакции кX. arboricola среди различных сортов растений-хозяев в научной литературе не сообщается. Нет также сведений и об эффективных средствах химического и биологического контроля возбудителя.
Единственным эффективным методом снижения вредоносности патогена является своевременное выявление и выбраковка зараженного семенного и посадочного материала. Для выявления фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas методом ПЦР были предложены в качестве мишеней различные гены, как участвующие в патогенезе и принадлежащие системе секреции III типа (T3SS), так и гены «домашнего хозяйства», например ß-субъединицы ДНК-гиразы (gyrB) (Leite et al., 1994; Пунина, 2009; Егорова, 2014, Hasan et al., 2018).
© Кырова Е.И., Игнатов А.Н. Статья открытого доступа, публикуемая Всероссийским институтом защиты растений (Санкт-Петербург) и распространяемая на условиях Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Как показали предварительные исследования, широко используемые гены-мишени нельзя применять для ПЦР-детекции атипичных штаммов X. агЬопсо1а. В первую очередь это связано с отсутствием генов T3SS у данной группы (Ignatov et а1., 2015; Мокрякова и др., 2010). Вторым ограничивающим фактором является недостаточное разнообразие и давление отбора на ген gyrB в эволюции ксантомонад (Кырова, 2014), что может привести к появлению ложных результатов при определении зараженности посевного материала. 1п si1ico ПЦР с праймера-ми, разработанными Егоровой и коллегами показал, что тест-система на основе гена gyrB позволяет выявить лишь 46 % атипичных штаммов из исследуемой нами коллекции ^1, s2, s3, s4, Вг1363, Вг1364, Вг1365, Вг1366, уа3028, уа1265, уа3004, Во1392, Во1393, Во1395).
Анализ генома штамма 3004, представляющего атипичную группу X. агЬогко1а (Ignatov et а1., 2015) позволил
выявить гены-мишени для детекции таких штаммов. Мы рассмотрели перспективную группу генов-мишеней, принадлежащих к системе секреции IV типа. Гены систем секреции достаточно консервативны, так как участвуют в процессах патогенеза. С другой стороны, они достаточно изменчивы в связи с их ролью во взаимодействии патоген-хозяин. Исходя из этого, можно сказать, что гены группы транспортных систем обладают достаточным уровнем полиморфизма для идентификации на различных уровнях - от вида до штамма. Специфичные ПЦР-прай-меры на гены T4SS для фитопатогенных бактерий рода Agrobacterium (Haas et al, 1995; Bini et al, 2008) давно зарекомендовали себя в качестве практичного метода обнаружения и идентификации целевых патогенов. В данной работе мы описываем разработку протокола диагностики атипичных штаммов на основе гена virD4.
Материалы и методы
В работе была использована коллекция из 30 атипич- а также типовой штамм X. arboricola pv. juglandis ICMP 35 ных штаммов X. arboricola, собранных Игнатовым А.Н. (табл. 1). В качестве контролей использовали ранее изучен-(РУДН) и Пехтеревой Э.Ш. (ГНУ-ВНИИ фитопатологии), ные штаммы видов X. campestris, X. vesicatoria, X. oryzae,
Таблица 1. Список штаммов, использованных в работе Table 1. The list of strains used in the present study
Вид Species Штамм Strain Растение-хозяин Host Plant Вид Species Штамм Strain Растение-хозяин Host Plant
Целевые штаммы Target strains Прочие фитопатогенные бактерии Otherphytopathogenic bacteria
Xanthomonas arboricola pv. juglandis
X. arboricola
ICMP 35
si s2 s3 s4 Bo1392 Bo1393
..Bo.1.3.95.. Brl'343 Br1344 Br1346 Br1347 Br1348 Br1349 Br1350 Br1351 Br1352 Br1353 Br1354 Br1355 Br1356 Br1357 Br1363 Br1364 Br1365 Br1366 ya1265 ya3004 ya3028 "T0T577" To417
Juglandis regia
Helianthus annuus
Brassica oleracea
X. vesicatoria
X. axonopodis X. campestris pv. campestris X. oryzae pv. oryzae X. hortorum Dickeya chrysanthemi Pectobacterium carotovorum Pseudomonas syringae pv. syringae
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
2360
HRI924a NCPBB 528T NCPPB 3002 NCPPB 939 H2 PB70
1845 1209
Solanum lycopersicum Phaseoli vulgaris Brassicae oleracea Oryza sativa Hedera helix Daucus carota Solanum tuberosum
Helianthus annum
Solanum lycopersicum
Эпифитные и ризосферные бактерии Epiphyte and rhizosphere bacteria
Brassica napus
Klebsiella oxytoca Bacillus cereus Stenotrophomonas malto-philia
Enterobacter cloacae Bradyrhizobium spp. Serratia plymuthica Advenella mimigardeforden-sis
Enterobacter cancerogenus Serratia proteomaculans Pantoea agglomerans Pantoea vagans_
Ko430 Bc462, Bc475 Sm213, Sm488,
Sm1550 Ec467, Ec216 B525 Sp490
A517
E451 Spr401 Pa1239 Pv1392
Triticum aestivum
Solanum tuberosum Hordeum vulgare
Hordeum vulgare
Solanum lycopersicum
X. hortorum, X. axonopodis и штаммы других фитопатоген-ных бактерий (Pseudomonas spp., Clavibacter spp., Dickeya spp., Pectobacterium spp.), а также непатогенные эпифит-ные и ризосферные бактерии из коллекций РУДН, ВИЗР и РГАУ-МСХА - всего 24 штамма нецелевых видов.
