CC BY
14УДК 535.64:631.523:581.1:577.127.4
О. Г. Бабак1, Н. А. Некрашевич1, Н. В. Анисимова1, К. К. Яцевич1, Т. В. Никитинская1, Н. Ю. Лещина2, И. Г. Пугачева2, Т. В. Никонович2, М. М. Добродькин2, А. В. Кильчевский1
СОЗДАНИЕ ГИБРИДОВ Ft ТОМАТА ЧЕРРИ НА СТЕРИЛЬНОЙ ОСНОВЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КЛАССИЧЕСКОЙ И МАРКЕР-СОПУТСТВУЮЩЕЙ СЕЛЕКЦИИ
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: O.Babak@igc.by ^Учреждение образования «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» Республика Беларусь, 213407, г. Горки, ул. Мичурина, 5
В результате апробации известных маркеров к аллелю positional sterility-2 (ps-2), детерминирующему функциональную мужскую стерильность (ФМС) установлена наибольшая эффективность выявления гомозиготных аллелей с помощью маркера ps-2_TaiI. Для повышения эффективности идентификации гетерозиготных аллелей ps-2/Ps-2 разработан Tetra-primer ARSM-PCR. Созданы 28 гибридов F1 между крупноплодными формами с ФМС и линиями томата черри, проведены их двухлетние испытания. Выделены лучшие гибридные комбинации с высокими значениями урожайности в сочетании с оптимальным размером (16-26 г) плода для томатов черри, превосходящие стандарт Алекша по ранней урожайности на 0,70-1,26 кг/м2, по общей урожайности — на 0,49-1,96 кг/м2, с целью дальнейшей передачи в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений. По результатам ДНК-типирования и фенотипической оценки из популяций F2-F 5 выделены линии томата черри на стерильной основе (с аллелем ps-2) c комплексом генов качества (B из S. pennellii, b из S. lycopersicum, nor, u) и устойчивости (1-2,1-2C, Mi 1.2, Cf-4, Cf-4A; Cf-5 Cf-9, Tm22). Созданные линии томата черри на основе ФМС могут служить материнскими линиями для создания новых гибридов с упрощенной системой семеноводства.
Ключевые слова: томат черри, ДНК-типирование, маркеры гена ps-2, функциональная мужская стерильность, признаки урожайности.
Введение
Одним из актуальных направлений селекции томата является создание мелкоплодных сортов типа черри или вишневидного томата. Как правило, это высокорослые и скороспелые формы с длинными кистями, на которых сформировано большое количество мелких плодов. Широкое разнообразие по окраске и форме плодов способствует повышенному спросу среди потребителей, а также формированию высокой цены на продукцию данного вида.
Томаты разновидности черри, в отличие от крупноплодных форм, имеют ряд специфических особенностей. Во-первых, это высокая концентрация биологически активных веществ, основными из которых являются ка-ротиноиды (ликопин, каротин, лютеин и др.) и
флавоноиды (антоцианы, халкон), что делает их важными продуктами для здорового питания. Во-вторых, вовлечение в селекцию томата черри диких и полудиких форм, обладающих уникальными аллелями устойчивости к вирусным и грибным патогенам. Близкородствен-ность с дикорастущими видами также определяет их высокий адаптивный потенциал к условиям окружающей среды. Таким образом, возделываемые сорта типа черри отличаются более высокой комплексной стрессоустойчи-востью к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам.
Вместе с тем следует отметить меньший выход семян у томатов черри по сравнению с крупноплодными формами, что обуславливает более высокие трудовые затраты на получение
семян при организации оригинального семеноводства. Данная особенность способствует созданию и выращиванию большего количества сортов, чем гибридов томата черри, или существенному повышению стоимости гибридных семян. Одним из способов, облегчающих гибридизацию, является получение исходного материала на основе функциональной мужской стерильности — нерастрескиваемость пыльников, что позволяет избежать процесса их удаления у материнских растений [1]. Такой подход широко используется в селекции крупноплодных форм. Успешность классической селекции в данном направлении связана с получением материнских форм с маркерным признаком «картофельный лист», который четко проявляется на этапе развития 2-3 настоящих листьев и позволяет идентифицировать самоопыленные растения. Значительных успехов в создании линий томата с функциональной мужской стерильностью достигли селекционеры Болгарии [2]. В Белорусской государственной сельскохозяйственной академии (БГСХА) и Институте генетики и цитологии НАН Беларуси с использованием линий на стерильной основе создано 9 гибридов томата для пленочных теплиц и открытого грунта: Даша, Александр, Агеньчик, Азарт, Рубин, Витязь, Тайник, Ирбис, Ритм [3]. С развитием методов молекулярной генетики для перевода форм на стерильную основу стали использоваться ДНК-маркеры к аллелямps иps-2, позволяющие идентифицировать гомозиготное и гетерозиготное состояние аллелей, а также отбирать растения, не дожидаясь оценки на стадии формирования плодов.
Staniaszek M. с соавторами предложили для выявления у томата форм с ФМС использовать два CAPS маркера C4-30_(HinfI) и С2-21 (MboI), связанных с генами ps (хромосома 2) и ps-2 (хромосома 4) соответственно [4].
Голландские авторы (Gorguet B. и др.) описали мутацию томата в гене полигалактурона-зы, тесно связанной с фенотипом ps-2 (ФМС) и впервые картировали локус ps-2 с на коротком плече хромосомы 4. Данная мутация — это SNP (G/C) в конце пятого экзона в сайте узнавания для интронного сплайсинга при созревании мРНК. У мутанта из-за данного SNP меняется сайт узнавания, и из зрелой мРНК вырезается пятый экзон, что приводит к синтезу нефункционального белка [5].
Кроме того, группой исследователей (Sha Z., Atanassova B. и др.) показано тесное сцепление с геном ps-2 двух кодоминантных маркеров: микросателлитного SSR450 и CAPS маркера TG123, находящихся на расстоянии от гена ps-2 около 4,9 и 11,6 сМ соответственно [6].
