CC BY
6УДК 577.29:635.649
О.Г. Бабак, Т.В. Никитинская, Н.А. Некрашевич, К.К. Яцевич, А.В. Кильчевский
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГОМОЛОГИИ ГЕНА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NAC-NOR У ТОМАТА И ПЕРЦА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ПОЛИМОРФИЗМА
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
O.Babak@igc.by
Изучена гомология генов транскрипционного фактора NAC-NOR у Solanum lycopersicum и Capsicum annuum. На основе сравнительного анализа ДНК маркируемых областей третьего экзона аллелей nor и norc установлен 72-процентный уровень их сходства. Разработаны праймеры для выявления полиморфизма гена транскрипционного фактора NAC-NOR как внутри вида C. annuum, так и в пределах рода Capsicum. У C. annuum выявлен полиморфизм norc аллелей между острыми и сладкими формами. В изучаемой коллекции перца сладкого выявлены два аллеля — norc 424, norc 427, встречающиеся с одинаковой частотой. У острой формы Халапеньо, наряду с данными аллелями, выявлен аллель norc 415. У сорта Созвездие C. frutestens выявлен отличный от C. annuum аллель — norc 421. В результате двулетнего изучения форм перца острого, различающихся между собой аллелями norc, выявлено удлинение периода от всходов до начала созревания у образцов в следующем порядке: norc 427, norc 424, norc 415. Созданы гибриды для передачи полиморфизма аллеля norc 415 от острых форм к сладким и изучения его фенотипического проявления у перца сладкого.
Ключевые слова: Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, ДНК-маркер, NAC-NOR транскрипционный фактор.
Введение
Ген Nor кодирует транскрипционный фактор NAC-NOR, который выполняет важную роль регулирования экспрессии генов, контролирующих процессы созревания плодов и биосинтеза каротиноидов растений семейства Solanaceae. У томата данный ген расположен на 10-й хромосоме. Мутация nor, вызванная короткой делецией (2 п. н.) в данном гене, приводящей к сдвигу рамки считывания и образованию нефункционального белка, индуцирует повреждение в гене Psy-1, протеиновым продуктом которого является фитоин-синтаза — фермент, катализирующий синтез фитоина (предшественника ликопина) [1, 2]. Другим значимым воздействием на процесс созревания плодов является совместное действие транскрипционных факторов (ТФ) генов nor и rin в каскаде управления созреванием путем регуляции экспрессии генов, детерминирующих синтез этилена, причем ТФ гена nor имеет более глобальный эффект на этиленовое созревание плодов, чем ТФ гена rin [3].
Плоды Solanum lycopersicum и Capsicum annuum принадлежат к различным классам
по типу созревания — климактерическим и неклимактерическим. Созревание плодов томата напрямую зависит от повышения интенсивности дыхания и концентрации этилена [4, 5], в то время как для начала созревания неклимактерических плодов, в частности плодов перца, гормон этилен не требуется, он необходим для завершения процесса созревания. Это было продемонстрировано в различных исследованиях, включая анализ ингибирова-ния биосинтеза этилена и его восприятия [6], получение трансгенных растений с измененным биосинтезом этилена [7], посредством анализа томата, который нечувствителен к этилену по причине мутации в этилен-свя-зывающем домене NR этиленового рецептора [8]. В связи с этим ряд авторов считали действие ТФ генов nor и rin на созревание плодов перца незначительным. Однако исследованиями последних лет было доказано, что представители MADS-бокс и NAC-бокс генов играют важную роль в регулировании развития и созревания как климактерических, так и неклимактерических плодов [9-11]. Также существует ряд исследований, доказывающих
зависимость созревания неклимактерических плодов от этилена [12, 13]. В связи с вышеизложенным задачами данного исследования являются: сравнительный анализ гомологии гена транскрипционного фактора NAC-NOR у томата и перца, изучение полиморфизма данного гена и его фенотипического проявления у представителей рода Capsicum с целью идентификации его аллельного состава и разработки ДНК-маркеров для селекции на качество плодов и сроки их созревания.
Материалы и методы
В качестве исходного материала для анализа маркируемых областей гена транскрипционного фактора NAC-NOR (norc) использовали более 30 форм Capsicum annuum L., C. frutestens коллекции Института генетики и цитологии НАН Беларуси и филиала ФГБНУ ФНЦО — Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур.
Выделение ДНК проводили при помощи Genomic DNA Purification Kit («Thermo Scientific», США) из проростков перца согласно протоколу. Количество ДНК в образце определяли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (Швеция). ДНК-пробу для каждого сорта выделяли и анализировали в трехкратной повторности.
ПЦР-реакцию проводили в термоциклере Biometra T Professional Basic (Германия). Реакционная ПЦР-смесь объемом 15 мкл содержала 60-100 нг геномной ДНК, 2,5 mM dNTP Mix («Thermo Scientific», США), 1,4 единицы Tornado DNA-полимеразы в инкубационном буфере "F" («Праймтех», Республика Беларусь) и 5 pmol/^l олигонуклеотидных прай-меров («Праймтех», Республика Беларусь). ПЦР-реакцию проводили в Термоциклере Biometra T Professional Basic (Германия). На первоначальном этапе использовали прайме-ры, разработанные для идентификации полиморфизма у томата, далее, по результатам секвенирования маркируемой области гена у перца, — со специфическими праймерами, разработанными для идентификации выявленного полиморфизма.
