CC BY
12УДК 577.21:575.22:575.162:582.951.4
О. Г. Бабак, Е. В. Дрозд, Н. А. Некрашевич, Н. В. Анисимова, К. К. Яцевич, А. В. Кильчевский
НОВЫЙ АЛЛЕЛЬ ГЕНА GOLDEN 2-LIKE, ЕГО ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ И СЕЛЕКЦИОННОЕ ЗНАЧЕНИЕ У SOLANUM
LYCOPERSICUM
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: o.babak@igc.by
В результате исследования полиморфизма гена транскрипционного фактора Golden 2-like найден новый аллель U-del52. Установлено, что делеция в 52 п. н. (конец экзона 2 - начало интрона 2) в гене U ведет к выпадению экзона 2 из зрелой мРНК при ее сплайсинге и синтезу белковой последовательности без MYB-like SANT домена, что изменяет ответную реакцию растения на факторы окружающей среды, прежде всего на интенсивность солнечного света. Выявлено фенотипическое проявление данного аллеля: светло-зеленые плоды со слабым увеличением концентрации хлорофилла у плодоножки на стадии технической спелости, более равномерное распределение пигментов в плодах по сравнению с нормальным аллелем U гена GLK2. Разработан молекулярный SCAR маркер U-del52 для выявления данного аллеля. Показана более высокая концентрация антоциана у плодоножки у форм с сочетанием аллелей U и Antl и равномерное распределение по поверхности плода у образцов с аллелями U-del52 и Antl. Создан новый селекционный материал для более детального изучения взаимодействия аллелей при накоплении пигментов в плодах и селекции, направленной на улучшение качества плодов.
Ключевые слова: Solanum lycopersicum, полиморфизм гена GLK2, регуляция синтеза пигментов, ДНК маркеры.
Введение
Ген Golden 2-like является одним из двух генов транскрипционного фактора GLK в растениях. На начальных этапах изучения GLK транскрипционных факторов их относили к MYB ТФ из-за наличия MYB ДНК-связы-вающего домена в составе. Однако последние исследования по сравнительному анализу последовательностей белков и генов позволили выделить отдельную филогенетическую группу — надсемейство GARP специфичных для растений факторов транскрипции [1-3]. Белки GLK составляют отдельную группу внутри надсемейства. В целом белки надсемейства GARP участвуют в восприятии сигналов окружающей среды (свет, уровень питательных элементов и др.) и регуляции развития хло-ропластов, колебания циркадных часов, гормональной сигнализации [1-3]. Большинство GLK ТФ содержат два высококонсервативных домена: ДНК-связывающий домен MYB и С-концевой (GCT) бокс [3]. Данные белки прежде всего регулируют способность к све-
тостимулированию фотосинтеза путем контроля образования хлоропластов. Возможность генетической регуляции уровня фотосинтеза и накопления вторичных метаболитов путем изменения экспрессии и структуры генов GLK ТФ вызывает широкий интерес исследователей в различных странах и имеет важное практическое значение [2-8].
Синтез GLK белков определяется парой генов GLK1 и GLK2, достаточно хорошо изученных у кукурузы, риса, арабидопсиса, овса, томата и других культур [2-5]. Также в литературе представлены данные об особенностях экспрессии GLK1 и GLK2 в тканях растений с C3 и С4 фотосинтетическими путями [6-8].
A. L. T. Powell и др. [9] идентифицировали гены GLK1 и GLK2 у томата и показали, что аллель U гена SlGLK2 определяет накопление и распределение хлорофилла в развивающихся плодах и приводит к образованию плодов с темно-зеленым пятном у плодоножки. Авторы выяснили, что однонуклеотидная инсерция аденина (A) в первом экзоне гена GLK2 тес-
но связана с другим известным фенотипом — uniform ripening (u). Данная мутация приводит к сдвигу рамки считывания, образованию раннего стоп-кодона и, как следствие, синтезу нефункционального белка. Плоды с гомозиготным генотипом по аллелю u имеют однородную светло-зеленую окраску на этапе начала созревания, что может быть внешне привлекательным, однако накопление хлорофилла, каротиноидов и сахаров у форм с u аллелем меньше, чем с нормальным U аллелем.
C. V. Nguyen и др. [10] в своих работах показали, что гены GLK1 и GLK2 у томата кодируют функционально сходные пептиды, при этом дифференциальная экспрессия делает ген GLK1 более важным в листьях, в то время как действие гена GLK2 преобладает в плодах. Данные результаты показывают большую важность гена GLK2 в селекции на улучшение качества плодов по сравнению с GLK1.