В рамках ранее проведенных исследований в Институте генетики цитологии НАН Беларуси разработаны методики ДНК-типирования аллелей качества плодов (B, og, og°, hp-1, hp-2dg, t, nor, norA, rin) и устойчивости к болезням и вредителям (Cf2, Cf4, Cf5, Cß, I-2, I-3, Mi-1.2, Tm2, Sw-5b) [7, 8]; совместно с БГСХА в результате применения разработанных методов создан ряд линий томата черри с генами качества плодов и устойчивости [9].
В связи с вышеуказанным целью данного исследования являлся перевод ранее созданных линий томата черри с комплексом генов качества и устойчивости на стерильную основу, а также создание гибридов томата черри на основе ФМС. Для достижения данной цели последовательно решались следующие задачи: апробация известных ДНК-маркеров аллелей ФМС, а также их усовершенствование; гибридизация крупноплодных форм с ФМС и линий томата черри; испытание созданных гибридов Fj и передача лучшего в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений; отбор методами маркер-сопутствующей селекции (МАС) из поколений F2-F3 стерильных образцов томата черри с комплексом генов качества и устойчивости к болезням; создание гибридов Fj томата черри с использованием новых линий на стерильной основе.
Материалы и методы
Для оценки эффективности ДНК маркеров использовались сорта и гибриды крупноплодных томатов черри с признаками функциональной мужской стерильности.
На этапе переноса гена ps-2 в линии томата черри для исследований использовался совместно наработанный селекционный материал: созданные коллекции форм томата черри с комплексом ценных аллелей (табл. 1) и крупноплодных форм с комплексом хозяйственно-ценных признаков, в том числе признаком функциональной мужской стерильности, обусловленным аллелем ps-2.
Гибридизации проводилась в 2 этапа: в 2015 году были получены гибриды F0 между крупноплодной стерильной Линией С9464 и Линиями черри 08, 024, 029. В 2017 году проведены скрещивания по схеме топкросса с использованием четырех стерильных крупноплодных форм в качестве материнских: линии с генами функциональной мужской стерильности и маркерного признака «картофельный лист», устойчивости к кладоспориозу Cf-5 (С 9464, Линия 83); с генами функциональной мужской стерильности и партенокар-пии (Линия № 4); с генами функциональной мужской стерильности и лежкости (nor) плодов (Линия № 7). Линия 83 также характеризуется наличием аллеля I-2 устойчивости к фузариозу. В качестве отцовских форм по результатам ДНК-анализа (МАС по признакам качества плодов и устойчивости к болезням и вредителям) и оценки хозяйственно-ценных признаков в ранее проведенных испытаниях отобраны 7 линий томата черри: Линии 08, 09, 010,020, 022, 046, 049 (табл. 1). На основе ДНК типирования индивидуальных растений образцов коллекции с помощью маркеров к аллелям Cf-2, Cf-4,Cf-5 и Cf-9 (устойчивость к кладоспориозу), I-2, I-3 (устойчивость к фузариозу), Tm-2, Tm-22 (устойчивость к вирусу мозаики томата), Mi-1.2 (устойчивость к нематоде), nor, rin, norA (лежкость пло-
дов), В, Ь (аллели ликопин-Р-циклазы), hp-1, hp-2dg (повышенное содержание пигментов), ^-3 (неразрушение хлорофилла в начале созревания плодов), и (равномерная белесая окраска плодов) выполнен с отбор форм для включения в гибридизацию [7, 8]. Наряду с отбором по результатам ДНК-типирования выполнен анализ форм по комплексу хозяйственно-ценных признаков урожайности и биохимического состава (табл. 1).
В 2018-2019 гг. в условиях защищенного грунта проведено испытание 28 гибридов F Растения высаживали в трехкратной повторно-сти по три растения на делянке. Схема посадки 70х30 см. Доза удобрений N60 (Р2О5)ш (К2О)ш. Агротехника — общепринятая для томата защищенного грунта. В качестве стандартов использовались районированные в Беларуси индетерминантные сорта томата черри для защищенного грунта Черри Коралл и Алекша. Биометрические измерения проводились во время массового плодоношения. Фенологические наблюдения фиксировались на протяжении всего вегетационного периода. Сборы урожая осуществлялись с интервалом семь дней, на основании полученных данных рассчитаны основные элементы урожайности. Оценку достоверности полученных результатов проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа.
Таблица 1
Формы томата типа черри, отобранные для гибридизации по результатам ДНК-типирования генов качества плодов и устойчивости к болезням, 2015 г.
№ линии Типируемые аллели Товарная урожайность, кг/м2 Масса плода, г Завязываемость, % Сахара, % Каротин, мг/кг Витамин С, мг/100 г
08 b*; Cf4A, Cf9 6,42 10,90 95,10 3,51 3,44 28,10
09 b*; I-2C; Mi1.2; Tm22; Cf4A, Cf5, Cf9 4,49 10,80 91,00 4,13 1,76 22,00
010 b*; nor; I-2; I2C; Mi1.2; Tm22; Cf4A, Cf5, Cf9 5,74 12,10 64,40 5,08 3,06 19,00
020 B**; nor; I-2; Mi1.2; Cf5; Cf4; Cf9; 7,02 10,90 95,00 2,75 3,96 27,00
022 B**; I2; I-2C; Cf4; Cf9 5,19 9,50 87,00 3,56 2,42 33,40
024 B**; I-2; Mi1.2; Tm22; Cf5; Cf4; Cf9 3,28 13,00 94,30 2,75 4,32 27,00
029 B**; I-2; Mi1.2; Tm22; Cf4A; Cf9 3,07 16,70 87,00 3,66 0,68 29,30
046 b*; u; I-2;Mi1.2; Cf4A; Cf9 6,33 10,80 93,20 3,04 2,92 37,90
049 b*; u; I-2C; Tm22; Cf4A; Cf9 6,74 13,30 87,60 3,04 4,29 25,80
Примечание. b* — аллель CYCB из S. lycopersicum; B** — аллель CYCB из S. pennellii
Параллельно с испытаниями гибридов Fj проводился фенотипический анализ и отбор в 2017-2018 годах из расщепляющихся поколений F2-F3 для первой схемы и в 2019-2020 годах — отбор методами МАС и по фенотипу из поколений F2-F3 для второй схемы и F4-F5 для первой схемы скрещивания.