Видовая принадлежность всех штаммов была определена секвенированием фрагментов гена 16S rRNA, а для ксантомонад, дополнительно, мультилокусным секвенированием фрагментов 4 генов, входящих в стандартную схему мультилокусного генотипирования (Young et al., 2008). Все штаммы хранились в замороженном виде при -80 °C и использовались для экспериментов после обязательной проверки чистоты и соответствия оригинальной культуре по морфологическим и основным физиологическим признакам рода Xanthomonas и вида X. arboricola.
Для выделения ДНК бактерии культивировали на питательной среде YDC (глюкоза - 10 г; дрожжевой экстракт - 10 г; СаСО3 - 20 г; агар - 18 г; дистиллированная вода до 1 литра) при 28 °C в течение 24-48 ч (Schaad et al., 2001).
ДНК выделяли из одной петли 48 ч бактериальной культуры или 100 мкл бактериальной суспензии в диапазоне концентраций от 2*108 до 2*10-1 КОЕ/мл с помощью набора «Фитосорб», кат. № PH-520 (ООО «Синтол», Москва) согласно рекомендациям производителя.
Для подбора гена-мишени использовались геномные последовательности X. arboricola штамма (шт.) 3004 (GenBank accession no. GCA_000585435), X. arboricola pv. juglandis шт. 417 (CP012251.1), X. arboricola шт. 17 (CP011256.1), X. arboricola pv. pruni шт. 15-088 (CP044334.1), X. campestris pv. campestris шт. ATCC 33913T (AE008922.1), X. oryzae pv. oryzae шт. ICMP3125 (CP031697.1),X. vesicatoria шт. ATCC 35937 (CP018725.1), X. citri pv. citri шт. 306 (AE008923.1), X. hortorum шт. B07-007 (CP016878.1), X. fragariae шт. PD885 (LT853882.1), X. campestris pv. vesicatoria шт. 85-10 (AM039952.1), X. translucens pv. undulosa шт. ICMP11055 (CP009750.1).
Выравнивание геномов осуществлялось с помощью алгоритма Blast Atlas на сервере GView (https://server.gview. ca/) и программного обеспечения Mauve 2.4.0, алгоритма progressiveMauve (Darling et al., 2010). Параметры были выставлены по умолчанию. Выравнивание алгоритмом алгоритм progressiveMauve выполнялось в двух вариантах. Первый вариант проводился с использованием последовательностей геномов X. arboricola для выявления вариабельных участков и уникальных последовательностей
- потенциальных генов-мишеней. Второй вариант представлял собой межвидовое сравнение для оценки специфичности выбранных регионов.
Число полиморфных позиций, филогенетически информативных позиций и коэффициент консервативности последовательностей рассчитывали в программе DnaSP6 (Rozas et al., 2017).
Праймеры для амплификации фрагментов генов virB3, virB4 и virB9, а также праймеры и зонд для амплификации целевого фрагмента гена virD4 были подобраны к вариабельным участкам соответствующих генов с помощью алгоритма Primer BLAST, основанного на Primer 3 (Ye et al., 2012). Последовательности праймеров для гена virD4: vird4_xa_f (5'-CCG GAC ATC TTG ATC TTG GTT GCG T-3'), vird4_xa_r (3'-CTG ACG CTT CTG TTG TTG CGG CT-5') и vird4_xa_z (ROX -CAG CGC CTT GAC GTA GCG GTA G -BHQ2) были отобраны по результатам предварительных ПЦР - амплификаций классическим методом, с верификацией продуктов ПЦР - электрофорезом в агароз-ном геле и секвенированием фрагментов ожидаемой длины (данные не показаны). Длина продукта амплификации фрагмента гена virD4 c праймерами vird4_xa_f/ vird4_xa_r составляла 121 н.п.
Для постановки реакции была использована «2.5х реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ» (кат. № M-428 Синтол, Москва). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Для подбора наилучшего состава смеси проводили оптимизацию по концентрации MgCl2, прямого, обратного праймеров и флуоресцентного зонда. Концентрация остальных компонентов реакционной соответствовала рекомендациям производителя набора.
ПЦР-реакцию проводили на амплификаторе Real-time CFX96 Touch (BIO-RAD) с использованием предварительно оптимизированного температурно-временного профиля: 95 °C - 5 мин, и последующие 35 циклов с профилем 95 °C - 15 сек, 70 °C - 40 сек.
Для определения чувствительности тест-системы готовили разведения суспензии бактериальных клеток в концентрации от 2*108 до 2*10-1 КОЕ/мл для последующего выделения ДНК и постановки реакции. Концентрацию бактерий проверяли методом высева 10-кратных стандартных разведений на чашки Петри с агаризованной средой YDC, и подсчетом числа колоний через 4 дня инкубации при 28 °C.