В ранее выполненных исследованиях на основе данных по полиморфизму гена GLK2 [9] нами разработан SCAR маркер u-7A, позволяющий дифференцировать формы томата по наличию в них аллелей u или U. Других полиморфизмов данного гена в литературе не описано. ДНК-маркирование известных аллелей и фенотипическая оценка широкой коллекции форм томата по признаку накопления и распределения пигментов на стадии технической спелости выявила новые фенотипы, отличные от двух вышеописанных. В связи с чем целью нашей работы был поиск нового полиморфизма гена GLK2 и оценка его значимости в селекции, направленной на улучшение качества плодов томата. Для этого были поставлены следующие задачи: оценить наблюдаемое фенотипическое проявление признака «накопление и распределение пигментов в плодах томата на стадии начала созревания плодов (на стадии технической спелости)»; выполнить ресиквенс гена Golden 2-like у форм Solanum lycopersicum с различным распределением пигментов (хлорофиллов и антоциа-нов) в плодах; оценить влияние выявленного генетического полиморфизма GLK2 на структуру мРНК, аминокислотной последовательности, на фенотип плодов томата; подобрать праймеры для ДНК-типирования выявленных полиморфизмов и оценить возможность маркирования новых фенотипических проявлений
накопления и распределения пигментов в плодах на основе выявленных структурных изменений последовательности изучаемого гена.
Материалы и методы
Объектами для исследований полиморфизма гена GLK2 являлись константные формы c различным фенотипическим проявлением признака «накопление и распределение пигментов в плодах на стадии технической спелости», 8 диких видов (подвидов): S. pimpinellifolium, S. humboldtii, S. glandulosum, S. peruvianum, S. chilense, S. cheesmanii, S. paviflorum, S. hirsutum. Для изучения связи выявленных полиморфизмов гена GLK2 с фенотипом, а также для изучения связи между аллельным составом гена и накоплением антоцианов использовались популяции F2 с различным составом аллелей генов Anthocyaninl (Antl) Golden 2-like (GLK2): 157 образцов Индиго (Antl, U) x Дачный (antl, U-del52) и 79 образцов F2 Индиго (Antl, U) x № 17-2020 (antl, u).
Выделение ДНК проводили при помощи набора реагентов компании Праймтех из молодых верхушечных листьев растений томата согласно протоколу производителя. Количество ДНК в образце определяли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro.
Нуклеотидные последовательности гена GLK2 у образцов S. lycopersicum определяли путем секвенирования. Для этого фрагменты амплификации, полученные на геномной ДНК с подобранными геноспецифическими праймерами на основе последовательности участка хромосомы 10 томата (NC_015447), где локализован ген U (табл. 1), были секве-нированы с применением набора Big Dye® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно методике производителя. Для дизайна праймеров использовали программу Primer-BLAST на сайте Центра биотехнологической информации NCBI [11]. Продукты секвенирующей реакции очищали спиртовым осаждением и растворяли в 20 мкл формамида, денатурировали нагреванием до 95 °С в течение 2 мин и далее проводили капиллярный электрофорез с использованием ДНК-секвенатора ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Компьютерную обработку данных, полученных в результате секвенирования, проводили в программе
Таблица 1
Праймеры для секвенирования гена GLK2 у томата
Наименование праймера Область секвенирования Последовательность праймера, 5' ^ 3' Температура отжига, °С Размер ПЦР продукта, п. н.
U-F1/R1 5' UTR - экзон 1 TGATGTCACCAAATTCTTCATCCT 60 1 168
ACGACTAGAACCGTCAACGA
U-F2/R2 Экзон 1 - экзон 2 TGTGAAGAACCTGCTATTCATGG 60 1 171
TCCCAAATTGCAAAAATGGCGATA
U-F3a/R3 Конец экзона 2 - экзон 4 GAGCTTATGGCAACTCATGGTC 60 1 172
CGCTGATGTTATTGGCGCAG
U-F4a/R4a Конец экзона 4 - экзон 5 CTGCGCCAATAACATCAGCG 60 528
CCGTTAGAGGAAAAGGGTATATGT
U-F5/R5 Экзон 6 ACATATACCCTTTTCCTCTAACGG 60 1 185
TGGGGGTATTTTGGTAATCCCTT
Sequencing Analysis Software v 5.2 (Applied Biosystems).
Для оценки влияния выявленных полиморфизмов на структуру мРНК гена GLK2 была выделена РНК гена с помощью набора Total RNA Purification Kit (Jena Bioscience) и очищена ДНК-азой (Thermo Scientific), после чего синтезирована кДНК с использованием набора реактивов Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (Thermo Scientific) по инструкции производителя. На матрице кДНК исследуемых образцов с использованием ранее сконструированных праймеров U-F2/U-R3 к экзонным областям гена GLK2 после проведения ПЦР были получены ампли-коны, которые затем секвенировали. Построение аминокислотных последовательностей проводили с использованием программы Blast
на сайте Центра биотехнологической информации NCBI [11].
Для ДНК-типирования аллелей гена Ant1 (Ant1/ant1) у образцов расщепляющихся популяций использовали CAPS маркер Antl-NcoI [12], аллелей гена GLK2 (U/u) — разработанный нами SCAR маркер u-7A.
ПЦР-реакцию проводили в Термоциклере Biometra T Professional Basic (Германия). Реакционная ПЦР-смесь объемом 15 мкл содержала 60-100 нг геномной ДНК; 2,5 мМ dNTP Mix (Thermo Scientific); 1,4 единицы Tornado DNA-полимеразы в инкубационном буфере «F» (Праймтех, Беларусь) и 0,25 пмоль/ мл олигонуклеотидных праймеров (Прайм-тех, Беларусь). Режим ПЦР был следующим: 95 °С — 15 мин, затем следовало 35 циклов, состоящих из инкубаций: 99 °С — 1 сек,
55-60 °С — 30 сек и 72 °С — 1 мин. Реакцию завершали при 72 °С в течение 7 мин.