В 2019 году стерильные линии черри (F5), отобранные методами МАС и по результатам полевой оценки и лучшие по комплексу признаков ранее созданные линии, были скрещены по схеме топкросса для создания новых гибридов томата черри на стерильной основе с комплексом генов качества и устойчивости к болезням и вредителям. Данные гибриды будут оценены в дальнейших исследованиях.
Результаты и обсуждение
Оценка эффективности используемых маркеров и создание стерильных форм томата черри
На начальном этапе оценки эффективности представленных в литературе маркеров к аллелям, детерминирующим ФМС у томата, нами были апробированы два CAPS маркера C2-21_MboI и C4-30_HinfI, тесно сцепленных с генами ps (хромосома 2) и ps-2 (хромосома 4) согласно данным группы польских исследователей [4]. При тестировании CAPS маркера C2-21_MboI для выявления гена ps на геномной ДНК из наших коллекционных линий томата были использованы праймеры FMS C2-21f (TGTGGTGCATTCAGAGTTTAGAC) и FMS C2-21r (GAGGCCACGTATGTTGATGT), предложенные польскими авторами [27]. Однако даже после оптимизации условий ПЦР (диапазон температуры отжига прайме-ров — 50-68 °С) не удалось достичь синтеза ожидаемого целевого продукта размером около 1800 п. о. При амплификации с данной парой праймеров на коллекции исследуемых нами форм синтезировался ПЦР-фрагмент около 330 п. о. (рис. 1). Поиск в базе GenBank на основании выложенных геномных последовательностей томата показал, что предложенные праймеры должны «отжигаться» на хромосоме 2 на ожидаемом расстоянии друг от друга около 1800 п. о., однако на наших коллекционных линиях такого не наблюдалось.
При апробации CAPS маркера C4-30_HinfI для выявления гена ps-2 на геномной ДНК из наших коллекционных линий томата для
1000
500
Рис. 1. Электрофорез продуктов амплификации на геномной ДНК коллекционных линий томата с использованием праймеров FMS C2-21f/ FMS C2-21r. Дорожки: М — маркер молекулярного веса; 1 — Линия C9464x19/0 (F5); 2 — Линия C9464x Линия 024-2 (F2); 3 — Линия Б3-1-8; 4 — Линия С9464х Линия 08 (F2); 5 — Линия С9464;
6 — Розалетта (F3); 7 — Линия Т-34 (F3)
амплификации были использованы прайме-ры, предлагаемые авторами [4]: FMS C4-30f (ATGTTACAACCAACAGACGGCGG) ^MSC4-30r (TGAAGTTTTGATGCTGAAAAATTGC) с рестриктазой Hinfl. После получения ДНК-фрагмента указанной авторами длины (около 1000 п. н.) и рестрикции ожидался следующий ряд фрагментов -100, 150, 180, 400 п. о. у всех образцов, 80 п. о. — у гомозиготных по аллелю ps-2 форм, 190 п. о. — у гомозиготных фертиль-ных форм. Четкая разгонка большого количество близкорасположенных фрагментов оказалась возможной лишь на Metaphor агарозе. Представленные результаты показаны на рисунке 2. Видно, что фрагмент 80 п. о., указывающий на сцепление с геном ps -2, у коллекционных форм с фенотипическим проявлением ФМС не был подтвержден с помощью данной пары праймеров.
Таким образом, в наших исследованиях не удалось подтвердить эффективность использования маркеров С2-21_MboI и С4-30_НтА для выявления аллелей, детерминирующих функциональную мужскую стерильность.
На следующем этапе работы нами был апробирован CAPS маркер ps-2_TaiI, предложенный голландскими исследователями для выявления аллеля ps-2 [5]. Авторами было установлено, что мутация в гене полигалактуроназы тесно связана с фенотипом ФМС, предложено использовать CAPS маркер для ДНК-типирования данной мутации [5].
Данный маркер был апробирован успешно. С этой целью использовались праймеры: ps-2_ Tail F (CAAATTGGATGAGAGTTTTGAA) и ps-2_TaiI R (CATTTTACAAGTGTAACAACTTG), а также рестриктаза Tail (HpyCH4IV, MaeII). До рестрикции у всех образцов томата с применением данных праймеров синтезировался единичный фрагмент в 696 п. о. После рестрикции у растений с аллелем Рs-2 (без ФМС) образовывались фрагменты 397, 223, 76 п. о., а у растений гомозиготных по мутантному аллелю ps-2 (наличие ФМС) наблюдались ре-стрикты длиной 223, 200, 197 и 76 п. о. Гетерозиготные формы будут содержать фрагменты всех размеров. Как видно из представленного рисунка 3, применение CAPS маркера ps-2_ Tail позволяет четко выявлять гомозиготы по мутантному аллелю ps-2 (отсутствие фрагмента размером 397 п. о.) или говорить о присутствии в геноме растений томата нормального аллеля. Однозначно различить гетерозиготы
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М 11 12 13 14 15 16 17 18
400 300
200 150 L
100« 50
190
Рис. 2. Электрофорез продуктов рестрикции после использования CAPS маркера С4-30_НшЯ на геномной ДНК коллекционных линий. Дорожки: М — маркер молекулярного веса; 1-2 — Линия C9464x19/0 (F5); 3-4 — Линия C9464x Линия 024 (F2); 5-6 — Линия Б3-1-8; 7-8 — Линия С9464х Линия 08 (F2); 9-10 — Линия С9464; 11-12 — Розалетта (F3); 13-14 — Линия Т-34 (F3); 15-16 — Крупный розовый; 17-18 — Малиновые пикули
Рs-2/ps-2 и гомозиготы по аллелю Рs-2 (фер-тильная пыльца) с использованием данного маркера в обычном агарозном геле затруднительно (рис. 3) из-за близкого размера получаемых продуктов. Более четко они будут видны при применении метода разгонки продуктов в геле на Metaphor агарозе или полиакриламид-ном геле. Последние варианты увеличивают стоимость и усложняют анализ.
Таким образом, нам удалось подтвердить эффективность использования маркера ps-2_TaiI, который при электрофорезе продуктов амплификации на обычном агарозном геле четко выделяет гомозиготные образцы с аллелем ps-2 функциональной мужской стерильности.