Продукты ПЦР реакции разделяли методом электрофореза в 1,9% агарозном геле в присутствии бромистого этидия и документиро-
вали с помощью системы Bio-Rad GelDoc2000 (США). Размеры амплифицированных фрагментов определяли при использовании в качестве маркера молекулярного веса 100 bp Plus DNA ladder («Thermo Scientific», США).
Для определения нуклеотидных последовательностей гена ТФ NAC-NOR проводили секвенирование амплифицированных продуктов. Для этого фрагменты амплификации разделяли в однопроцентном агарозном геле, затем вырезали и очищали с использованием набора DNA Extraction Kit («Thermo Scientific», США) согласно методике производителя. Секвенирующие реакции выполняли с применением набора Big Dye® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) согласно методике производителя. Продукты секвенирующей реакции очищали с использованием колонок Centri-Sep™ («Applied Biosystems», США), высушивали в вакууме, растворяли в 20 мкл формамида, денатурировали нагреванием до 95 °C в течение 2 мин и далее проводили капиллярный электрофорез с использованием ДНК-секвенатора ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Компьютерную обработку данных, полученных в результате секвенирования, проводили в программе Sequencing Analysis Software v 5.2 («Applied Biosystems», США). Анализ гомологии нуклеотидных последовательностей участков генов (процент перекрытия и процент сходства последовательностей) проводили с использованием базы данных GenBank при помощи анализатора BLAST Национального центра биотехнологической информации США. Процент перекрытия — это отношение области перекрытия сравниваемых фрагментов при поиске сходства >60% методом Blast-анализа к общей длине сравниваемого участка *100%; процент сходства — это процент совпадения нуклеотидов в областях перекрытия сравниваемых последовательностей.
Результаты и обсуждение
Основываясь на филогенетической близости представителей семейства Solanaceae, проведена апробация ранее разработанных ДНК-маркеров для идентификации аллелей гена ТФ LeNAC-NOR томата (Nor, nor) на изучаемых коллекциях перца сладкого.
Был установлен 77,7% уровень сходства ну-клеотидной последовательности участка ДНК перца размером 169 п. н. (синтезированного с помощью маркера norF/R) с соответствующим фрагментом гена Nor у томата. Было предположено, что полноразмерный ген Nor томата и перца сладкого имеет высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей на всей протяженности. Нуклеотид-ная последовательность гена Nor томата была описана и депонирована в GenBank под номером AY573803. Подобраны пять пар прайме-
ров (табл. 1, рис. 1), последовательно перекрывающих полноразмерную последовательность гена ТФ LeNAC-NOR у томата.
При амплификации с разработанными прай-мерами на геномной ДНК перца шло образование определенных ПЦР-фрагментов в каждом из описанных случаев. Фрагменты, близкие по размеру к томатным, были вырезаны из геля, очищены и секвенированы. Для установления сходства секвенированных продуктов перца с нуклеотидными последовательностями в базе GenBank был проведен В^^поиск (табл. 2).
Таблица 1
Праймеры, перекрывающие последовательность гена Nor у томата
№ пары Праймер Последовательность праймера Размер синтезируемого фрагмента
1 NACNOR1F1 CTAAATTCCTTCTTGTTTATCATTTTCTCTC 574 п. н.
NACNOR1F2 TCATTTTCTCTCTTCCCAAAAA 555 п. н.
NACNOR1R AGTTGGTCATAGAAAACTTTGTGA
2 NACNOR2F GACCAACTTATAAAGATTTGAACTCG 485 п. н.
NACNOR2R CGCCCCGTTAGGATATTTTC
3 NACNOR3F AGGCAATATTCGGAGAGCAA 573 п. н.
NACNOR3R TGTCGAACCTCTTTCGGCTA
4 NACNOR4F GCCGAAAGAGGTTCGACATA 541 п. н.
NACNOR4R ACATTGAATTTATTCGAGTTTGTG
5 NACNOR5F TCGAATAAATTCAATGTTTCATTAGC 573 п. н.
NACNOR5R1 TGTTGTTGTTGAATCGAAGGA
NACNOR5R2 TTTGTTATAAATGTTCTTATTTGTTAATGTG 804 п. н.
NACNOR1F1
NACNOR1F2 I 1 <TACNOR2F Г •JACNOR3F NACNOR4F NACNOR5F J j
1 1 1
\ 1 NACNOR1R NACNOB Г Г .2R NACNOR3R NACNOR4R jf NorR , (NACN l OR5R)
NACNOR5R2
консервативная область
ген LeNAC-NOR томата (AY573803) (2885 п. н.) Рис. 1. Схема расположения праймеров на гене Nor томата (GenBank AY73803 2885 п. н.)