Продукты ПЦР реакции CAPS маркера Ant1-NcoI разделяли методом электрофореза в 2% агарозном геле в присутствии бромистого эти-дия и документировали с помощью системы Bio-Rad GelDoc2000. В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp Plus DNA ladder (Thermo Scientific). Рестрикционная смесь объемом 20 мкл включала 1 мкл ампли-
кона, 2 мкл 10Х-буфера, 16 мкл mQ, 1 мкл NcoI. Режим рестрикции — 16 ч при 37 °С. Продукты ПЦР с использованием SCAR маркера u-7A разделяли электрофорезом в полиакриламид-ном геле с использованием ДНК-секвенато-ра ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Размер ампликонов определяли с использованием стандарта Liz500. Используемые праймеры и ожидаемые продукты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Праймеры для ДНК-типирования аллелей генов Antl и GLK2
Название маркера Последовательность праймера, 5' ^ 3' Температура отжига, °С Размер ПЦР продукта, п. н.
CAPS маркер Ant1-NcoI [12] GGAAGGACAGCTAACGATGTG- 55 478
GTTGCATGGGTGGTAAATTAAG
SCAR маркер u-7A ACGGTGGAGATTTACTGCCA -FAM 60 221 /222
ACGACTAGAACCGTCAACGA
Эффективность разработанных маркеров на основе выявленных новых структурных изменений гена GLK2 оценивали по соответствию между наблюдаемыми и ожидаемыми по результатам ДНК-типирования фенотипами методом Хи-квадрат (х2), где общей мерой отклонения практических данных от теоретических, т. е. критерия соответствия х2, является сумма отношений квадратов разностей между частотами практического^ и теоретического Fn распределений к частотам теоретического Fn распределения для данной группы (формула 1) [13].
X2 = I ((f - F)2 / F)
(1)
Результаты и обсуждения
Исследования по изучению полиморфизма гена GLK2 были начаты с выявления известных аллелей U и u с использованием разработанного нами SCAR маркера u-7A (табл. 2) на широкой коллекции форм томата. Сопоставление результатов молекулярного анализа и фенотипической оценки признака «окраска плодов и характер распределения хлорофилла в них на стадии технической спелости»
выявило новые фенотипы, отличные от двух известных [9]. На основании полученных результатов выполнен ресиквенс гена Golden 2-like (Gene ID: 101055613) у форм Solanum lycopersicum с различным распределением хлорофиллов и антоцианов в плодах на стадии технической спелости. С помощью разработанных праймеров (табл. 1) была проведена амплификация с образцами томата Бурштын (U), Дзивосны (U), Патрикеевна (и), выполнен сиквенс полученных фрагментов и их выравнивание (рис. 1).
Сравнительный анализ полученных последовательностей показал идентичность гена GLK2 у сорта Патрикеевна мутантному ал-лелю и (вставка аденина в первом экзоне гена). На основе секвенирования форм томата с различным характером распределения пигментов в генотипе образцов Бурштын и Дзи-восны выявлен новый полиморфизм гена GLK по сравнению с нормальным аллелем U — 4 SNP (1 в экзонной и 3 в интронной области), 2 однонуклеотидные вставки (в интронной области), делеция размером 52 п. н., затрагивающая область конца второго экзо-на - начала второго интрона.
lU^n ['.-■■vrv
l.hit^__
Ш
_2£2L
ah.-
mm пцщ
II лН,г
■:■:.■:.:: 7-A-. ;.т,- - : ■ :. ■:■■:■■■ г-:.т гшцтаипшиРК ЛМПЦИГ Ш1Ш1 ПТТШЛТТ* taattai.7 s rial I ц. -АТТП ITS WiTTiiTTtTJ 7 v*7
AAA7 . :. birli гтл ; .. 7 -j jiA— г 77[Г7-а1ТТ7Г7£r j: 777А1Л . 77 .:: ni А ...л: л AV7 . 7 7 at. 77 а. г: mkUUL 7A*rtАА7. ГТА£Ьтг г г -".т г::.:: .аа- -,7тда\ ГАтАС 7 ГА.7 AAA;. МННТКМ»«»™**! ГТЯ5 ¡CAf icrfti(TTTTf- ,TW,T;TTA7 .77 А. тШЙаМИЛЫЯММ - НЖМГГ 7^7777-: TiMAi. • ,7tMTTt.Tf.: 7f к
Si." ":' v. : 7 : ■--^7Т - 77J.7-.TTTTL : 7 ■ TT',7TlTi7^;.7.-T4*T. TTi" ■ татттЛЬипк ги.ттдА,; TTiriTTT — 17ТТГ-77 мввтпыпзиилти
jkiau 1
J»-!
н .7777 г . 777 7.
