CC BY
19
YIELD AND INDEXES OF QUALITY OF CORN WHEN USING BROWN COAL AND GLAUCONITE IN NORMAL AND NANOSTRUCTURAL FORM
Gazizov R.R, Yapparov A.Kh., Sukhanova I.M, Sidorov V.V., Yapparova L.M.
Summary
The greatest increase in the yield of green mass of corn was obtained with the complex treatment of seeds with nanostructured coal and foliar treatment of corn with a 0.4% suspension of NVGS at doses of 1.25 and 0.25 kg / per seeding rate per hectare. A significant increase in yield was 63.8 g / vessel and 78.4 g / vessel (15% and 19%), respectively, compared with the background, the weight of the cobs increased by 20 and 18.8%. The introduction of brown coal at a rate of 5 t / ha also contributed to the good responsiveness of corn plants and the production of an additional crop of 69.9 g / vessel, which is 17% more compared to the background. The largest accumulation of potassium in the green mass of maize was noted in variants with presowing treatment of maize seeds in doses of 1.25 and 0.25 kg per hectare seeding rate and foliar spraying of plants during vegetation in a concentration of 0.4%. The increase was 4.9% and 6.7% compared to the background. An increase in cellulose in maize seeds was noted in all the studied variants compared to control and background.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-236-4-67-72 УДК 619:615.33.637
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКА
ЦИНКБАЦИТРАЦИНА
Галяутдинова Г.Г. - к.б.н., Босяков В.И., - вед. инженер, *Хайруллин Д.Д. - к.б.н., доцент, Егоров В.И. - к.б.н.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» *ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».
Ключевые слова: антибиотик, цинкбацитрацин, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), комбикорм.
Key words: antibiotic, zincbacitracin, high performance liquid chromatography (HPLC), compound feed.
Здоровье населения во многом обуславливается тем, насколько экологически чистую пищу получает человек. Угроза некачественного питания серьезно выросла с усилением антропогенной нагрузки на объекты окружающей среды, повсеместным применением лекарственных средств. В настоящее время антибиотики широко используются в животноводстве для лечения и профилактики различных заболеваний сельскохозяйственных животных, а также в качестве кормовых добавок для увеличения их массы тела.
Бацитрацин является одним из наиболее часто применяемых кормовых анти-
биотиков в качестве антимикробного профилактического и ростостимулирующего средства при выращивании и откорме животных и птиц. Преимущество с точки зрения скорости и эффективности увеличения привеса, снижение смертности и заболеваемости отмечено при использовании антибиотика на всех этапах роста животных. Мясо, полученное от таких животных, лучшего качества с большим содержанием белка и меньшим количеством жира. Следовательно, нет никаких сомнений в важной роли антибиотиков в прибыльном и эффективном производстве скота. Однако при неправильном или не-
целесообразном использовании антибиотиков, остатки бацитрацина могут попадать в пищевую продукцию животного происхождения и причинять вред здоровью потребителя. Систематическое поступление в организм антибиотиков служит фактором риска для различных аллергических реакций, нарушения обмена веществ, дисбактериоза, подавляет активность некоторых ферментов, изменяет микрофлору кишечника, провоцирует апластическую анемию [3]. Учитывая текущую ситуацию в области методик определения качества кормов, актуальным является разработка высокоэффективных методов пробо-подготовки и анализа. Наибольшей перспективностью в данном направлении обладают методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными режимами обнаружения, такими как ультрафиолетовый (УФ), флуоресцентный и масс-спектрометрия [1; 2]. Ультрафиолетовое детектирование имеет более низкую чувствительность, чем масс-спектрометрия. Флуоресцентный метод является менее высокочувствительным и селективным, по сравнению с масс-спек-трометрией, но более доступен и обладает достаточно низкой себестоимостью.
Целью проведенных исследований являлась разработка хроматографического метода идентификации и количественного определения антибиотика цинкбацит-рацина в кормах методом ВЭЖХ на разных детекторах.
Материал и методы исследований. Искусственная затравка корма проводилась стандартным раствором цинкба-цитрацина, с содержанием действующего вещества не менее 90% (European Pharmacopeia Reference Standard). Образцы корма, свободные от антибиотика, были использованы в качестве контрольного материала. Все химические вещества и растворители были аналитической или ВЭЖХ класса чистоты.