Таблица 2
Результаты Blast-анализа секвенированных участков ДНК Capsicum annuum с праймерами
для гена Nor томата
Нуклеотидная последовательность (номер доступа) Процент перекрытия Процент сходства
ДНК-фрагмент перца размером ~ 550 п. н., синтезируемого при участии маркера NACNOR1F2/1R:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum(AY702979) 77% 71%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048885) 44% 76%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (JF330775) 64% 70%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 550 п. н., синтезируемого при участии маркера NACNOR2F/2R:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048884) 28% 89%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (JF330777) 29% 86%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048883) 28% 79%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 1200 п. н., синтезируемого при участии маркера NACNOR3F/3R:
Хлоропластная ДНК перца Capsicum annuum (KR078313) 99% 99%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 600 п. н., синтезируемого при участии маркера NACNOR4F/4R:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048886) 96% 87%
ДНК хромосомы 3 Solanum pennellii (HG975442) 97% 83%
ДНК хромосомы 5 Solanum lycopersicum (HG975517) 96% 83%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 650 п. н., синтезируемого при участии маркера NACNOR5F/5R2:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum(JF330775) 86% 85%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048890) 97% 71%
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (JF330776) 71% 74%
Однако синтезированные фрагменты не обладали значимым сходством с нуклеотидным составом гена Nor томата (Solanum lycopersicum) (AY573803). При этом ряд фрагментов имел высокий процент перекрытия и сходства с определенными областями ДНК C. annuum.
Большинство фрагментов геномной ДНК, имеющей высокий процент перекрытия и сходства с выделенными нами участками ДНК C. annuum, на сегодняшний день не анноти-
рованы. В связи с этим для установления ну-клеотидной последовательности гена Nor у C. annuum на большей протяженности было решено секвенировать фрагменты ДНК перца сладкого, синтезируемые с помощью сочетания томатных праймеров из серий Nor (NorF/ NorR) и NACNOR, фланкирующих область, маркируемую праймерами NorF/NorR (рис. 1): NorF/ NACNOR5R, NorF/NACNOR5R2, NACNOR5F/ NorR, NACNOR4F/NorR, NACNOR3 F/NorR.
С этой целью была проведена градиентная ПЦР с указанными праймерами на геномной ДНК перца с постепенным понижением температуры отжига с 55 °С до 42 °С (рис. 2). При температуре отжига около 45 °С с указанными парами праймеров шло образование определенных ПЦР-фрагментов в каждом из описанных случаев. Фрагменты, указанные черными стрелками (рис. 2), были вырезаны из геля, очищены и секвенированы у двух форм перца сладкого Л-160-10 и Игрок. Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей исследуемых образцов перца выявил их идентичность, кроме участка ДНК размером около 430 п. н., синтезируемого при участии праймеров N0^/ (рис. 2А).
Так, в данном фрагменте у сорта Игрок в отличие от образца Л-160-10 с 297 нуклео-тида присутствует делеция в три основания (АСА) (рис. 3).
Для установления сходства полученных секвенированных участков ДНК перца с ну-клеотидными последовательностями в базе GenBank был проведен Blast-поиск. Его результаты представлены в табл. 3. Видно, что все установленные нуклеотидные последовательности, кроме фрагмента размером около 430 п. н., не обладали значимым сходством с нуклеотидным составом гена Nor томата (Solanum lycopersicum — AY573803). Только ДНК-фрагмент перца длиной около 430 п. н., синтезированный с применением праймеров norF и NACNOR5R, обладал 72-процентным уровнем сходства с нуклеотидной последовательностью гена Nor томата (AY573803) (рис. 3). После получения данных результатов было предложено назвать ген перца, гомологичный гену Nor томата, геном norc [14]. Таким образом, скомбинировав праймеры для различных участков гена Nor томата из разных
Рис. 2. Электрофорез ПЦР с парами праймеров А — NorF/NACNOR5R, Б — NorF/NACNOR5R2, В — NACNOR5F/NorR, Г — NACNOR4F/NorR, Д — NACNOR3F/NorR на геномной ДНК перца сладкого
Перец nor аллель сорта 5/3 Перец nor аллель сорта 6/2 Тамот Nor аллель (AY573803)
Перец nor аллель сорта 5/3 Перец nor аллель с орта 6/2 Тамот Nor аллель (AY573803)
ATGATTGGGTTTTATGTCGAATTTACAAGAAGAATAACAGACAAAGGCCAATAGATATTCATGAGAGGGATGATATGAATGATATAATGGTACCACCATTATTTTTTCAACAAAAAAC ATGATTGGGTTTTATGTCGAATTTAC АAGAAGДАТАAC AGAC AAAGGC С AATAGATATTC ATGAGAGGGATGATATGAATGATATAATGGTACC АС С АТТАТТТТТТС ААС ААААААС. ATGATTGGGTTTTATGTCGift.АТТТАСАAGAAGAАТААСАС АС ААAGGTCC ATAGAT------GATTTGC ATGATATGT-TGGGАТС—GATACCACAAAATGTACCAAATTCAATATT