■ ■ ■ ■
7ААГ.-.7Т7. : 7 кТ . 7 7 7Г777 7 7V*AAAATTA7 ;AT fli^i-АД 7*777777^^7 7**ЛАА777ГАА7 : VA-VA77A7;.AA77T.-'JAT;>A.7 777T7-. 7A7 ..ЛЛА77АА
»ст*тттащ?>»тетт«тст*т<гт*тат1М1ст*ыи^и№Г1ИЦ i in иатяяидттвясчдтдиппаиы i J x ['.ртбадлтуда
i- ГАТТТ;;ААТААТ\: TT:; : ?: TITCTT : AT:ATT :A-,: тАЗАААААТ ;ААА;Т;;ААААТТАТ;АТТТАГ:.: пчатттттк^дтмииттитгзья^ейкытттеввя^гтттткчи:ASJiTiM
JwtMi T «AMWlWCTf■ЛТ«|цКГИМ«Н(Л>: iiAAAi>7ii>AAA77A7L.;i77;7.ii77(.. ii..-¿т, i -777 . -,t7
старт шдая
lk~IHHl]
Т777ТЖШ5ГГ Wwm
¡at . .
iwn
. №
.111»
jinn
.. .-7 .■ .-Л.77A. 7 ... . А.Л.77:.. 7 777 .■: . -...AL'. 7--7^77771 . _AAA:A: 1МИ7ЛМ .-7 LAAAA.AA .■. A7^
;„,:7:-jii#?itAt:;.-: гАр*77Г7 7AAA77 ГЯТЯ1АНМИ ППШЕЩНТМШЯи» AAAAJA; ..
ШЛКЫ1 I I 1.77 17 7^A777 7--AAA ! I L - . 7 77 -JJirii^; 7А4М»Ш - 1,7АААА^-7.7,Т 7j] L-.7 ¡OAA 7 7 TL ■
;. АА;г,ААА;аааааа-7ААА:
..;.. --~~—rCT г.-j iHMl^AMT7AAAAAA . *К£А^АААА7=ААААА1( aao -... A-IAAA ш
liTiBKS тгшс
ii|]fliiMi'|i «К
11 |p:n1 ЧнЩ Г fl
атпшкл uu.juii
JKHIl
■kif, ПН
WW
AUiMriiM
t-j-Ji/r.
JU»_ ИЗО Д13Д 11» 1KO ли_UK .11» 1!» HIM 1210 li!0 JiJD _J1
ПУЗ 7i.i7,.-7777777 ' ."77. 77А771Л7ТА71.\777 17АГ7 7Il77 777A7 :-,7W*iAi7.77AA7717 " ",7771Г Г 777 "A" ' ■ ":А7.7Т^--А7ТА7Аи1ТТ7 17 -7 .ЛиШЩТШ ,77. TA^A" 7 -7
лас.,-j lll--j !аггat т : г.-тт гаг::тт a-:.,:i.; ,,tt-jд
Ilk
cit:..,-;iic;MWi rjg
.Ljj?.
LH-Jft
..L.1??
№
LTjj
J 47'
j 'b.
IHt "IWHf • ЙД " ___ - " ' -" . '
¿71T7^.iiii7ii7^ii7777— in^ii7iA-iTri7iV.77W7 J7777A7 77A77 Г1777 ,777 JT Г 7;77Tii7777ri7777 r77i"ii7iiJUT:/'ii ^777^1777. 77 JLi77i7 j7.iii',77i^ir; ¿7A7.ii-W4i7-bl7Si>7TTT7 ГД*ГеИТ1к*5ГТ*7ИИГ™И fTT7Ti-T77КГТАt IMI1 ;7TTi77T*7.77T77.-7T77TT7^T7ii7;i»75;)i-T77il —7 ' 7
fTT-^T*** j^777-m*atHi*tiAtTT*n«rHttiuiiiiiiLiuiCTTjmiui mi L jmuinma;: i J rjLmL>iHMHaii*amatT?aTttiAttiHM»MtHi«irt
»xTuvajktttwiMjmnjjjiyMiuaTraM^ .^—^rncttwTOTinwtMTOaTt
>h"IUU
li»
fur il^ VKCly
" 1 < "и > ^J
им
Lbiq
l!!D
И)!
1>I0
Ш._______Щ_____El________iSL.
J!W .
——————ljmiUL>lj
{шттцтттшипмккиоюС]
Libu
.JMO
r
|SMHrae*SrtoTAViliA7T7-TiAJJ,S71i717i»'.iiA7TA-,i7 .77 7-7Л.7. ; ,7.'.7 ' 7А7 -ААТ.^7 7777.7.У.7Т7^7 V.7A1 77 7t7 i V7 ' 7ЦЦ7^ЫиДТААДТТЫ7Т11СТСА117ТТШи7ГАЬ-
. 7 . .A,A^.7n.A7A. TiJUU 77 . 7ЛААА7 ■.АА7А\-А'.ЛЛА77А . ,77 -Л7АА*:-.А'.7 . . . пТ .m7IU7 7 Е . I1 .'T/LI TllgrttO№K 7i:-it i-OiAAtti J7iAiA ■■ AiTi IA-IAAATTA". *7"Т7--АТ AA^-.