Для проведения исследований и разработки определения цинкбацитрацина применялись жидкостные хроматографы Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным
детектором, Spectra Physics Spectra 100 с УФ-детектором, флуоресцентный спектрометр Hitachi 850 с проточной ячейкой в качестве детектора. Разделение проводили на колонках ReproSil-Pur ODS 150 х 4 мм 5 мкм, ReproSil ODS -AC 18 (5 мкм) (250:4 мм), Equisil BDS -С18 (250 x 4,6мм) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы. Оптимальные аналитические результаты получены при использовании колонки Reprosil ODS -AC 18 с подвижной фазой ацетонитрил - метанол (1:3 v/v) - водным раствором КН2РО4 (0,05М рН=6,0) (60:40 v/v). Вышеуказанные режимы хромато-графирования дали удовлетворительные результаты как на УФ, так и на флуоресцентном детекторе. Выделение ВС-А, ВС- В1, ВС- В2 и ВС-В3 и ВС-F было достигнуто без разложения компонентов при УФ детектировании на хроматографах Agilent 1260 Infinity и Spectra Physics Spectra 100 при длине волны 254 нм [4].
Результаты исследований. Сущность метода основан на экстракции остаточного количества антибиотика цинкба-цитрацина по мажорному активному компоненту бацитрацина А из анализируемой пробы, качественном и количественном его определении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением обращено-фазовой колонки и диодно-матричного детектора при длине волны 254 нм. Из средней пробы комбикормового сырья методом квартования выделяли около 100г материала, размалывали без предварительного подсушивания и просеивали через сито. Остаток на сите измельчали и добавляли к пробе, затем перемешивали. Из полученного материала отбирали навеску 5г корма, экстрагировали меаническим встряхиванием в течение 20 мин с 20 мл 1,5 мМ водного раствора трилона Б и 20 мл 1 % ТХК (или 10 мл если комбикорм влажный). Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирали жидкий слой и к нему добавляли 150 мл деионизированной воды. Нерастворенную
матрицу корма обрабатывали 30 мл метанола и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Полученный верхний слой объединяли с первой фракцией и доводили объем до 200 мл деионизированной водой. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Отбирали из полученного экстракта 10 мл в пробирку.
Очистку путем твердофазной экстракции осуществляли на картридже Oasis HLB 3 см х 60мг. Предварительно картридж конденсировали 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН~4,0). Полученный экстракт пропускали через картридж со скоростью 1 мл/мин. Картридж сушили на вакууме под давлением 20 мм.рт.ст. и промывали 5 мл
бидистиллированной воды. Элюировали по 2,5 мл метанола 2 раза. Элюат выпаривали под слабым током азота при 35оС до 1 мл и добавляли 2 мл раствора (0,05М калия фосфорнокислого 1-замещенного (КН2РО4), ацетонитрила и метанола в соотношении 40/15/45). При необходимости полученный раствор пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Конечный объем использовали для ВЭЖХ анализа. Полученная хроматограмма стандартного раствора и опытной пробы цин-кбацитрацина на хроматографе Agilent 1260 Infinity с диодноматричным детектором представлена на рисунке 1 . Результаты исследований по определению цинк-бацитрацина в искусственно зараженных пробах корма отражены в табл.1.
Рисунок 1 - Хроматограмма стандартного раствора цинкбацитрацина и опытной пробы. Колонка Reprosil ODS -AC 18 250*4 мм, температура колонки 25оС, скорость потока 1,0 мл/мин, элюент - ацетонитрил, метанол, 0,05 М калия фосфорнокислого 1-замещенного (КН2РО4), детектирование при 254 нм.
Таблица 1 - Среднее значение определения цинкбацитрацина в искусственно зараженных пробах корма методом ВЭЖХ_
Название антибиотика Доза искусственного заражения, мг/кг Количество обнаруженного антибиотика, мг/кг Полнота определения, %
Цинкбацитр ацин 0,01 0,008±0,001 80
Опыты по апробации проведены в 3-х повторностях. Нижний предел определения цинкбацитрацина в комбикорме составляет 0,01 мг/кг. Степень определяемо-сти из проб равна 80 %. За окончательный
В молекуле цинкбацитрацина кроме гидроксильных и карбонильных групп также содержится аминогруппа, которую можно дериватизировать для получения флуоресцентных соединений [6]. С целью повышения чувствительности цинкбацитрацина произведена дериватизация первичных аминогрупп в боковой цепи аминокислот ВС с ортофталевым диаль-дегидом (OPA) в присутствии 2-
;-JI í 1411. SÍ : 41
Заключение. В результате проведенных исследований получена оптимальная схема пробоподготовки образцов корма для последующего определения методом ВЭЖХ, включающая твердофазную и жидкостную экстракции.