томатный пранмер NorF
ACAAGAAATTAAACCTTCAAATTATGGTACA---TTGCTCGAAAACGAATCGAATAATATGTACGATGGAATTATAAATAACACGAGCAATATGATCATCAACAATAAT-GA-------
ACAAGAAATTAAACCTTCAAATTATGGTACA---TTGCTCGAAAACGAATCGAATAATATGTACGATGGAATTATAAATAACACGAGCAATATGATCATCAACAATAAT-GA-------
ACAAGGAATAAAGCCTTCAAACTATGGTACAATATTGCTCGAAAATGAATCGAATA---TGTACGATGGAATTATGAATAACACGAACGATATTATCAACAATAATAATAGATCCATTC
Перец nor аллель сорта 5/3 Перец nor аллель сорта 6/2 Тамот Nor аллель (AY573803)
Перец nor аллель сорта 5/3 Перец nor аллель сорта 6/2 Тамот Nor аллель (AY573803)
-ACAGTTATCGTCAAAG------------------TTGTACTGGAATAATGTCGATGAAACAACAACCACAACAACAA------------------С А AC А AC А AC jj---1------GAC
- AC AGTT АТС GTC A A AG------------------TTGTACTGGAATAATGTCGATGAAACAACAACCACAACAACAA------------------СААСААСААСААСА------GAC
CACAAATATCGTCAAAGAGAACGATGCATGGAGGTTTGTATTGGAATAACGACGAAGCAACAACAACAACAACAACTATTGATAGGAACCATTCTCCAAATACAAAAAGGTTCCTTGTT
делеция
2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630 2640
GCGAACAATGGGGACGATGGACTTAACAATATGAATAATGCGCGAATTACTCAACATGATCAGAGTAGCTCCATCGCCAGTTTCCTGAGCCAACTTCCTCAAAATCCTTCGATTCAACAACAACAACA
GCGAACAATGGGGACGATGGACTTAACAATATGAATAATGCGCGAATTACTCAACATGATCAGAGTAGCTCCATCGCCAGTTTCCTGAGCCAACTTCCTCAAAATCCTTCGATTCAACAACAACAAC
GAGAACAACGAGGACGATGGACTTAACATGAATAATATTTCGCGAATTACAAATCATGAACAAAGTAGCTCCATTGCCAATTTCCTGAGCCAGTTTCCTCAAAA}fCCTTCGATTCAACAACAACAACA|
томатный пранмер NACNOR5R
Рис. 3. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена Ывг перца сортов Игрок (5/3) и Л-160-10 (6/2)
с соответствующей последовательностью томата
Таблица 3
Результаты Blast-анализа установленных последовательностей ДНК Capsicum annuum
с праймерами к генам Nor и шгс
Нуклеотидная последовательность (номер доступа) Процент перекрытия Процент сходства
ДНК-фрагмент перца размером ~ 1000 п. н., синтезируемого при участии праймеров NACNOR4F/NorR:
Теоретически предсказанная не охарактеризованная мРНК перца Capsicum annuum LOC107854041 (XM_016699043)* 93% 76%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 800 п. н., синтезируемого при участии праймеров NACNOR4F/NorR:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (GU048883) 92% 79%
ДНК хромосома 9 S .lycopersicum (HG975521)* 94% 83%
ДНК хромосома 8 S. lycopersicum (HG975520)* 89% 83%
ДНК хромосома 11 S. lycopersicum (HG975523)* 85% 83%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 400 п. н., синтезируемого при участии праймеров NACNOR5F/NorR:
Теоретически предсказанная не охарактеризованная ncRNA перца Capsicum annuum LOC107860985 (XR 001671692) 81% 76%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 300 п. н., синтезируемого при участии праймеров NACNOR5F/NorR:
Геномная ДНК перца Capsicum annuum (JF330777) 43% 81%
ДНК-фрагмент перца размером ~ 300 п. н., синтезируемого при участии праймеров NorF/NACNOR5R:
Теоретически предсказанная не охарактеризованная miscRNA перца Capsicum annuum LOC107877263 (XR 001676311) 83% 74%
ДНК-фрагмент перца сорта Игрок размером 427 п. н., синтезируемого при участии праймеров
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC перца Capsicum annuum LOC107845296, транскрипционный вариант X2 (XM_016689532) 100% 99%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC перца Capsicum annuum L0C107845296, транскрипционный вариант X1 (XM 016689531) 100% 99%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC картофеля S. tuberosum L0C102593641, (XM_006362885) 100% 73%
Ген nor томата S .lycopersicum (AY573803) 100% 72%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC томата S. pennellii L0C107032538, (XM 015234146) 100% 72%
ДНК фрагмент перца сорта Л-160-10 размером 430 п. н., синтезируемого при участии праймеров
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC перца Capsicum annuum L0C107845296, транскрипционный вариант X2 (XM 016689532) 100% 100%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC перца Capsicum annuum L0C107845296, транскрипционный вариант X1 (XM 016689531) 100% 100%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC картофеля S. tuberosum L0C102593641, (XM_006362885) 100% 73%
Продолжение табл. 3
Нуклеотидная последовательность (номер доступа) Процент перекрытия Процент сходства
Ген nor томата S .lycopersicum (AY573803) 100% 72%
Теоретически предсказанная мРНК транскрипционного фактора NAC томата S. pennellii LOC107032538, (XM_015234146) 100% 72%
Примечание. * — неаннотированные последовательности ДНК или функции кодируемых белков пока неизвестны
серий, удалось установить нуклеотидный состав консервативного домена гена norc на протяженности 430 п. н. Также был обнаружен полиморфизм в гене noгс у сорта Игрок — де-леция в три основания (АСА), которая приводит к выпадению одной аминокислоты (триптофан) из соответствующего белка.