Результаты
Проведенное нами для поиска гена-мишени множественное выравнивание геномов бактерий вида X. агЬопсо1а показало достаточно высокую синтению и степень сходства последовательностей для большей части генов. Вариабельные участки, преимущественно, приходятся на обрывки контигов, гены метаболизма, межгенные регионы и гены T3SS и T4SS. Было отмечено наличие ряда уникальных последовательностей штамма X. агЬопсо1а 3004. К ним относились гены секретируемых белков, транспозаз, нуклеаз, протеаз, профаговые последовательности, гены, кодирующие белки ^гЕ, FimV, RhsD, и большое число консервативных гипотетических пептидов. Было также подтверждено отсутствие у шт. 3004 кластера генов T3SS (рис. 1, 2), что делает невозможным их
использование для детекции штаммов, поражающих злаковые и капустные культуры на территории РФ.
На этапе проверки специфичности найденных уникальных по сравнению с другими геномами X. arboricola последовательностей шт. 3004, нами была отмечена высокая гомология данных участков хотя бы с одним из геномов других видов ксантомонад, в частности с видами X. campestris и X. hortorum, гомология соответствующих фрагментов генома штамма 3004 достигала 96 %, а с X. citri - 99 %. Данный факт может указывать на т.н. «мозаичность» генома в пределах рода Xanthomonas (Merda et al. 2017), которая накладывает серьезные ограничения на разрабатываемые тест-системы, т.к. ввиду высокой схожести последовательности потенциальных
Рисунок 1. Анализ методом BLAST геномов штаммов Xanthomonas arboricola. Расположение геномов от центра
к периферии в порядке: X. arboricola pv. juglandis str. 417, X. arboricola 3004, X. arboricola 17, X. arboricola pv. pruni str. 15-088. Прямоугольником выделена область кластера генов T3SS. Кластер генов отсутствует у штаммов
X. arboricola 17 и X. arboricola 3004 Figure 1. BLAST analysis of the genomes of Xanthomonas arboricola strains. Genomes are arranged from the center to the periphery in the following order: X. arboricola pv. juglandis str. 417, X. arboricola 3004, X. arboricola 17, X. arboricola pv. pruni str. 15-088. The T3SS gene cluster region is highlighted with a rectangle. The gene cluster is absent inX. arboricola 17
and X. arboricola 3004 strains
уникальных диагностических фрагментов с последовательностями родственных видов велика вероятность ложных результатов.
Среди найденных вариабельных участков выделяется по своей функциональной полноте кластер генов T4SS, расположенный на участке 547534-558304 н.п. генома шт. 3004 (рис. 2). Кластер генов T4SS консервативен по строению у различных видов ксантомонад (Cesbron et al., 2015). Данные гены описаны в литературе и детально изучены у многих видов бактерий (Juhas et al., 2008). Система T4SS штамма 3004 содержит 10 vir генов и 15 генов, отвечающих за сборку пиля для секреции vir белков. Каждый из генов обладает показателями вариабельности достаточными
для достижения необходимых уровней таксономического разрешения от вида до штамма (табл. 2), за исключением генов virB6 и virB5, являющихся многокопийными.
На основании предварительной оценки ряда праймеров для амплификации генов virD4, virB3, virB4, и virB9, были отобраны праймеры для гена virD4, отличавшиеся высокой специфичностью и эффективностью ПЦР. В предыдущих исследованиях мы выявили разнородность штаммов X. arboricola выделенных как из одной культуры, так и из разных растений-хозяев. Высоко вариабельные гены не подходили для детекции генетически разнородной группы штаммов. При выравнивании последовательностей гена virD4 у атипичных штаммов с последовательностями
Рисунок 2. Полногемномное выравнивание геномов штаммов Xanthomonas arboricola, доступных в базах данных иX. arboricola шт. 3004. Кластер генов T4SS расположен на участке 556631-4186000 н.п. Структура кластера T4SS консервативна, гены обозначены цифрами: 1-virD4, 2-virB1, 3-virB2, 4-virB3, 5-virB4, 6-virB8, 7-virB9, 8-virB10, 9-virB10. Гены virB5 и virB6 находятся за пределами кластера и многокопийны. Местоположение кластера генов T3SS
показано стрелками. У штаммовX arboricola шт. 17 иX. arboricola шт. 3004 кластер T3SS не найден Figure 2. Comprehensive genome alignment of Xanthomonas arboricola strains available in the databases and X. arboricola str. 3004. T4SS gene cluster is located at 556631 to 4186000 bp. The structure of the T4SS cluster is conserved; genes are numbered as follows: 1-virD4, 2-virB1, 3-virB2, 4-virB3, 5-virB4, 6-virB8, 7-virB9, 8-virB10, 9-virB10. VirB5 and virB6 genes are located outside the cluster and are multicopy. Location of the T3SS gene cluster is shown with arrows. T3SS genes were not
found inX. arboricola str. 17 andX. arboricola str. 3004.