В целях повышения эффективности разделения гомозиготных и гетерозиготных форм на основании сведений о локализации SNP (G/C) (мутация ps-2) в изучаемой последовательности томата (EU111748) с использованием программы BatchPrimer3 нами разработан Tetra-primer ARMS-PCR маркер. Последовательности разработанных праймеров следующие: ps-2 out F — TTTGCTAATTGAGAAGTGTG, ps-2 out R — CTACGTCAAAGACCAAGTG, ps-2 inn F — ATTCCACCATTGCCAGAC (С-специфи ческий, для мутантного аллеля), ps-2 inn R — CGTTAATTTATCGATTCC (G-специфический, для нормального аллеля). В результате проведения амплификации у всех образцов синтезируется фрагмент размером 338 п. о.; у гомозиготных и гетерозиготных форм с аллелем ps-2 присутствует дополнительный фрагмент размером 219 п. о.; у гомозиготных по аллелю Ps-2 — 154 пар оснований. Наряду с возможностью выявлять как гомозиготные, так и гетерозиготные формы, апробация тетра-праймера показала и недостаток данного метода — неодинаковый синтез продуктов внешних и внутренних праймеров, что затрудняет интерпретацию результатов. В связи с этим мы предлагаем для ДНК-типирования селекционного материала на наличие аллеля ps-2 использовать два маркера. Сначала применять CAPS маркер ps-2_TaI для выявления стерильных гомозиготных форм с ps-2. В случае необходимости разделить оставшиеся образцы с аллелем Ps-2 на гомо- и гетерозиготные, далее использовать Tetra-primer ARMS-PCR
маркер. При этом гетерозиготы по аллелю ps-2 будут характеризоваться наличием фрагмента 219 пар оснований.
На рисунке 4 приведен пример ДНК-типи-рования расщепляющегося материала популяций F3 с использованием двух маркеров. С использованием CAPS маркера ps-2_TaiI выбираем гомозиготы по аллелю ps-2 (рис. 4а), далее с помощью Tetra-primer ARMS-PCR
маркера разделяем гетерозиготы ps-2/ Ps-2 и гомозиготы Ps-2 (рис. 4б).
С использованием данных методов типиро-вания аллеля ps-2, а также ранее разработанных методов типирования аллелей качества плодов и устойчивости к болезням из гибридных популяций создан линейный материал ^5). Наряду с данными формами создан материал F3 из гибридов, полученных в 2017 году (табл. 2).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М
— 400
•• •• •• •• •• •• •• •• •• •• тт тт » • 200
Рис. 3. Электрофорез продуктов амплификации, полученных после использования CAPS маркера ps-2_TaiI. Дорожки: 1, 18 — фертильный образец Старт, 2-5 — Линия С 9464; 6-9 — Линия 83; 10-3 — Линия 4; 14-17 — Линия 7;
М — маркер молекулярного веса
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 М
а)
б)
¥ —
219 (ps-2)
Рис. 4. Электрофорез продуктов амплификации, полученных при использовании CAPS маркера ps-2_TaiI (а) и Tetra-primer ARMS-PCR маркера (б). Дорожки: 1-10 — F3 Линия С9464хЛиния 08; 11-19 — F3 Линия С9464хЛиния 024; М — маркер молекулярного веса. Гомозиготы по аллелю ps-2: дорожки 3, 4, 11, 12, 14, 18; гетерозиготыps-2/Ps-2: дорожки 1, 5, 6, 9, 13, 15, 16, 19; гомозиготы по аллелю Ps-2/Ps-2: дорожки 2, 7, 8, 10, 17
Таблица 2
Сводные результаты ДНК-типирования созданных форм томата черри F5 и F3
на стерильной основе
Популяции Г5, Е3 Аллельный состав целевых генов
С 9464 х Линия 08 (Б5) Ь (из S.lycopersicum); Сf4А; С/9
Ь (из &.1усореп1сит); Сf4А,Cf-5; С/9
С 9464 х Линия 024 (Б5) Ь (из &.1усореп1сит); 12-С; Сf4А; С/5; С/9;рь-2
В (& реппеПи); 1-2; С/4 А; С/9; р8-2
В (из & реппеПи); 1-2; МИ.2; С/4А; С/9; р8-2
С 9464 х Линия 029 (Б5) 1-2; МИ.2; С/4А;С/5; С/9; В (из & реппеПи); р8-2
1-2; МИ.2; Тт22; С/4 А; С/9 Ь (из &ЛусореЫсит); р8-2
Линия 83 х Линия 020 (Б3) Ь (из &.1усореп1сит); пог; 1-2; МИ.2; С/4; С/9; В;
В (& реппеПП); пог; 1-2; МИ.2; С/4;С/5; С/9; В (из & реппеПИ); рв-2
В (& реппеПиУ; 1-2; МИ.2; С/5; С/4; С/9; р8-2
Линия 83 х Линия 029 (Б3) В (& реппеПиУ; 1-2; МИ.2; Тт22; С/4 А; С/9; р8-2
В (& реппеПи); 1-2С; Тт22; С/4 А; С/5; С/9; р8-2
Ь (из &ЛусореЫсит); 1-2; МИ2; Тт22; С/4 А; С/-5; С/9; р8-2
Линия Б-3-1-8 х Линия 046 (Б3) Ь (из &.1усореп1сит); и; 1-2С; Тт22; С/4 А; С/9; рв-2
Ь (из &.1усореп1сит); и; Тт22; С/4 А; С/9; рв-2
Испытание созданных гибридов F1
С целью испытания и отбора лучшего гибрида для передачи в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений, а также дальнейшего использования материала для создания форм черри на основе ФМС четыре стерильные линии с крупным размером плода использовались в качестве материнских. Указанные образцы обладают значительным потенциалом формирования урожайности в качестве материнского компонента скрещивания, высокой общей и специфической комбинационной способностью. При этом по типу роста индетерминантной является Линия 83, полудетерминантными — Линия С9464 и Линия №7, детерминантной — Линия 4 [9]. Для получения гетерозисных гибридов проведено скрещивание с семью индетерминантными линиями разновидности черри, имеющими плоды массой 10-15 г, а также, по результатам ДНК-анализа, аллели, определяющие качество плодов и устойчивость к болезням.