В табл. 3 также представлены результаты сравнения полученных фрагментов с теоретически предсказанными мРНК транскрипционного фактора NAC у ряда представителей семейства Solanaceae. Следует отметить, что полная аннотация десятой хромосомы перца (NC_029986.1), на которой локализован ген-гомолог транскрипционного фактора томата LeNAC-NOR (транскрипционный фактор NAC 56 C. annuum (XM_016689531, XM_016689532), появилась в базе данных GenBank 05.05.2016 г. после того, как нами была проведена описанная выше работа. Теоретически предсказанные мРНК транскрипционного фактора NAC перца C. annuum (XM_016689532, XM_016689531) представляют собой варианты альтернативного сплайсинга при созревании мРНК после транскрипции
с одного и того же участка гена (рис. 4). Полученные сведения о нуклеотидном составе консервативного домена гена Nor у перца полностью согласуются с этими данными. Секве-нированный участок входит в состав 3 экзона гена транскрипционного фактора NAC 56.
В базе данных GenBank, помимо геномной ДНК полноразмерного гена NAC-NOR томата S. lycopersicum (AY573803), депонирована и соответствующая ему мРНК (AY573802). Попарное сравнение нуклеотидных последовательностей мРНК томата и перца показывает уровень сходства между ними около 80%.
Установив пару праймеров, которая четко амплифицирует фрагмент в консервативной области norc гена, и, учитывая, что полиморфизм в данной области у томата приводит к нарушению процесса созревания плодов, было проведено типирование коллекции с используемой парой праймеров (NorF/NACNOR5R). ДНК-скрининг разнообразного материала рода Capsicum (31 образец) с данной парой прайме-ров позволил выявить 4 различных фрагмента размерами 415, 421, 424, 427 пар оснований (рис. 5, табл. 4).
экзон 1 экзон 2 экзон 3
Рис. 4. Структура гена транскрипционного фактора NAC 56 у C.annuum (база данных GenBank [15])
Рис. 5. Результаты фрагментного анализа образцов перца с применением праймеров NorF/NACNOR5R
Таблица 4
Результаты ДНК-типирования образцов рода Capsicum с NorF/NACNOR5R праймерами
№ п/п Образец Аллель № п/п Образец Аллель
1 Оранжевое наслаждение 427 17 Солнышко 427
2 Игрок 424 18 Jmins 424
3 Л 160-10 427 19 Pramidal 424, 427
4 Л 45-11 427 20 2итгМ 424
5 Мулат F1 424, 427 21 Л236/09 424
6 Желтоплодный 427 22 Сладкий шоколад 427
7 Златодор 424 23 Исимо 427
8 Сиреневый 424 24 Желтый букет 424
9 Шоколадная красавица 427 25 Отелло 427
10 Фиолетовый красавец 424 26 Белоснежка 427
11 Л-24 424, 427 27 Черный красавец 427
12 Оранжевое чудо 424, 427 28 Чырвоны магнат 424
13 2о^Као 424 29 Халапеньо 415,424, 427
14 Немезис 427 30 С. frutestens Рябинушка 424
15 Ами 424 31 С. frutestens Созвездие 421
У форм перца сладкого выявлены фрагменты размером 424 и 427 п. н. У перца острого (С. аппиит var. ¡ощит), наряду с данными фрагментами, выявлен ампликон размером 415 п. н. У вида С. frutescens выявлен отличный от С. аппиит полиморфизм данного фрагмента гена погс — 421 п. н.
Выполнен сравнительный анализ четырех секвенированных ампликонов путем выравнивания нуклеотидных последовательностей гена погс сортов Л-160-10, Игрок, Халапеньо и С. уГи-testens с соответствующими последовательностями теоретически предсказанных мРНК из базы данных GenBank (рис. 6). Выравнивание полученных сиквенсов на последовательности мРНК С. аппиит базы данных GenBank позволило выявить следующий полиморфизм:
• ампликон размером 427 п. н., синтезированный у образца Л-160-10 и других форм С. аппиит, характеризовался наличием трех
по сравнению с мРНК С. аппиит базы данных GenBank;
• ампликон размером 424 п. н., синтезированный у сорта Игрок и других форм С.аппиит, характеризовался наличием делеции размером 3 п. н. (АСА) по сравнению с фрагментом 427 п. н., которая приводит к выпадению одной аминокислоты (триптофан);
• ампликон размером 421 п. н., синтезированный у сорта Созвездие (С. frutescens), содержит 2 и делецию в шесть оснований (АСААСА), приводящую к выпадению двух триптофановых аминокислотных остатков;
• ампликон размером 415 п. н., выявленный только у сорта Халапеньо перца острого, содержит 3 2 делеции: одна — аналогичная С. frutescens, вторая — в 9 п. н. на расстоянии в 11 п.н. от первой, вызывает сдвиг рамки считывания, приводящий к невозможности трансляции нормального белка.