Таблица 2. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей генов T4SS Xanthomonas агЬопсо1а и других представителей семейства Xanthomonadaceae
Показатель Полиморфизм генов vir на уровне вида/рода
virD4 virBl virB2 virB3 virB4 virB8 virB9 virBlO virBll
Число полиморфных позиций 145/518 369/347 139/262 89/104 645/930 196/554 213/419 322/518 282/722
Число филогенетически информативных позиций 90/496 239/484 103/126 57/91 257/868 73/451 61/248 21/490 111/661
Коэффициент консерватив- 0.913/ 0.560/ 0.422/ 0.603/ 0.735/ 0.727/ 0.704/ 0.711/ 0.728/
ности последовательностей 0.676 0.422 0.321 0.574 0.613 0.165 0.453 0.455 0.276
Table 2. Polymorphism of the nucleotide sequences of T4SS genes in Xanthomonas arboricola and other members of the Xanthomonadaceae family
Indicator Polymorphism of the vir genes at the species/genus level
virD4 virBl virB2 virB3 virB4 virB8 virB9 virBlO virBll
Number of polymorphic sites 145/518 369/347 139/262 89/104 645/930 196/554 213/419 322/518 282/722
Number of phylogenetically informative sites 90/496 239/484 103/126 57/91 257/868 73/451 61/248 21/490 111/661
Sequence conservation 0.913/ 0.560/ 0.422/ 0.603/ 0.735/ 0.727/ 0.704/ 0.711/ 0.728/
coefficient 0.676 0.422 0.321 0.574 0.613 0.165 0.453 0.455 0.276
Xanthomonas spp., найденными в Генбанке, было отмечено, что этот ген сочетает в себе достаточную консервативность внутри вида и вариабельность между разными видами бактерий. Высокая внутривидовая консервативность, по-видимому, связана с его биологической функцией в патогенезе. Мутации в данном гене могут привести к полной потере функциональности T4SS ^о^а et а1., 2015). Данная особенность является достоинством при разработке
системы детекции видов с высокой частотой генетической изменчивости. Из-за своей предполагаемой роли в патогенезе, данный ген с меньшей долей вероятности будет вовлечён в эволюционные процессы.
После подбора последовательностей праймера и зонда нами были оптимизированы такие параметры для постановки реакции как температура отжига, концентрация праймеров и зонда, концентрация MgQ2
Подбор температуры отжига праймеров осуществляли с помощью градиента температур от 60 °С до 70 °С с шагом в 2 °С. Несмотря на более низкое значение порогового цикла Cq при температурах отжига от 60 °С до 68 °С включительно, при проведении анализа регистрировалось образование неспецифических продуктов амплификации.
Подбор оптимальной концентрации праймеров и зонда осуществляли в диапазоне от 9 до 4 рто1 для каждого из компонентов. Экспериментально установлено следующее оптимальное соотношение концентраций: 9 рто1 зонда и 7 рто1 каждого праймера.
Количество MgQ2 определялось в диапазоне от 0.5 ц1 до 1.5 ц1 с шагом в 0.25. Оптимальное количество было определено нами как 1 ц1 25 мМ раствора на 25мкл реакционной смеси. Несмотря на то, что наименьшее О: регистрировалось при добавлении в реакционную смесь 0.5 ц1 MgQ2, кривые имели не типичную, линейную форму (кривая-выброс). Такие результаты не могут быть учтены. При добавлении в реакционную смесь MgQ2 более 1 ц1 наблюдалось ингибирование реакции после 6-8 циклов, следующих за пересечением пороговой линии.
Таким образом реакционная смесь имела следующий состав на конечный объем 25 ц1: 10мкл 2.5х реакционного буфера, по 7 рто1 каждого праймера, 9 рто1 зонда, 1 ц1 25 мМ раствора MgCl2.
Для оценки специфичности реакции были использованы виды бактерий, приведенные в таблице 4. Система отличается высокой специфичностью и не выявляет друге виды Xanthomonas, а также бактерии других родов (табл. 4, рис. 3).
Полученные результаты демонстрируют, что чувствительность разработанной системы-детекции потенциально может достигать 20 КОЕ/мл (табл. 5)
Следует отметить, что при 10-кратном повторении эксперимента по оценке чувствительности, в 2-х из 10-и повторений отмечалась нестабильность реакции, проявившаяся в отсутствии детекции при концентрации 2*10' КОЕ/мл. Таким образом, чувствительность можно оценить как 2*102 КОЕ/мл. В качестве одного из путей повышения чувствительности реакции возможно использование ВЮ-PCR анализа.
Таблица 4. Оценка специфичности разработанной тест-системы на основе гена virD4 of Xanthomonas arboricola Table 4. Assesment of specificity of the test system based on virD4 gene in Xanthomonas arboricola
Число Среднее значение
Вид штаммов порогового цикла Cq
Species Number Mean quantitation
of Strains cycle Cq
Фитопатогенные виды
Phytopathogenic species
X. arboricola 31 20.7
X. campestris 1 N/A
X. vesicatoria 1 N/A
X. oryzae 1 N/A
X. hortorum 1 N/A
X. axonopodis 1 N/A
C. michiganensis sbsp. sepe- 1 N/A
donicus.
Pectobacterium carotovorum 1 N/A
Dickeya chrysanthemi 1 N/A
Pseudomonas syringae pv. 1 N/A
syringae
Эрпифитные и ризосферные виды
Epiphyte and rhizosphere species
Klebsiella oxytoca 1 N/A
Bacillus cereus 2 N/A
Stenotrophomonas malto- 3 N/A
philia
Enterobacter cloacae 2 N/A
Bradyrhizobium spp. 1 N/A
Serratia plymuthica 1 N/A
Advenella mimigardefordensis 1 N/A
Enterobacter cancerogenus 1 N/A
Serratia proteomaculans 1 N/A
Pantoea agglomerans 1 N/A
Pantoea vagans 1 N/A
N/A - пороговый уровень не перейден до 35 цикла реакции.
N/A - threshold level is not reached before 35th reaction cycle.