Результаты биометрических учетов по всем образцам представлены в таблице 3. В таблице 4 представлены значения признаков по группам родительских форм для сравнения влия-
ния на проявления признака каждого родителя. Согласно анализу высоты растений (табл. 3), изучаемые гибриды имели индетерминант-ный тип роста с высотой от 252,6 до 364,9 см, несмотря на различный тип роста материнских форм. Гибриды, проходившие испытание, образовали по 10-12 кистей на главном стебле. Максимальное значение данного признака (12,0-12,9 шт.) отмечено у гибридных комбинаций Линия С9464 х Линия 09, Линия С9464 х Линия 020, Линия №4 х Линия 08, Линия №4 х Линия 09, Линия 83 х Линия 020 и Линия №7 х Линия 09. Отмечается снижение количества кистей на главном стебле до 9,2-10,6 шт. в комбинациях скрещивания с Линией 046.
Количество плодов на кисти у гибридов изменялось от 6,2 до 19,0 и было меньше, чем у отцовских компонентов скрещивания (9,5-26,5). Максимальное число плодов на кисти у гибридов обеспечивало включение в скрещивания Линий 08, 020, 022 и Линии С 9464.
Анализ завязываемости плодов показал высокий процент (90,0-91,8%) у трех гибридных комбинаций: Линия С 9464 х Линия 08, Линия 83 х Линия 08 и Линия №7 х Линия 09.
Таблица 3
Результаты биометрических измерений растений томата черри, среднее за 2018-2019 гг.
Линии (гибриды) Высота растения, см± Количество кистей на главном стебле, шт. ± Среднее количество плодов на кисти, шт. ± Завязываемость плодов, %± % Всходы-начало созревания, дни± sx
Черри Коралл (стандарт) 270,4 ± 9,6 10,3 ± 0,3 5,1 ± 0,8 69,2 ± 0,6 101,0 ± 1,5
Линия 08 333,9 ± 23,9 12,2 ± 1,8 15,5 ± 5,5 75,8 ± 11,6 98,0 ± 4,5
Линия 09 280,5 ± 19,5 11,4 ± 1,6 9,6 ± 0,1 84,3 ± 10,7 94,0 ± 1,0
Линия 010 259,1 ± 30,9 11,0 ± 2,1 14,6 ± 2,1 56,3 ± 16,7 94,0 ± 1,0
Линия 020 277,9 ± 7,8 9,9 ± 0,1 25,3 ± 0,3 55,4 ± 13,2 122,0 ± 5,0
Линия 022 ^лекша) 252,0 ± 22,0 11,0 ± 1,0 26,5 ± 6,8 69,4 ± 5,8 94,0 ± 1,0
Линия 046 200,0 ± 50,0 10,8 ± 2,3 9,5 ± 0,3 69,5 ± 5,5 94,0 ± 1,0
Линия 049 200,1 ± 10,1 8,3 ± 1,3 13,6 ± 5,8 63,8 ± 9,5 94,0 ± 1,0
Линия С 9464 (ФМС) 151,0 ± 2,5 7,8 ± 0,2 0 0 -
Линия № 4 (ФМС + парт.) 91,3 ± 3,8 5,5 ± 0,2 4,4 ± 0,3 77,5 ± 0,5 94,0 ± 1,0
Линия 83 (ФМС) 262,5 ± 7,5 10,1 ± 0,3 0 0 -
Линия №7 (ФМС + nor) 170,8 ± 5,8 5,3 ± 0,5 1,4 ± 0,1 19,0 ± 1,0 -
Линия С 9464 х Линия 08 330,7 ± 2,7 10,4 ± 0,7 14,7 ± 2,0 90,7 ± 2,4 95,0 ± 1,5
Линия С 9464 х Линия 09 324,3 ± 4,3 12,0 ± 1,0 8,3 ± 1,4 80,9 ± 9,8 95,0 ± 1,5
Линия С 9464 х Линия 010 280,4 ± 17,1 11,0 ± 0,1 17,7 ± 8,0 88,4 ± 4,0 95,0 ± 1,5
Линия С 9464 х Линия 020 363,3 ± 5,8 12,5 ± 0,5 18,8 ± 2,7 85,8 ± 8,4 103,0 ± 3,0
Линия С 9464 х Линия 022 280,0 ± 15,0 10,7 ± 0,7 15,5 ± 3,0 80,9 ± 11,0 95,0 ± 1,5
Линия С 9464 х Линия 046 265,2 ± 2,7 10,6 ± 0,4 8,5 ± 0,8 69,5 ± 4,5 95,0 ± 1,5
Линия С 9464 х Линия 049 272,4 ± 28,3 9,9 ± 0,9 19,0 ± 8,3 71,7 ± 11,9 98,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 08 306,9 ± 43,1 12,9 ± 3,1 9,0 ± 0,3 87,5 ± 2,2 95,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 09 330,4 ± 53,6 12,3 ± 1,8 7,6 ± 0,1 88,1 ± 2,4 95,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 010 314,6 ± 32,9 11,1 ± 0,1 8,3 ± 1,2 87,1 ± 6,3 98,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 020 254,5 ± 40,5 10,9 ± 1,1 10,2 ± 2,0 88,8 ± 1,3 116,0 ± 11,0
Линия №4 х Линия 022 276,9 ± 36,9 11,3 ± 0,3 14,0 ± 0,2 81,9 ± 6,9 95,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 046 252,6 ± 22,6 9,7 ± 0,7 6,2 ± 2,7 61,0 ± 18,5 98,0 ± 1,5
Линия №4 х Линия 049 310,9 ± 29,1 11,6 ± 1,4 6,7 ± 0,4 81,1 ± 0,5 95,0 ± 1,5
Линия 83 х Линия 08 358,5 ± 21,5 11,4 ± 0,4 15,0 ± 1,5 91,8 ± 2,6 95,0 ± 1,5
Линия 83 х Линия 09 332,9 ± 34,6 11,9 ± 1,1 8,8 ± 0,5 87,6 ± 1,6 95,0 ± 1,5