11 ]HI L1114*0 I' ■ К J 11_
|||иич(| L" f'i
;[i.i*iiMii is; л.й.
ЖЯГЯТИИ
I'jl'ifnuM ШИ (гчч
TTl^-ATVL;;rtrjjATT 1777 jAktti ; Ajriii A ,ATAt.AAi;7lAiTTAit A7 7VAA 7 : TkTA77Ai AV77 777i7iT7 : 7 7AAA7TT AlitAiit АГА ;!!;.^ A777iAiAA7-"tV77AiiiJlS?i A^ Ai
7-7 7 ;-7_\7 ¡¡И mMUATUUm>T77ATT)>TA7 77AiTT7А7АГ -7.7 1 " 77 7ТГА77-7 7 7 7 7.' 7^ ' ■■7.7,7,7 —1Т^77АТПТАТА"" 7 7A77,71AAA7,.77.:T7i7 Vf 7 »Ml
" UAmaAUL 11 l^^.kfkXAUATT ^ L LI АНАПЗТТиТ^ПТ iiTATTTTT^ATTTTrr: lilAL ^1АА~ГАТ '.ТА TAT ATA lAi^ATOTAAAAA'.Ti—ATAfA',T:;AiAA'
ArlflinlDM и.о. JUUBW
JtW
jlH
>1"
яи~
J»
□ l p" : ■.-■ i11:: _ i:JJ г i
AATTlA7AA7TTAAAATJ^rrrn№litM17A7tHTH'. L11 iliSTC mw.TAfc. I :>j! t:T^T75*»*TT7 W7AT.- 7 7-;..; : .. -. -1A7T77.'.A t'. < C»>T»liWA?rr
AA77 AATAAT 7 7AAA17A 777i AAA;; 7A7A7 JAATAA;.77 7 7AJ1;AAA 7AA7AA.77 i77^ ( .■7T;AAAT77^AAfAll777 -A7l~7^7AA~7 7 , ^1-7A. 7 . 777Ai 7A7AfO*Ji , 7 7 7i=AAiAAJ iATLJ' ilTtUiMVVir.'iilAiM^TTTTtJli.-iitJWiAitJiJfTSTlftll 777.7А7ЦТ7Г.7АА-nTJi- 7 7.fn-TV7...-Jn"THETiTi 77 ■ ;;rAi7JTM36A^..,IVT7;rJJ1iAliiit^J-
... л!ст;т7 j »: janrnutiirtHisitti: малил:;^, °™т*
nil:inигр I' Hi
Рис. 1. В^1равнивание последовательностей ДНК гена GLK2 у образцов томата Бурштын, Дзивосны и Патрикеевна
Учитывая, что сорта Бурштын и Дзивосны имеют общее происхождение, выполнена амплификация ДНК родительских форм Дачный и Индиго с использованием пары праймеров и-Р3а/и-К2, позволяющей выявить делецию размером 52 п. н. (рис. 2). Аллель с вновь выявленным генетическим полиморфизмом выявлен у сорта Дачный. ПЦР с использованной парой праймеров дал продукты размером в 298 п. н. (Индиго — аллель и) и 246 п. н. у образцов Дачный, Дзивосны.
Так как делеция размером 52 п. н. затрагивает область конца второго экзона - начала второго интрона (рис. 1), нами сделано предположение о ее влиянии на процесс сплайсинга мРНК. Для проверки данного предположения выделена РНК форм с различными полиморфизмами данного гена, синтезирована кДНК, выполнен
сиквенс последовательности (рис. 3А), получены ампликоны на кДНК с различными парами праймеров (рис. 3Б). Сравнительный анализ показал, что в отличие от контрольного сорта Индиго (контроль 95-1 рис. 3А) в зрелой мРНК
Рис. 2. Продукты амплификации образцов томата с парой праймеров и-Р3а/и-Я2. М — маркер молекулярного веса, 1 — Дачный, 2 — Дзивосны, 3 — Индиго
сорта Дачный полностью отсутствует второй результаты подтверждают выявление ново-экзон (рис. 3В) и, как следствие, не образу- го аллеля гена GLK2, который назван нами ется функциональный белок. Полученные и^е152.
Рис. 3. Выявление нарушения сплайсинга у аллеля П-ёе152. А — частичный сиквенс последовательности кДНК гена ОЬК2 у томата с нормальным аллелем и и мутантным П-ёе152; Б — продукты амплификации с двумя парами праймеров к экзонным областям: М — маркер молекулярного веса; 1,7 — растение томата делянки 95-1(Индиго); 2-6, 8-12 — индивидуальные растения томата сорта Дачный, К- — отрицательный контроль. Праймеры и-Р2/и-Я3 (дорожки 1-6) и и-Р2/и-Я5 (дорожки 7-12); В — схема структуры мРНК у сортов Индиго и Дачный
Наряду с вышеописанной делецией, вновь выявленный аллель U-del52 характеризуется наличием SNP в первом экзоне A/G. Данная замена расположена до старт-кодона и не может влиять на последовательность аминокислот синтезируемого транскрипционного фактора. На рисунке 4 представлены белковые последовательности, формируемые на базе трех аллелей GLK2 согласно программе Blast на сайте NCBI [11], с указанием аннотированных регу-ляторных элементов ТФ растений.