С. axaaam mRNA ХМ 016689532 С. апшишmRNA ХМ 016689531 Л-160-10 Игрок С. fiutesceiis Халапеньо
С. значат raRNA ХМ 016689532 С. arniuumraRNA ХМ 016689531 Л-160-10 Игрок С. fiutesceiis Халапеньо
С. аппиитraRNA ХМ 016689532 С. ли™mRNA ХМ 016689531 Л-160-10 Игрок С. fiutesceiis Халапеньо
С. аппиит raRNA ХМ 016689532 С. аммиит raRNA ХМ 016689531 Л-160-10 Игрок С. fiutesceiis Халапеньо
720
730
740
7s0
760
770
760
790
аоо
atgattgggttttatgtagaatttacaagaagaataacagacaaaggccaatagatattcatgagagggatgatatgaatgatataatggta atgattgggttttatgtagaatttacaagaagaataacagacaaaggccaatagatattcatgagagggatgatatgaatgatataatggta atgattgggttttatgtcgaatttacaagaagaataacagacaaaggccaatagatattcatgagagggatgatatgaatgatataatggta atgattgggttttatgtcgaatnacaagaagaataacagacaaaggccaatagatattcatgagagggatgatatgaatgatataatggta atoattgcottttatgtcoaatttacaagaagaataacagacaaagoccaatagatattcatgagagogatgatatgaatgatataatggta iatgattgggttttatgtcitl.atrracaagaagaataacagacaaaggccaatagatattcatgagagggatgatatgaatgatataatggta
тоиатаьш лранмер NorF
810
820
830
840
850
860
870
880
890
ccaccattai 1 i i i icaacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatggtacattgctcoaaaacgaatcgaataatatgtacoatgg ccaccattattttttcaacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatggtacattgctcgaaaacgaatcgaataatatgtacgatgg ccaccattatttttrcaacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatggtacattgctccaaaacgaatcgaataatatctacgatgg ccaccattaпi i i1caacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatggtacattgctcgaaaacgaatcgaataatatgtacgatgg ccaccattatrrtttcaacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatcgtacattgctcgaaaacgaatcgaataatatgtacgatgc ccaccattattttttcaacaaaaaacacaagaaattaaaccttcaaattatggtacattgctcgaaaacgaatcgaataatatgtacgatgg
»00
910
920
930
940
9s0
.970"
Ш
aattataaataacacgagcaatatgatcatcaacaataatgaacagttatcgtcaaagttgtactggaataatgtcgatgaaacaacaacca aattataaataacacgagcaatatgatcatcaacaataatgaacagttatcgtcaaagttgtactggaataatgtcgatgaaacaacaacca aattataaataacacgagcaatatgatcatcaacaataatgaacagttatcgtcaaagttgtactggaataatgtcgatgaaacaacaacca aattataaataacacgagcaatatgatcatcaacaataatgaacagttatcgtcaaagttgtactggaataatgtcgatgaaacaacaacca aattataaataacacgagcgatatgatcatcaacaataatgaacagctatcotcaaagttotactggaataatgtcgatgaaacaacaacca aattataaataacacgagcgatatgatcatcaacaataatgaacagttatcttcaaagttgtactggaataatgtcgatgaaacaacaacca
990
1000
.1010
,1020
,1030
1040
.1050
,1060
1070
caacaacaacaacaacaacaacagacgcgaacaatggggacgatggacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt caacaacaacaacaacaacaacagacgcgaacaatggggacgatggacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt caacaacaacaacaacaacaacagacgcgaacaatgcggacgatgoacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt
CAACAACAACAACAA:ЛАСЛ£22
caacaacaacaacaacj ccacaacaacaacaacj
acgcgaacaatggggacgatggacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt jacgcgaacaatggggacgatggacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt
;acocgaacaa|-------^Ikwacttaacaatatgaataatgcgcgaattactcaacatgatcagagt
C. aiuiuum raRNA XM 016689532 C. annuura raRNA XM 016689531 Л-160-10 Игрок С. fiutesceiis Халапеньо
107jt 1080 1090
It n 3S9 36$ 36 -354
деледня
ж
деления
.1110
ГГ20
.1130
agctccatcgccagtttcctcagccaacttcctcaaaatccgtcaattcaacaacaacaaca.