Линия - 83 х Линия 010 279,4 ± 9,3 10,4 ± 0,4 9,8 ± 1,3 77,6 ± 12,8 95,0 ± 1,5
Линия 83 х Линия 020 291,6 ± 40,9 12,1 ± 0,9 12,8 ± 2,3 73,8 ± 4,0 98,0 ± 1,5
Линия 83 х Линия 022 347,4 ± 22,7 11,4 ± 0,6 11,9 ± 1,3 79,3 ± 3,5 106,0 ± 7,0
Линия 83 х Линия 046 297,9 ± 48,8 9,4 ± 2,4 7,5 ± 4,2 84,4 ± 6,3 101,0 ± 5,0
Линия 83 х Линия 049 289,4 ± 25,7 10,2 ± 0,9 8,8 ± 0,8 66,4 ± 11,3 98,0 ± 1,5
Линия №7 х Линия 08 315,0 ± 36,1 10,8 ± 0,3 9,4 ± 0,1 82,9 ± 5,9 101,0 ± 1,5
Линия №7 х Линия 09 364,9 ± 35,1 12,4 ± 1,7 7,6 ± 0,6 90,0 ± 7,6 101,0 ± 1,5
Линия №7 х Линия 010 282,3 ± 7,3 10,7 ± 0,4 11,1 ± 3,5 86,1 ± 3,3 104,0 ± 2,0
Продолжение таблицы 3
Линии (гибриды) Высота растения, см± Количество кистей на главном стебле, шт. ± Среднее количество плодов на кисти, ШТ. ± Sx Завязываемость плодов, %±sx- Всходы-начало созревания, ДНИ± Sx
Линия №7 х Линия 020 322,9 ± 7,9 10,8 ± 0,3 9,8 ± 1,3 79,7 ± 14,3 116,0 ± 4,0
Линия №7 х Линия 022 293,5 ± 6,0 10,7 ± 0,4 12,3 ± 1,7 89,2 ± 3,0 104,0 ± 2,0
Линия №7 х Линия 046 279,6 ± 25,4 9,2 ± 0,2 9,2 ± 0,2 85,4 ± 1,6 104,0 ± 2,0
Линия №7 х Линия 049 298,2 ± 6,8 11,0 ± 0,1 9,7 ± 0,6 79,9 ± 9,3 101,0 ± 1,5
Таблица 4
Средние значения биометрических признаков в группах гибридов с материнскими и
отцовскими линиями
Группы гибридов с линиями Высота растения, см Количество кистей на главном стебле, шт. Среднее количество плодов на кисти, шт. Завязываемость плодов, % Всходы-начало созревания, дни Общая урожайность, кг/м2 Масса плода, г
в Линия 08 327,80 11,4 12,00 88,20 97 7,08 21,82
в Линия 09 338,10 12,20 8,10 86,70 97 4,85 19,39
в Линия 010 289,20 10,80 11,70 84,80 98 6,93 25,19
в Линия 020 308,10 11,60 12,90 82,00 108 6,94 25,55
в Линия 022 299,50 11,00 13,40 82,80 100 7,32 23,96
в Линия 046 273,80 9,70 7,90 75,10 100 6,24 23,83
в Линия 049 292,70 10,70 11,10 74,80 98 6,94 26,90
$ Линия С9464 302,30 11,00 14,60 81,10 97 6,69 19,65
$ Линия № 4 292,40 11,40 8,90 82,20 99 6,40 27,57
$ Линия 83 313,90 11,00 10,70 80,10 98 5,52 19,18
$ Линия №7 308,10 10,80 9,90 84,70 104 7,84 28,82
У остальных гибридов значения этого признака были на уровне 61,0-89,2%. Не сформировали плоды стерильные Линия С 9464 и Линия 83. У Линии №7 отмечена завязываемость 19%, что свидетельствует о вероятности самоопыления и неустойчивой (незакрепленной) функциональной мужской стерильности. Продолжительность периода от всходов до начала созревания плодов у исследуемых гибридов находилась в пределах 95-116 дней. Скороспелыми оказались отцовские линии разновидности черри, включая Линию 022, районированную в 2018 году под названием Aлекша. Более ста дней для формирования зрелых плодов потребовалось стандарту Черри Коралл, Линии 020 (122 дня), несущей ген лежкости nor и большинству гибридов с ее участием, а также гибридам с Линией №7, которая также обладает геном леж-
кости nor. Завязываемость плодов в группах гибридов составляла 80,1-88,2%, за исключением комбинаций скрещивания с Линией 046 и Линией 049, в которых завязываемость снижалась до 74,8-75,1%. Более раннее получение зрелых плодов (в среднем через 97 дней после появления всходов) обеспечивает выращивание гибридов, полученных при вовлечении в скрещивание Линии 08, Линии 09 и Линии С 9464.
Значения основных признаков урожайности (товарная, общая урожайность и масса плода) изучаемых образцов томата черри представлены в таблице 5.
Aнализ данных по товарной урожайности за 2018-2019 годы показал максимальные значения признака у гибридных комбинаций с Линией №4 и Линией №7, формирующих более крупные плоды массой 24,46-33,40 г, которые
Таблица 5
Признаки урожайности томатов разновидности черри, среднее за 2018-2019 гг.