Таблица 5. Оценка чувствительности и воспроизводимости разработанной тест-системы
для детекции Xanthomonas агЬопсо1а
Концентрация суспензии клеток патогена 2х108 2х107 2х106 2х105 2х104 2х103 2х102 2Х101 2х100 2х10-1
Среднее значение порогового цикла Cq 15.20 16.77 17.56 23.29 26.04 27.37 28.89 31.78 N/A N/A
Стандартное отклонение 1.24 0.2 0.33 0.49 0.5 0.41 0.63 13.44 N/A N/A
Table 5. Sensitivity and repeatability of the developed test system for Xanthomonas arboricola detection
Concentration of the cell suspension of the pathogen 2х108 2х107 2х106 2х105 2х104 2х103 2х102 2х101 2х100 2х10-1
Mean quantitation cycle Cq 15.20 16.77 17.56 23.29 26.04 27.37 28.89 31.78 N/A N/A
Standard deviation 1.24 0.2 0.33 0.49 0.5 0.41 0.63 13.44 N/A N/A
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 + +++ + +++ + +. 250
M
26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Г 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
.....-......._ + + + + ++ + - - ...
- <-250
Рисунок 3. Детекция штаммов Xanthomonas arboricola, патогенных для злаковых и капустных культур. Размер диагностического фрагмента 121 н.п.. M - маркер молекулярного веса 50bp «Fermentas», 1 - ICMP 35, 2 - s1, 3 - s2, 4 - s3, 5 - s4, 6 - Bo1392, 7 - Bo1393, 8 - Bo1395, 9 - Br1343, 10 - Br1344, 11 - Br1345, 12 - Br1346, 13 - Br1347, 14
- Br1348, 15 - Br1349, 16 - Br1350, 17 - Br1351, 18 - Br1352, 19 - Br1353, 20 - Br1354, 21 - Br1355, 22 - Br1356, 23 -
Br1357, 24 - Br1363, 25 - Br1364, 26 -X. campestris, 27 -X. vesicatoria, 28 -X. oryzae, 29 -X. hortorum,
30 -X. axonopodis, 31 - Clavibacter spp., 32 - Pectobacterium spp., 33 - Dickeya spp, 34 - Pseudomonas spp.,
35 - Klebsiella spp., 36 - Bacillus spp., 37 - Stenotrophomonas spp., 38 - Enterobacter spp., 39 - Br1365, 40 - Br1366, 41 - ya1265, 42 - ya3004, 43 - ya3028, 44 - To1577, 45 - To417, 46 - Bradyrhizobium spp, 47 - Serratia spp., 48 - Advenella spp., 49 - Pantoea spp.,50 - отрицательный контроль
Figure 3. Detection of Xanthomonas arboricola strains pathogenic to cereals and cabbage crops. The size of the diagnostic fragment is 121 n.p. M - molecular weight marker 50bp "Fermentas", 1 - ICMP 35, 2 - s1, 3 - s2, 4 - s3, 5 - s4, 6 - Bo1392, 7 - Bo1393, 8 - Bo1395, 9 - Br1343, 10 - Br1344, 11 - Br1345, 12 - Br1346, 13 - Br1347, 14 - Br1348, 15 - Br1349, 16
- Br1350, 17 - Br1351, 18 - Br1352, 19 - Br1353, 20 - Br1354, 21 - Br1355, 22 - Br1356, 23 - Br1357, 24 - Br1363, 25 -
Br1364, 26 -X. campestris, 27 -X. vesicatoria, 28 -X. oryzae, 29 -X. hortorum, 30 -X. axonopodis,
31 - Clavibacter spp., 32 - Pectobacterium spp., 33 - Dickeya spp., 34 - Pseudomonas spp., 35 - Klebsiella spp.,
36 - Bacillus spp., 37 - Stenotrophomonas spp., 38 - Enterobacter spp., 39 - Br1365, 40 - Br1366, 41 - ya1265, 42 - ya3004, 43 - ya3028, 44 - To1577, 45 - To417, 46 - Bradyrhizobium spp., 47 - Serratia spp., 48 - Advenella spp.,
49 - Pantoea spp., 50 - negative control
Обсуждение
На сегодняшний день существует не менее 50 протоколов определения бактерий рода Xanthomonas, основанных на методах классической ПЦР, RT-ПЦР и BIO-ПЦР (Егорова, 2015). Все системы детекции на основе метода ПЦР способны различать организмы на следующих уровнях: род, вид, патовариант и штамм. Вариабельность целевого гена является основой для его выбора. Первые системы детекции, основанные на последовательностях 16s рРНК, не позволяли идентифицировать бактерии на уровне ниже вида в связи с низкой скоростью изменчивости данного гена (Moore et al., 1997). Затем было предложено использование последовательностей межгенного транскрибируемого региона 16S-23S рРНК. Данный регион показывал значительную изменчивость в результате дрейфа генов (Garcia-Martinez et.al., 1996; Tokajian et.al., 2016). Он изменяется до 10 раз быстрее гена 16S рРНК, что позволило использовать его для видовой идентификации бактерий (Rosato et.al., 2002). В 1996 году было
предложено использовать для видовой идентификации гены «домашнего хозяйства». Широкое применение на практике в качестве гена-мишени получил ген gyrB. Последовательности данного гена были использованы в качестве филогенетического маркера, а также в качестве диагностического маркера на уровне рода и вида (Yamamoto et al., 1996; Yamamoto et al., 1999). Использование тест-систем на основе последовательностей гена gyrB позволило идентифицировать такие виды, как X. fragariae, X. oryzae, X. vesicatoria, X. gardneri, X. translucens, X. axonopodis, Х. citri и X. alfalfa (Parkinson et al., 2007). Для выявления различных патовариантов X. campestris и некоторых других видов рода Xanthomonas также используются гены T3SS (Leite et al., 1994; Zaccardelli et al., 2007; Hasan et al., 2018). Для детекции X. arboricola pv. pruni были разработаны тест-системы на различные участки hrp генов (Park et al., 2010; Palacio-Bielsa et al., 2015). Кроме того, для выявления X. arboricola используют ряд генов-мишеней,
идентифицированных с помощью in silico подходов (XAJ1, XAJ6 и XAJ8), и ABC-транспортеры (Palacio-Bielsa et al, 2011, Fernandes et al, 2017).