agctccatcgccagtttcctgagccaacttcctcaaaatccgtcaattcaacaacaacaaca agctccatcgccagtttcctgagccaacttcctcaaaatccttcgattcaacaacaacaaca agctccatcgccagtttcctgagccaacttcctcaaaatccttcoattcaacaacaacaaca agctccatccccagtttcctgagccaacttcctcaaaatccttcgattcaacaacaacaaca AGCTCCATCGCCAGTTTCCTGAGCCAACTTCCTCAAAj(rcCTrcGATTCAACAACAACAACA|
томатный лранртер
NACNOR5R
Рис. 6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена погс сортов перца с соответствующими последовательностями мРНК из базы данных вешВаик
Для изучения фенотипического проявления выявленного полиморфизма из гетерозиготных форм методом ДНК-типирования в следующем поколении отобраны линии, отличающиеся между собой лишь полиморфизмом по данному аллелю. У перца сладкого были отобраны формы с погс 424 и погс 427, у перца острого — погс 415, погс 424 и погс 427. Проведено изучение проявления фенотипических признаков (особенности протекания фенологических фаз растений и созревания плодов) в зависимости от выявленного генетического полиморфизма аллеля погс (рис. 7). Анализ четырех семей перца сладкого не выявил достоверных отличий между погс 424 и погс 427 формами. Из формы острого пеца Халапеньо (С. аппиит var. ¡о^ит) отобраны гомозиготные растения по аллелям погс 415, погс 424 и погс 427. Проведено двулетнее изучение (2017-2018 гг.) особенностей протекания фаз развития растений и созревания плодов
в зависимости от выявленного генетического полиморфизма аллелей гена погс (рис. 7, 8).
В целом было выявлено удлинение фаз развития растений и срока созревания у формы погс 415. Установлено, что гомозиготные растения с аллелем погс 415 имели более длительный срок созревания плодов в среднем на 8 дней по отношению к растениям с гомозиготным аллелем погс 424 и на 15 дней по отношению к растениям с гомозиготой погс 427.
В дальнейших исследованиях представляет интерес введение аллеля погс 415, характерного для острого перца, в формы сладкого перца и изучение его фенотипического проявления на них. Возможно, действие аллеля погс 415 будет более выраженным, так как формы сладкого перца имеют более крупные, толстостенные плоды. Для этого выполнена гибридизация между различными формами сладкого перца и сортом Халапеньо, выращены гибриды и получены их семена. В 2019
А - растения № 12 и № 13 (аллели погс 424/427); Б - растения № 2 и № 4 (аллели погс 415/427); В - растения № 11 и № 18 (аллель погс 415); Г - растения № 1 и № 7 (аллель погс 427);
Д - растения № 3 и № 5 (аллель погс 424)
Рис. 7. Развитие растений перца формы Халапеньо с различными аллелями погс на различных этапах
вегетационного периода
Рис. 8. Степень развития плодов перца формы Халапеньо с различными аллелями погс 17.09.2018 года
(А - аллелем погс 415, Б - погс 424, В - погс 427)
году планируется получение сладких форм перца с аллелем norc 415 с использованием разработанных маркеров к гену norc, а также маркеров к аллелю гена Puni [16], определяющему накопление капсаицина и острый вкус плодов C. annuum.
Заключение
Выполнены исследования по изучению гомологии генов транскрипционного фактора LeNAC-NOR у томата и перца, расположенного на 10 хромосоме. На основе сравнительного анализа маркируемых областей третьего экзо-
на размером 430 п. н. аллелей nor и norc установлен 72-процентный уровень их сходства.
Пара праймеров NorF и NACNOR5R позволяет выявлять как внутривидовой полиморфизм гена NOR у C. аnnuum, так и в пределах рода Capsicum. У C. annuum выявлен полиморфизм norc аллелей между острыми и сладкими формами. В изучаемой коллекции перца сладкого выявлены два аллеля — norc 424 и norc 427, встречающиеся с одинаковой частотой. У острой формы Халапеньо, наряду с данными аллелями, выявлен аллель norc 415. У сорта Созвездие C. frutestens выявлен отличный от C. annuum аллель — norc 421.
В результате двулетнего изучения трех форм острого перца, полученных методом ДНК-тирования образцов формы Халапеньо, различающихся между собой аллелями norc, выявлены отличия по срокам прохождения фаз развития растений. Период от всходов до начала созревания увеличивался у форм в следующем порядке: norc 427, norc 424, norc 415 соответственно с разницей между образцами 7-8 дней.
Созданы гибриды для передачи полиморфизма аллеля norc от острых форм к сладким и изучения его фенотипического проявления у перца сладкого.
Список использованных источников
1. Fraser, P.D. Carotenoid Biosynthesis during Tomato Fruit Development / P.D. Fraser // Plant Physiology. — 1994. — Vol. 105. — P. 405-413.
2. Fray, R., Grierson, D. Identification and genetic analysis of normal and mutant phy-toene synthase genes of tomato by sequencing, complementation and co-suppression / R. Fray, D. Grierson // Plant Mol. Biol. — 1993. — V. 22. — P. 589-602.
3. Osorio, S. Systems biology of tomato fruit development: combined transcript, protein, and metabolite analysis of tomato transcription factor (nor, rin) and ethylene receptor (Nr) mutants reveals novel regulatory interactions / S. Osorio // Plant Physiology. — 2011. — Vol. 157. — P. 405-425.