Линии (гибриды) Товарная урожайность, кг/м2 ± Общая урожайность, кг/м2± Масса плода, г
Черри Коралл (стандарт) 3,82 ± 0,10 4,34 ± 0,30 15,67 ± 0,10
Линия 08 2,95 ± 1,20 3,47 ± 1,60 9,17 ± 2,20
Линия 09 1,91 ± 0,60 2,17 ± 0,70 8,20 ± 0,80
Линия 010 4,91 ± 1,50 5,61 ± 2,10 9,06 ± 1,40
Линия 020 5,99 ± 1,30 6,63 ± 1,70 14,69 ± 0,90
Линия 022 (Алекша) 5,36 ± 1,80 5,61 ± 1,80 7,42 ± 0,10
Линия 046 3,06 ± 0,50 3,92 ± 1,20 9,73 ± 1,90
Линия 049 4,55 ± 1,00 4,83 ± 1,20 9,35 ± 0,20
Линия С 9464 (ФМС) 0 0 0
Линия № 4 (ФМС + парт.) 5,90 ± 1,50 6,63 ± 1,40 64,59 ± 1,90
Линия 83 (ФМС) 0 0 0
Линия №7 (ФМС + пог) 0 4,20 ± 0,30 70,33 ± 4,80
Линия С 9464 х Линия 08 7,01 ± 1,60 7,50 ± 1,80 16,26 ± 4,00
Линия С 9464 х Линия 09 3,45 ± 1,10 3,92 ± 1,50 13,73 ± 0,50
Линия С 9464 х Линия 010 5,91 ± 2,40 6,55 ± 2,90 22,31 ± 0,20
Линия С 9464 х Линия 020 6,68 ± 1,30 7,41 ± 1,90 19,53 ± 1,40
Линия С 9464 х Линия 022 6,9 ± 1,30 7,26 ± 1,50 22,14 ± 0,70
Линия С 9464 х Линия 046 6,77 ± 0,80 7,04 ± 0,90 21,35 ± 1,80
Линия С 9464 х Линия 049 6,47 ± 1,50 7,16 ± 2,00 22,23 ± 1,40
Линия №4 х Линия 08 6,82 ± 1,90 7,28 ± 2,20 24,69 ± 0,90
Линия №4 х Линия 09 5,53 ± 1,20 5,91 ± 1,50 24,46 ± 0,50
Линия №4 х Линия 010 7,20 ± 2,80 7,84 ± 3,40 29,1 ± 0,80
Линия №4 х Линия 020 5,76 ± 0,90 6,07 ± 1,20 33,4 ± 1,70
Линия №4 х Линия 022 7,16 ± 1,10 7,57 ± 1,40 26,34 ± 2,00
Линия №4 х Линия 046 4,96 ± 0,60 5,3 ± 0,70 27,61 ± 9,10
Линия №4 х Линия 049 4,56 ± 0,40 4,81 ± 0,50 27,4 ± 0,90
Линия 83 х Линия 08 5,06 ± 0,30 5,80 ± 0,80 16,98 ± 0,90
Линия 83 х Линия 09 3,15 ± 0,40 3,85 ± 0,90 14,41 ± 1,50
Линия 83 х Линия 010 5,1 ± 1,30 5,58 ± 1,70 19,92 ± 4,10
Линия 83 х Линия 020 4,97 ± 0,80 5,70 ± 1,40 23,2 ± 5,60
Линия 83 х Линия 022 5,57 ± 1,80 6,10 ± 2,20 17,77 ± 0,20
Линия 83 х Линия 046 5,21 ± 1,00 5,40 ± 1,10 17,33 ± 1,90
Линия 83 х Линия 049 5,80 ± 1,20 6,20 ± 1,60 24,68 ± 4,20
Линия №7 х Линия 08 7,32 ± 2,70 7,73 ± 2,80 29,34 ± 4,00
Линия №7 х Линия 09 5,07 ± 0,40 5,71 ± 0,90 24,94 ± 0,20
Линия №7 х Линия 010 7,13 ± 3,00 7,76 ± 3,60 29,43 ± 6,00
Продолжение таблицы 5
Линии (гибриды) Товарная урожайность, кг/м2 ± % Общая урожайность, кг/м2± % Масса плода, г ±%
Линия №7 х Линия 020 7,66 ± 0,10 8,57 ± 0,50 26,08 ± 11,80
Линия №7 х Линия 022 7,87 ± 2,60 8,34 ± 3,00 29,6 ± 2,40
Линия №7 х Линия 046 6,89 ± 0,60 7,20 ± 0,70 29,04 ± 2,50
Линия №7 х Линия 049 8,83 ± 2,20 9,58 ± 2,70 33,28 ± 2,20
НСР05 для фактора генотипы 1,633 1,865 4,202
можно отнести к коктейльным формам. Достоверное превышение стандарта Черри Коралл по товарной урожайности на 44,76-131,2% отмечено у большинства гибридов с Линией С 9464, Линией №4 и Линией №7, а также в комбинациях скрещивания Линия 83 х Линия 022 и Линия 83 х Линия 049. Восемь гибридов продемонстрировали достоверное превосходство над районированным с 2018 года стандартом Алекша на 30,78-64,74%.
Общая урожайность, включающая как товарную, так и нетоварную часть продукции, является мерой оценки потенциальной возможности образцов накапливать ассимиля-ты в плодах томата. Высокой товарностью плодов (более 95%) отличались четыре гибрида. Общей урожайностью на уровне 6,55-9,58 кг/м2 характеризовалось большинство гибридов с Линией С 9464 и Линией №7, а также три гибрида с Линией №4. Достоверное превышение лучшего стандарта Алекша по общей урожайности отмечено у семи гибридных комбинаций.
Признак «средняя масса товарного плода» имеет определяющую роль в селекции томата черри. Оптимальной средней массой товарного плода считается от 10 до 25 граммов. В наших исследованиях был подобран отцовский компонент скрещивания с массой плода 10-15 граммов с целью снижения массы плода у гибридов, так как в качестве материнского компонента использовались достаточно крупноплодные стерильные линии. Плоды с оптимальной массой для томата черри сформированы в гибридных комбинациях с линиями С 9464 и 83 (в среднем 13-23 г). Растения гибридных комбинаций с линиями №4 и №7 образовали плоды массой более 25 граммов и относились в большинстве случаев к коктейльным.
По результатам изучения хозяйственно ценных признаков выявлены 10 гибридных комбинаций, сочетающих высокие значения урожайности с оптимальной массой плода для томата черри: Линия C 9464 х Линия 08; Линия C 9464 х Линия 010; Линия C 9464 х Линия 020; Линия C 9464 х Линия 022; Линия C 9464 х Линия 046; Линия C 9464 х Линия 049; Линия №4 х Линия 08; Линия 83 х Линия 08; Линия 83 х Линия 022 и Линия 83 х Линия 049. После сопоставления полученных данных с результатами 2020 года лучшая форма будет передана для оценки в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений.
Заключение
В результате апробации известных маркеров к аллелю ps-2, детерминирующему функциональную мужскую стерильность (нерастрески-ваемость пыльцы), установлена наибольшая эффективность выявления гомозиготных аллелей с помощью маркера ps-2_TaiI (Gorguet B. и др., 2009). Для повышения эффективности идентификации гетерозиготных аллелей ps-2/ Ps-2 разработан и успешно апробирован Tetra-primer ARSM-PCR.