Атипичные штаммы X. arboricola представляют из себя сложную группу для диагностики, что связано с их генетическими особенностями. Аннотация генома шт. 3004 подтвердила отсутствие генов T3SS, выявленное ранее при постановке реакции ПЦР с праймерами на консервативные участки данных генов и генов белков эффекторов. При множественном выравнивании с помощью алгоритма progressiveMauve генома шт. 3004 с 11-ю полностью секвенированными и аннотированными последовательностями геномов бактерий рода Xanthomonas наблюдалась высокая гомология многих участков генома шт. 3004 с таким же участком хотя бы у одного из 11 штаммов. Высокая гомология отдельных участков может способствовать появлению ложноположительного результата. Кроме того, штаммы группы X. arboricola 3004 достаточно генетически разнородны, что может быть связано с активными процессами приспособления к новому кругу растений-хозяев. При использовании мультилокусного генотипирова-ния с использованием генов gyrB, dnaK, rpoD, purA, nrdB, prpC, fabB. согласно протоколам, разработанным Янгом и коллегами (Young et al., 2008), практически все штаммы четко не типируются до патоварианта и вида, несмотря
Библиографический
Евсеев ВВ, Каракотов СД (2021) Бактериозы зерновых культур в лесостепной зоне Зауралья, Южного Урала и Северного Казахстана. Защита и карантин растений (1):13—17
Егорова МС, Игнатов АН, Мазурин ЕС (2014) Диагностика нового бактериального патогена злаковых культур Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». Защита картофеля (2):39-42 Егорова МС (2015) Видовое разнообразие и методы диагностики фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые (Poaceae): Дисс. ... к.б.н. Москва. 132 с. Игнатов АН, Пунина НВ, Матвеева ЕВ, Корнев КП и др
(2009) Новые возбудители бактериозов и прогноз их распространения в России. Защита и карантин растений (4):38-40
Игнатов АН, Пунина НВ, Матвеева ЕВ, Пехтерева ЭШ и др (2010) Xanthomonas arboricola - бактериальный патоген сельскохозяйственных культур в России. Защита и карантин растений (4):41-43 Кырова ЕИ, Виноградова СВ, Игнатов АН (2014) Мульти-локусное гентипирование Xanthomonas arboricola российской популяции. Защита картофеля (2):91-94 Лазарев АМ, Мысник ЕН, Игнатов АН (2017) Ареал и зона вредоносности сосудистого бактериоза капусты. Вестник защиты растений 1(91):52-55 Мокрякова МВ, Абдеева ИА, Пирузян ЭС, Шаад НВ и др
(2010) Разнообразие генов-эффекторов у бактерий рода Xanthomonas. Микробиология 79(1):63-71
Пунина НВ (2009) Оценка генетического разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и разработка молекулярных маркеров для их диагностики. Дисс. ... к.б.н. Москва. 188 с.
на типичные для X. arboricola биохимические свойства (Кырова и др., 2014). Использование высоковариабельных генов для такой группы штаммов также приводит к появлению ложных результатов.
В качестве перспективных генов-мишеней для идентификации данной группы мы отмечаем гены системы секреции IV типа (T4SS). На сегодняшний день в базах данных белковых и нуклеотидных последовательностей депонировано более тысячи последовательностей T4SS бактерий рода Xanthomonas. Все они проявляют достаточно ограниченную гомологию друг с другом внутри видов (Souza et al., 2015). Ограниченная гомология таких генов была также отмечена и при анализе множественного выравнивания геномов бактерий рода Xanthomonas.
Разработанная нами тест-система на основе гена virD4 T4SS показала высокую специфичность и чувствительность. Мы также предполагаем, что выбранный при разработке тест-системы участок возможно использовать для систем-детекции на уровне вида и у других представителей рода Xanthomonas. Для детекции отдельных па-товариантов X. arboricola мы предлагаем использовать гены virB3, virB4 и virB9, показавшие при множественном выравнивании более высокий уровень вариабельности. Возможность их использования для атипичных штаммов X. arboricola требует дополнительного изучения.