Выравнивание последовательностей показало, что, по сравнению с нормальным белком GLK, аллель u позволяет сформировать лишь 75 аминокислот из 311, при этом сдвиг рамки считывания приводит к замене двух последних аминокислот, полному обрыву цепи и, как следствие, невозможности выполнять регуляторные функции. У аллеля U-del52 вырезание второго экзона ведет к выпадению аминокислот с 85 по 135 (50 из 311), что практически совпадает с расположением MYB ДНК-связывающего домена, важнейшей функцией которого является регуляция экспрессии структурных генов в зависимости от потока солнечной энергии. При этом
консервативный SH[AL]QKY[RF] мотив на конце домена не нарушен, что, возможно, сохраняет определенный уровень ответных реакций на действие факторов окружающей среды, прежде всего светового потока. Сравнение структуры ДНК-связывающего домена класса SHAQKYF с последовательностями ре-гуляторных элементов в программе SMART [14] выявило высокий уровень сходства данного домена с доменом животных HOX (82147 рис. 4) — ДНК-связывающего фактора, участвующего в транскрипционной регуляции ключевых процессов развития, что указывает на важность нарушения структуры белка в данной области для растительных и животных организмов.
Наряду с аннотированными регуляторны-ми элементами, анализ нормальной последовательности GLK ТФ в базе SMART [14] позволил предсказать с определенной долей вероятности наличие еще 8 регуляторных элементов (доменов, повторов, мотивов) не аннотированных в базе NCBI для S. lycopersicum. Таким образом, выявленный новый аллель U-del52, по сравнению с аллелем U, характеризуется выпадением важного MYB ДНК-связы-
Рис. 4. Аминокислотные последовательности GLK ТФ и их регуляторные элементы: 82-310 — PLN03162 GLK2 ТФ; 85-140 — ДНК-связывающий домен класса SHAQKYF; 87-137 — Myb- подобный ДНК-связывающий SANT
домен [11]
вающего домена из ТФ и изменением реакции растения на уровень солнечной радиации.
Для выявления нового аллеля разработан SCAR маркер U-del52, ограничивающий область гена парой праймеров U-F3a/U-R2, позволяющей выявить делецию 52 п. н. и, соответственно, аллель U-del52: U-F3a: GAGCTTATGGCAACTCATGGTC U-R2: TCCCAAATTGCAAAAATGGCGATA. Проведен скрининг широкой коллекции Solanum lycopersicum и диких видов томата (более 100 форм различного происхождения). Данный аллель не обнаружен у диких родственных видов (S. pimpinellifolium, S. humboldtii, S. glandulosum, S. peruvianum, S. chilense, S. cheesmanii, S. paviflorum, S. hirsutum). У Solanum lycopersicum новый аллель U-del52 выявлен у двух образцов кол-
лекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова (ВИР): Желтый деликатес (вр.к.-15368) и Топ модель (вр.к.-17185).
Для изучения фенотипического проявления аллеля и^е152 и подтверждения статистической достоверности эффективности разработанного маркера проведено ДНК-типирование 157 образцов популяции F2 гибрида Индиго (и, АМ1) х Дачный (аллель и^е152, а^1) с помощью маркера и^е152 (рис. 5).
В результате сопоставления данных молекулярного маркирования и фенотипических описаний изучаемых форм, выполненных в 2022 г., установлено, что плоды форм с гомозиготным аллелем и^е152 имели на стадии технической спелости светло-зеленую окраску со слабым увеличением концентра-
ч j : j is а 7 ( ) i« Ii и и и if if. и и is Ii и Ii и ч
_ IW ы.
и » 1« -,й и й w w м г К я л л j: if ы if ч jt
Рис. 5. ДНК-типирование образцов популяции гибрида Индиго (и, АМ1) х Дачный (аллель П-ёе152, апИ)
с помощью маркера и^е152 (образцы 1-47)
ции хлорофилла у плодоножки (рис. 6А). Более равномерное распределение пигментов в плодах может способствовать уменьшению радиальных трещин на них при стрессовых условиях окружающей среды, при этом накопление каротиноидов в плодах будет промежуточным между таковым у образцов с и и и аллелями. При наличии в генотипе доминантных аллелей Лп11 и и пятно у плодоножки было насыщенно-фиолетовое, при наличии Лы1 и и^в152 — слабо-фиолетовое или едва заметное в зависимости от количества падающего света на плод. По результатам данных
исследований разработан Протокол ДНК-ти-пирования нового аллеля и^в152 гена GLK, связанного с накоплением и распределением пигментов (хлорофилла, каротиноидов, фла-воноидов) в плодах томата.
Данные оценки соответствия методом Хи-квадрат (х2) между наблюдаемыми и ожидаемыми по результатам ДНК-типирования фенотипами представлены в таблице 3. Проведенный анализ подтвердил статистическую достоверность выявленной связи с фенотипи-ческим проявлением признака — слабое зеленое пятно у плодоножки.