Созданы 28 гибридов Fj между крупноплодными формами с ФМС и линиями томата черри, проведены их двухлетние испытания. Выделены лучшие гибридные комбинации с высокими значениями урожайности в сочетании с оптимальным размером (16,26-26,34 г) плода для томатов черри, превосходящие стандарт Алекша по ранней урожайности на 0,70-1,26 кг/м2, по общей урожайности — на 0,49-1,96 кг/м2 с целью дальнейшей передачи в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений.
По результатам ДНК-типирования и фе-нотипической оценки из расщепляющихся популяций F2-F3 полученных гибридов, а также F4-F5 ранее созданных выделены линии томата черри на стерильной основе (с аллелемр$-2) с комплексом генов качества (В из & реппеПи, Ь из & 1усорег&1сит, пог, и) и устойчивости (1-2,1-2С, М1 1.2, С/-4, С/-4А; С/-5 С/-9, Тт22). Созданные линии томата черри на основе ФМС могут служить материнскими линиями для создания новых гибридов с упрощенной системой семеноводства. Выполнены скрещивания по двум схемам топкросса с участием пятнадцати материнских форм на основе ФМС и шести отцовских форм томата черри для дальнейшего изучения. Полученные результаты позволяют повысить эффективность селекционного процесса томата черри путем сочетания в новых образцах одновременно признаков урожайности, качества плодов, устойчивости к болезням в результате использования методов молекулярного маркирования, а также классических методов гибридизации и отбора.
Список использованных источников
1. Агапов, А. С. Использование стерильных линий в селекции тепличных томатов // Генотип и среда в селекции тепличных томатов: Материалы совещ. рабочей группы по томатам (Ленинград, 16-20 мая 1978 г.) / А. С. Агапов // ЕУКАРПИА, Селекция овощных культур. - Л.: ВИР, 1978. - С. 36-40
2. Георгиев, Х. Функциональная стерильность у томатов и ее использование в гибридном семеноводстве / Х. Георгиев, Б. Атанасо-ва // Исслед. по генетике и селекции. - София, 1983. - С. 127-129.
3. Кильчевский, А. В. Изучение партено-карпических гетерозисных гибридов Fj томата на основе функциональной мужской стерильности в пленочных необогреваемых теплицах / А. В. Кильчевский, М. М. Добродь-кин // Сб. науч. тр. / Бел. с.-х. акад. - Горки, 1998. - Состояние и перспективы развития плодоводства и овощеводства в современных условиях. - С. 23-28.
4. Staniaszek, M. The Novel ps and ps-2 Specific Markers for Selection of Functional Male Sterile Tomato Lines in Breeding Programs and Hybrids Seed Production / M. Staniaszek [et al.] // Journal of Agricultural Science. - 2012 -Vol. 4, № 10. - P. 61-67.
5. Gorguet, B. Ps-2, the gene responsible for functional sterility in tomato, due to non-dehiscent anthers, is the result of a mutation in a novel polygalacturonase gene / B. Gorguet [et al.] // Theor Appl Genet. - 2009. - Vol. 118. -P. 1199-1209.
6. Sha, Z. Development of SSR and CAPS molecular markers linked with ps-2 gene in tomato / Z. Sha [et al.] // Acta Horticulturae Sinica. - 2010. - Vol. 37, № 2. - P. 235-240.
7. Кильчевский, А. В. ДНК-типирование генов качества плодов и устойчивости к болезням томата: методические рекомендации / А. В. Кильчевский [и др.]. - Минск: Право и экономика. - 2016. - 41 с.
8. Babak, O. G. Genetic bases of tomato marker-assisted selection in Belarus / O. G. Babak [et al.] // Eurobiotech. J. - 2018. -Vol. 2, № 2. -P. 128-135. doi: 10.2478/ebtj-2018-0017.
9. Кильчевский, А. В. Изучение хозяйственно ценных признаков томата типа черри в защищенном грунте А. В. Кильчевский [и др.] // Вестник Белорусской государственной сельскохозяйственной академии. - № 1. - 2017. - C. 71-76.
O. G. Babak1, N. A. Nekrashevich1, N. V. Anisimova1, K. K. Yatsevich1, T. V. Nikitinskaya1, N. Y. Leshchina2, T. V. Nikonovich2, I. G. Pugachova2, M. M. Dobrodkin2, A. V. Kilchevsky1
DEVELOPMENT OF CHERRY TOMATO Ft HYBRIDS WITH FUNCTIONAL STERILITY USING CLA SSICAL AND MARKER-ASSISTED BREEDING METHODS
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya Str., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: O.Babak@igc.by 2Belarusian State Agricultural Academy 5, Michurin St., 213407 Gorki, the Republic of Belarus
As a result of testing of known markers to the positional sterility-2 (ps-2) allele, which determines functional male sterility (FMS), the highest efficiency in detecting of homozygous alleles using the ps-2_TaiI marker was achieved. In order to increase efficiency in the identification of heterozygous ps-2/PS-2 alleles, the Tetra-primer ARSM-PCR was developed and successfully tested. Twenty eight F1 hybrids between large-fruited forms with FMS and cherry tomato lines were developed, and their two-year testing was conducted. Best hybrid combinations with high yielding values in combination with the optimal fruit size (16-26 g) for cherry tomatoes were chosen exceeding the Aleksha standard in an early yield by 0.70-1.26 kg/m2 and in the total yield by 0.49-1.96 kg/m2 for their further transfer to the State Seed Inspectorate. Based on the results of DNA typing and phenotypic evaluation, cherry tomato lines on a sterile basis (with the ps-2 allele) with a complex of quality (B from S. pennellii, b from S. lycopersicum, nor, and u) and resistance (I-2, I-2C, Mi 1.2, Cf-4, Cf-4A; Cf-5 Cf-9, Tm22) genes were distinguished in F2-F5 populations. Cherry tomato lines developed on the basis of FMS may serve as maternal lines for developing new hybrids with a simplified seed production system.
Keywords: cherry tomato, DNA typing, ps-2 gene markers, functional male sterility, yield traits.
Дата поступления статьи: 16 сентября 2020 г.