4. Lelievre, J.M. Ethylene and fruit ripening / J.M. Lelievre, A. Latche, B. Jones, M. Bouzayen, J.C. Pech // Physiologia Plantarum. — 1997. — Vol. 101. — P. 727-739.
5. Barry, C.S. Ethylene and Fruit Ripening /
C.S. Barry, J.J. Giovannoni // Journal Plant Growth Regul. — 2007. — Vol. 26. — P. 143-159.
6. Yen, H. The tomato Never-ripe locus regulates ethylene-inducible gene expression and is linked to a homologue of the Arabidopsis ETR1 gene / H. Yen, S. Lee, S. Tanksley, M. Lanah-an, H.J. Klee, J.J. Giovannoni // Plant Physiology. — 1995. — Vol. 107. — P. 1343-1353.
7. Picton, S. Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing an antisense ethylene-forming enzyme transgene / S. Pic-ton, S.L. Barton, M. Bouzayen, A.J. Hamilton,
D. Grierson // The Plant Journal. — 1993. — Vol. 3. — P. 469-481.
8. Lanahan, M.B. The Never Ripe mutation blocks ethylene perception in tomato / M.B. Lanahan, H.C. Yen, J.J. Giovannoni, H.J. Klee // The Plant Cell. — 1994. — Vol. 6. — P. 521-530.
9. Vrebalov, J. A MADS-box gene necessary for fruit ripening at the tomato Ripening-inhibitor (Rin) locus / J. Vrebalov, D. Ruezinsky, V. Padmanabhan, R. White, D. Medrano, R. Drake, W. Schuch, J. Giovannoni // Science. — 2002. — Vol. 296. — P. 343-345.
10. Giovannoni, J.J. Genetic regulation of fruit development and ripening / J.J. Giovannoni // The Plant Cell. — 2004. — Vol. 16. — P. 170-180.
11. Itkin, M. TOMATO AGAMOUS-LIKE 1 is a component of the fruit ripening regulatory network / M. Itkin, H. Seybold, D. Breitel, I. Ro-gachev, S. Meir, A. Aharoni // The Plant Journal. — 2009. — Vol. 60. — P. 1081-1095.
12. Li, L. The regulation mode of RIN transcription factor involved in ethylene biosynthesis in tomato fruit / L. Li, B. Zhu, P. Yang, D. Fu, Y. Zhu, Y. Luo // J. Sci Food Agric. — 2011. — Vol. 91. — P. 1822-1828.
13. Fujisawa, M. Identification of potential target genes for the tomato fruit-ripening regulator RIN by chromatin immunoprecipitation / M. Fujisawa, T. Nakano, Y. Ito // BMC Plant Biology. — 2011. — Vol. 11, № 26. — P. 1-16.
14. Babak, O.G. Development of DNA-markers to fruit quality genes of sweet pepper (Capsicum annuum L.) / O.G. Babak, T.V. Nikitinskaya, K.K. Yat-sevich, N.A. Nekrashevich, A.V. Kilchevsky // XVIth EUCARPIA Capsicum and Eggplant Working Group Meeting. Kecskemet, Hungary, 12-14 September 2016. — P. 137-144.
15. GenBank NCBI [Electronic resource]. —
Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/107845296. — Date of access: 27.11.2018.
16. Wyatt, L.E. Development and application of a suite of non-pungency markers for the
Punl gene in pepper (Capsicum spp.) / L.E. Wyatt, N.T. Eannetta, G.M. Stellari, M. Mazou-rek // Molecular Breeding. — 2012. — Vol. 30, № 3. — P. 1525-1529.
O.G. Babak, T.V. Nikitinskaya, N.A. Nekrashevich, K.K. Yatsevich, A.V. Kilchevsky
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE GENE HOMOLOGY OF THE NAC-NOR TRANSCRIPTION FACTOR IN TOMATO AND PEPPER AND ITS POLYMORPHISM STUDY
Institute of Genetics and Cytology of NASB Minsk, 220072, the Republic of Belarus
Genes' homology of the NAC-NOR transcription factor was studied in Solanum lycopersicum and Capsicum annuum. Based on a comparative analysis of DNA marked regions of the 3rd exon of nor and norc alleles, their 72.0% similarity level was established. Primers were developed to identify gene polymorphism of the NAC-NOR transcription factor both within the C. annum species and the Capsicum genus. In C. annuum, the norc allele polymorphism between hot and sweet forms was detected. In the studied sweet pepper collection, two occurring with the same frequency alleles were found — norc 424 and norc 427. Alongside those alleles, the norc 415 allele was identified in the hot form Jalapeno. In the C. frutestens variety (Sozvezdiye), the norc 421 allele was identified, which is different from C. annuum. After a two-year study of hot pepper forms differing from each other in norc alleles, the extended period from sprouting prior to the onset of maturation was found in the samples in the order as follows: norc 427, norc 424, norc 415. Hybrids were developed to transfer the norc415 allele from hot to sweet forms and to study its phenotypic manifestation in sweet pepper.
Key words: Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, DNA-marker, NAC-NOR transcription factor.
Дата поступления статьи: 14 января 2019 г.