список (References)
Bini F, Kuczmog A, Putnoky P, Otten L et al (2008) Novel pathogen-specific primers for the detection ofAgrobacterium vitis and Agrobacterium tumefaciens. Vitis 47(3):181-189 Cesbron S, Briand M, Essakhi S, Gironde S et al (2015) Comparative genomics of pathogenic and nonpathogenic strains of Xanthomonas arboricola unveil molecular and evolutionary events linked to pathoadaptation. Front Plant Sci 6:1126. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.01126 Darling AE, Mau B, Perna NT (2010) progressiveMauve: multiple genome alignment with gene gain, loss and rearrangement. PloS ONE 5(6):e11147. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0011147 Fernandes C, Albuquerque P, Sousa R, Cruz L et al (2017) Multiple DNA markers for identification of Xanthomonas arboricola pv. juglandis isolates and its direct detection in plant samples. Plant Dis 101(6):858-865. https://doi. org/10.1094/PDIS-10-16-1481-RE Fischer-Le Saux M, Bonneau S, Essakhi S, Manceau C et al (2015) Aggressive emerging pathovars of Xanthomonas arboricola represent widespread epidemic clones that are distinct from poorly pathogenic strains, as revealed by multilocus sequence typing. Appl Environ Microbiol (81):4651-4688. https://doi.org/10.1128/AEM.00050-15 Garcia-Martinez J, Martínez-Murcia A, Anton AI, Rodriguez-Valera F (1996) Comparison of the small 16S to 23S intergenic spacer region (ISR) of the rRNA operons of some Escherichia coli strains of the ECOR collection and E. coli K-12. J Bacteriol Res 178(21):6374-6377. https://doi. org/10.1128/jb.178.21.6374-6377.1996 Haas JH, Moore LW, Ream W, Manulis S (1995) Universal PCR primers for detection of phytopathogenic Agrobacterium strains. Appl Environ Microbiol 61(8):2879-2884. Hasan SZ, Hossain F, Zaoti ZF, Hasan F et al (2018) PCR amplification of DNA sequence related to the hrpD gene of
Xanthomonas cucurbitae in leaf spot disease of pumpkin and their antagonism by soil bacteria. Arch Phytopathol Pflanzenschutz 51(5-6):252-266. https://doi.org/10.1080/0 3235408.2018.1460923 Ignatov AN, Kyrova EI, Vinogradova SV, Kamionskaya et al (2015) Draft genome sequence of Xanthomonas arboricola strain 3004, a causal agent of bacterial disease on barley. Genome Announc 3(1):e01572-14. https://doi.org/10.1128/ genomeA.01572-14 Juhas M, Crook DW, Hood DW (2008) Type IV secretion systems: tools of bacterial horizontal gene transfer and virulence. Cell Microbiol 10(12):2377-2386. https://doi. org/10.1111/j.1462-5822.2008.01187.x Kyrova EI, Ignatov AN (2019) Diagnostics of phytopathogens of genus Xanthomonas infecting Poaceae plants. Innovative in Agriculture. 14-17 Leite RP, Minsavage GV, Bonas U, Stall RE (1994) Detection and identification of phytopathogenic Xanthomonas strains by amplification of DNA sequences related to the hrp genes of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Appl Environ Microbiol 60(4):1068-1077. Merda D, Briand M, Bosis E, Rousseau C et al (2017) Ancestral acquisitions, gene flow and multiple evolutionary trajectories of the type three secretion system and effectors in Xanthomonas plant pathogens. Mol Ecol 26(21):5939-5952. https://doi.org/10.1111/mec.14343 Moore ER, Krüger AS, Hauben L, Seal SE et al (1997) 16S rRNA gene sequence analyses and inter-and intrageneric relationships ofXanthomonas species and Stenotrophomonas maltophilia. FEMSMicrobiol Lett 151(2):145-153. https:// doi.org/10.1111/j.1574-6968.1997.tb12563.x Palacio-Bielsa A, Cubero J, Cambra MA, Collados R et al (2011) Development of an efficient real-time quantitative PCR protocol for detection of Xanthomonas arboricola pv. pruni in Prunus species. Appl Environ Microbiol 77(1):89-97. https://doi.org/10.1128/AEM.01593-10 Palacio-Bielsa A, Lopez-Soriano P, Bühlmann A, van Doorn J et al (2015) Evaluation of a real-time PCR and a loop-mediated isothermal amplification for detection of Xanthomonas arboricola pv. pruni in plant tissue samples. J Microbiol Methods 112:36-39. https://doi.org/10.1016/j. mimet.2015.03.005 Park SY, Lee YS, Koh YJ, Hur JS et al (2010) Detection of Xanthomonas arboricola pv. pruni by PCR using primers based on DNA sequences related to the hrp genes. Sci J Microbiol 48(5):554-558.