Рис. 6. Фенотипическое проявление аллелей и (1), и (2) и П-ёв152 (3) гена ОЬК2. А — образцы с аллелем аМ1;
Б — образцы с аллелем ЛМ1
Таблица 3
Результаты анализа расщепления популяции F2 — Индиго (и) х Дачный (и^в!52) методом х2
Показатели Расщепление Сумма
U/U U/U-del52 U-del52/U-del52
Ожидаемое расщепление (НО) 1 2 1 4
Наблюдаемые частоты (/) 39 85 33 157
Ожидаемые частоты (Б) 39 78 39 157
Разность частот (/-Б) 0 7 -6 -
Квадрат разности (/-Б)2 0 49 36 -
Отношение (/-Р)2/Б 0 0,63 0,92 1,66 = х2
Окраска плода на стадии технической спелости Ярко-зеленое / фиолетовое пятно у плодоножки Зеленое / фиолетовое пятно у плодоножки Светло-зеленое / фиолетовое пятно у плодоножки
Примечание. Нулевая гипотеза (H0) — ожидаемое расщепление: 1 U/U : 2 U/U-del52 : 1 U-del52/U-del52 Число степеней свободы — (с-1) х (k-1) = (3-1) х (2-1) = 2; по таблице определяем х2теор = 6,0; Х2факт = 1,66 < х2теор (6,0) следовательно, гипотеза верна и расщепление соответствует 1 : 2 : 1
Одной из задач наших исследований была оценка влияния различных аллелей GLK2 на накопление антоцианов в плодах, для чего, наряду с популяцией F2 Индиго (Antl, U) х Дачный (antl, U-del52), использована популяция Индиго (Antl, U) х № 17-2020 (antl, u). Наличие аллеля Anthocyanin 1 (Antl) у родительской формы Индиго позволило также оценить в расщепляющейся популяции характер накопления антоцианов в плодах в зависимости от комбинации аллелей U, U-del52 или u гена GLK2. Так была установлена более высокая концентрация антоциана у плодоножки у форм с сочетанием аллелей U и Ant1 и более равномерное распределение по поверхности плода у образцов с аллелями U-del52 и Ant1, а также u и Ant1. При этом при увеличении интенсивности солнечного света количество антоциана в кожице плодов заметно увеличивалось в области его попадания на плод независимо от части плода (рис. 6Б).
В настоящее время нами созданы формы с различным сочетанием генов биосинтеза ка-ротиноидов (tangerine, beta), регуляторов накопления антоцианов (Anthocyanin1) и трех аллелей гена GLK2, созданы новые гибриды F1 c их различным сочетанием для более детального изучения взаимодействия аллелей при накоплении пигментов в плодах.
Заключение
Таким образом, в результате исследования полиморфизма гена транскрипционного фактора Golden 2-like найден новый аллель U-del52. Установлено, что делеция в 52 п. н. (конец экзона 2 - начало интрона 2) в гене U ведет к выпадению экзона 2 из зрелой мРНК при ее сплайсинге и синтезу белковой последовательности без MYB-like SANT домена, что изменяет ответную реакцию растения на факторы окружающей среды, прежде всего на интенсивность солнечного света. Выявлено фенотипическое проявление данного аллеля: светло-зеленые плоды со слабым увеличением концентрации хлорофилла у плодоножки на стадии технической спелости, более равномерное распределение пигментов в плодах по сравнению с нормальным аллелем U гена GLK2. Разработан молекулярный SCAR маркер U-del52 для выявления данного аллеля. Показана более высокая концентрация антоциана
у плодоножки у форм с сочетанием аллелей U и Antl и более равномерное распределение по поверхности плода у образцов с аллелями U-del52 и Antl. Создан новый селекционный материал для дальнейшего детального изучения взаимодействия аллелей при накоплении пигментов в плодах и селекции, направленной на улучшение качества плодов.
Список использованных источников
1. Zhao X. et al. Identification and expression analysis of GARP superfamily genes in response to nitrogen and phosphorus stress in Spirodela polyrhiza / Xuyao Zhao, Jingjing Yang, Xiaozhe Li, Gaojie Li, Zuoliang Sun, Yan Chen, Yimeng Chen, Manli Xia, Yixian Li, Lunguang Yao and Hongwei Hou. - BMC Plant Biology: 2022. - Vol. 22. - pp. 308-326, https://doi. org/10.1186/s12870-022-03696-5.
2. Fitter D. W. et al. GLK gene pairs regulate chloroplast development in diverse plant species / D. W. Fitter, D. J. Martin, M. J. Copley, R. W. Scotland, J. A. Langdale. - Plant J. -2002 Sep. - Vol. 31, I. 6. - pp. 713-727. DOI: 10.1046/j.1365-313x.2002.01390.x.
3. Liu Z. et al. Genome-wide characterization and analysis of Golden 2-Like transcription factors related to leaf chlorophyll synthesis in dip-loid and triploid Eucalyptus urophylla / Z. Liu, T. Xiong, Y. Zhao, B. Qiu, H. Chen, X. Kang and J. Yang. - Plant Science Sec. Plant Breeding: 2022. - Vol. 13, https://doi.org/10.3389/ fpls.2022.952877.