Parkinson N, Aritua V, Heeney J, Cowie C et al (2007). Phylogenetic analysis of Xanthomonas species by comparison of partial gyrase B gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol 57(12):2881-2887. https://doi.org/10.1099/ ijs.0.65220-0
Rozas J, Ferrer-Mata A, Sanchez-DelBarrio JC, Guirao-Rico S et al (2017) DnaSP 6: DNA Sequence Polymorphism Analysis of Large Datasets. Mol Biol Evol 34:3299-3302. https://doi.org/10.1093/molbev/msx248 Schaad NW, Jones JB, Chun W (2001) Laboratory guide for the identification of plant pathogenic bacteria (No. Ed. 3). American Phytopathological Society (APS Press). 373p Souza DP, Oka GU, Alvarez-Martinez CE, Bisson-Filho AW et al (2015) Bacterial killing via a type IV secretion system. Nat Commun 6(1):1-9. Tokajian S, Issa N, Salloum T, Ibrahim J et al (2016) 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region variability helps resolve closely related sphingomonads. Front Microbiol 7:149. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00149 Vauterin L, Hoste B, Kersters K, Swings J (1995) Reclassification of Xanthomonas. Int J Syst Evol Microbiol 45(3):472-489. https://doi.org/10.1099/00207713-45-3-472 Williams PH (1980) Black rot: a continuing threat to world
crucifers. Plant Dis 64(8):736-742. Yamamoto S, Bouvet PJ, Harayama S (1999) Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization. Int J Syst Evol Microbiol 49(1):87-95. https:// doi.org/10.1099/00207713-49-1-87 Yamamoto S, Harayama S (1996) Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nucleotide sequences of gyrB genes and on the amino acid sequences of their products. Int J Syst Evol Microbiol 46(2):506-511. https:// doi.org/10.1099/00207713-46-2-506 Young JM, Park DC, Shearman HM, Fargier E (2008) A multilocus sequence analysis of the genus Xanthomonas. Syst Appl Microbiol 31(5):366-377. https://doi.org/10.1016/j. syapm.2008.06.004 Zaccardelli M, Campanile F, Spasiano A, Merighi M (2007) Detection and identification of the crucifer pathogen, Xanthomonas campestris pv. campestris, by PCR amplification of the conserved Hrp/type III secretion system gene hrcC. Eur J Plant Pathol 118(3):299-306. https://doi. org/10.1007/s10658-007-9115-y
Translation of Russian References
Evseev VV, Karakotov SD (2021) [Bacterial diseases of cereal crops in the woodsteppe area of the Trans-Urals, Southern Urals and Northern Kazakhstan]. Zashchita i karantin rasteniy (1):13-17 (In Russian) Egorova MS, Ignatov AN, Mazurin ES (2014) [Real-time PCR detection of Xanthomonas arboricola, a new bacterial pathogen of cereal crops]. Zashchita kartofelya (2):39-42 (In Russian)
Egorova MS (2015) [Species diversity and diagnostic methods of phytopathogenic bacteria of the genus Xanthomonas affecting plants of the Poaceae family] Moscow: Russian State Agrarian University, 132 p. (In Russian)
Ignatov AN, Punina NV, Matveeva EV, Kornev KP et al (2009) [Novel bacterial pathogens and prediction of their spread in Russia]. Zashchita i karantin rasteniy (4):38-40 (In Russian) Ignatov AN, Punina NV, Matveeva EV, Pekhtereva ES et al (2010) [Xanthomonas arboricola - bacterial pathogen of crops in Russia]. Zashchita i karantin rasteniy (4):41-43 (In Russian)
Kyrova EI, Vinogradova SV, Ignatov AN (2014) [Multi-locus genotyping the Russian population of Xanthomonas arboricola]. Zashchita kartofelya (2):91-94 (In Russian) Lazarev AM, Mysnik EN, Ignatov AN (2017) [Spread and area of harmfulness of black of cabbage]. Vestnik zashchity rasteniy 1(91):52-55 (In Russian)
Mokryakova MV, Abdeeva IA, Piruzyan ES, Shaad NV et al (2010) [Diversity of effector genes in the genus Xanthomonas]. Mikrobiologiya 79(1):63-71 (In Russian)
Punina NV (2009) [Evaluation of genetic diversity of phytopathogenic bacteria of the genus Xanthomonas and development of molecular markers for their diagnostic]. Moscow. 188 p. (In Russian)
Plant Protection News, 2021, 104(2), p. 87-96
OECD+WoS: 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2021-104-2-14962
Full-text article
SELECTION OF TARGET GENES FOR PCR DIAGNOSTICS OF XANTHOMONAS ARBORICOLA
VIRULENT FOR CEREALS AND BRASSICAS E.I. Kyrova1*, A.N. Ignatov2
1All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia 2Russian University of People's Friendship, Moscow, Russia
*corresponding author, e-mail: ekirova1911@yandex.ru
Plant pathogenic xanthomonads virulent to wheat, rye, barley, tomato, sunflower, and brassicas were isolated in Russia in 2001-2008. Physiological tests and multilocus sequence typing analysis confirmed their position within the Xanthomonas arboricola species. The obtained draft genome sequence of representative strain 3004 from barley plants, which is also virulent to sunflower, brassicas, and chestnut, demonstrated an absence of the Type 3 Secretion System T3SS and an evidence for the lateral gene transfer of some other virulence genes from distantly related bacteria. It was concluded that T4SS genes can be used as the target for group-specific PCR analysis of the emerging pathogen. It was proposed to use virD4, virB3, virB4, and virB9 genes to design a detection system. After preliminary experiments with classic PCR for the chosen genes, primers and TaqMan(R) probe were designed to specifically amplify a 121 bp fragment of the VirD4 gene. Amplification products were obtained for all target Xanthomonas arboricola strains and were not detected in other Xanthomonas species, or in other pathogenic or epiphytic bacteria occurring on these host plants. The assay readily detected Xanthomonas arboricola infection in diseased plants and from bacterial colonies isolated on semi-selective media, and was more sensitive and specific than traditional plating methods.
Keywords: genome analysis, virulence genes, sunflower, real time PCR, seedborne infection Submitted: 10.03.2021 Accepted: 30.05.2021
© Kyrova E.I., Ignatov A.N., published by All-Russian Institute of Plant Protection (St. Petersburg). This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