4. Nakamura H. et al. Ectopic overexpression of the transcription factor OsGLK1 induces chloroplast development in non-green rice cells / H. Nakamura, M. Muramatsu, M. Hakata, O. Ue-no, Y. Nagamura, H. Hirochika, M. Takano and H. Ichikawa. - Plant Cell Physiol.: 2009. - Vol. 50, Is. 11, pp. 1 933-1 949, doi:10.1093/pcp/pcp138.
5. Bravo-Garcia A. et al. Specialization of the Golden2-like regulatory pathway during land plant evolution / A. Bravo-Garcia, Y. Yasumu-ra, J. A. Langdale. - New Phytologist: 2009. -Vol. 183. - pp. 133-141.
6. Langdale J. A., C4 cycles: past, present, and future research on C4 photosynthesis. - Plant Cell: 2011. - Vol. 23, Is. 11. - pp. 3 879-3 892. doi: 10.1105/tpc.111.092098.
7. Waters M. T., Wang P., Korkaric M., Capper R. G., Saunders N. J., Langdale J. A. GLK
Transcription Factors Coordinate Expression of the Photosynthetic Apparatus in Arabi-dopsis. - Plant Cell: 2009. - Vol. 21, Is. 4. -pp. 1 109-1 128. DOI: https://doi.org/10.1105/ tpc.108.065250.
8. Waters M. T., Moylan E. C., Langdale J. A. GLK transcription factors regulate chloroplast development in a cell-autonomous manner. - Plant Journal: - 2008. - Vol. 56, Is. 3. - pp. 432-444. doi: 10.1111/j.1365-313X.2008.03616.x.
9. Powell A. L. T. et al. Uniform ripening Encodes a Golden 2-like Transcription Factor Regulating Tomato Fruit Chloroplast Development / A. L. T. Powell, C. V. Nguyen, T. Hill, K. L. Cheng, R. Figueroa-Balderas, H. Aktas, H. Ashrafi, C. Pons, R. l Fernández-Muñoz, A. Vicente, J. Lopez-Baltazar, C. S. Barry, Y. Liu, R. Chetelat, A. Granell, A. V. Deynze, J. J. Gio-vannoni, A. B. Bennett. - SCIENCE: 2012. -Vol. 336. - pp. 1 711-1 715.
10. Nguyen C. V. Tomato Golden2-like Transcription Factors Reveal Molecular Gradients
That Function during Fruit Development and Ripening / Cuong V. Nguyen, Julia T. Vrebalov, Nigel E. Gapper, Yi Zheng, Silin Zhong, Zhangjun Fei, James J. Giovannoni. - The Plant Cell. - 2014. -Vol. 26. - pp. 585-601.
11. GenBank [Электронный ресурс]. - 2023.
- Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank. - Дата доступа: 01.02.2023.
12. Sapir M. et al. Molecular Aspects of Antho-cyanin fruit Tomato in Relation to high pigment-1 / M. Sapir, M. Oren-Shamir, R. Ovadia, M. Reu-veni, D. Evenor, Y. Tadmor, S. Nahon, H. Shlomo, C. Lhen, A. I. Meir, Levin. - Journal of Heredity: 2008. - Vol. 99, Is. 3. - pp. 292-303. doi:10.1093/ jhered/esm128.
13. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
14. SMART [Электронный ресурс]. - 2023.
- Режим доступа: http://smart.embl-heidelberg. de/. - Дата доступа: 01.02.2023.
O. G. Babak, E. V. Drozd, N. A. Nekrashevich, N. V. Anisimova, K. K. Yatsevich, A. V. Kilchevsky
NEW ALLELE OF THE GOLDEN 2-LIKE GENE, ITS PHENOTYPIC MANIFESTATION AND BREEDING SIGNIFICANCE IN SOLANUM
LYCOPERSICUM
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: O.babak@igc.by
As a result of the study of the gene polymorphism of the Golden 2-like transcription factor, a new U-del52 allele was found. It was established that the deletion of 52 bp (the end of exon 2 and the beginning of intron 2) in the U gene leads to the loss of exon 2 from the mature mRNA during its splicing and the synthesis of a protein sequence without the MYB-like SANT domain, which changes the plant's response to environmental factors, primarily to the level of sunlight. The allele's phenotypic manifestation was identified: light green fruits with a slight increase in the concentration of chlorophyll at the stalk at the stage of technical ripeness; a more uniform distribution of pigments in fruits compared to the normal U allele of the GLK 2 gene. The molecular SCAR marker U-del52 was developed for the identification of this allele. A higher concentration of anthocyanin at the stake was shown in the forms with a combination of U and Antl alleles and a uniform distribution over the fruit surface in the samples with U-del52 and Antl alleles. The new breeding material was developed for further detailed study of the interaction of alleles during the accumulation of pigments in fruits and breeding aimed to improve the quality of fruits.
Keywords: Solanum lycopersicum, GLK2 gene polymorphism, regulation of pigment synthesis, DNA markers.
Дата поступления в редакцию: 06 февраля 2023 г.