Была проведена работа по подбору условий хроматографирования, выбору
результат измерения принимали среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляли до второго десятичного знака.
меркаптоэтанола, что дало возможность усилить флуоресценцию изоиндольных продуктов (рис. 4) и позволило идентифицировать мажорный компонент бацитрацин-А на хроматографе Hitachi 850 при концентрациях 5-10 мкг/мл [5]. Полученная хроматограмма с разделенными компонентами цинкбацитрацина на флуоресцентном спектрометре Hitachi 850 иредставлена на рисунке 2.
_______
с использованием
колонки и сорбента, подбору элюента и его состава, выбору режима хромато-графирования.
Разработан метод определения цинкбацитрацина в стандартных и опытных образцах с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и предколоночной дериватизацией ортофталевым диальдеги-
Таблица 2 - Метрологические характеристики метода определения цинкбацитрацина в кормах_
Статистический параметр Значение параметра
Нижний предел определения, мг/кг 0,01
Интервал надежного определения, мг/кг 0,01-1,0
Среднее значение открываемости (показатель правильности), % 95,5
Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений цинкбацитрацина, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р=0,95%, не должно превышать, % 7,0
Рисунок 2 - Разделение компонентов цинкбацитрацина флуоресцентного спектрометра Hitachi 850
дом для обнаружения флуоресцентным детектором.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Барам, Г.И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе / Г.И. Барам, Д.В. Рейхарт, Е.Д. Гольдберг // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. -Т.135. - №1. - С.75-79.
2. Барам, Г.И. Высокоэффективная жидкостная хроматография в контроле качества лекарственных средств / Г.И. Барам, Д.В. Рейхарт, Е.Д. Гольдберг // Фарматека. - 2005. - № 2. - С. 12-16.
3. Потехин, А.В. Мониторинг анти-биотикорезистентных изолятов Аctinoba-аПш Рleuropneumoniae, выделенных в Российской Федерации в 2012-2014 гг. / А.В. Потехин // Ветеринария сегодня. -2016. - № 1. - С. 24-26.
4. Singh, S.P. Validation of an analytical methodology for determination of tetracyclines residues in honey by UPLC -MS/MS detection Indian Journal of Natural Products and Resources / S.P. Singh, A. Pundhir // Natural Products and Resources -2015. - Vol. 6(4). - P. 293-298.
5. Pavli, V. Optimization of HLPC method for stability testing of bacitracin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis / V. Pavli, V. Kmetec // Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2001. -Vol.24 (10). - P. 977-980.
6. Potts, A.R. Validation of quantitative HLPC method for bacitracin and zinc bacitracin using EDTA as a mobilephase modifier. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis / A.R. Potts, T. Psurek // Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2012. - Vol.70. - P. 619-623.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКА
ЦИНКБАЦИТРАЦИНА
Галяутдинова Г.Г., Босяков В.И., Хайруллин Д.Д., Егоров В.И.
Резюме
На основе проведенных исследований методами ВЭЖХ, используя диодно-матричный, ультрафиолетовый и флуоресцентный детекторы, произведен анализ состава цинкбацитрацина. Предложено использовать для извлечения антибиотика из корма эффективный прием пробоподготовки на основе ацетонитрила/метанола/водного раствора КН2РО4 (0,05М, рН=6,0) (15:45:40 v/v/v), а также для твердофазной экстракции отобран картридж Oasis HLB с содержанием полимерного сорбента, обладающего одновременно свойствами гидрофильности и липофильности. Разработан метод идентификации цинкбацитрацина с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с предколоночной дериватизацией с ортофталевым диальдегидом для усиления флуоресценции. По диапазону определяемых содержаний данная методика позволит определить следовые количества антибиотика на уровне допустимых дифференцированных норм вводимых при изготовлении полнорационных комбикормов, премиксов, белково-витаминных добавок, заменителей цельного молока.
CHROMATOGRAPHIC METHODS DETERMINATION OF ZINCBACITRACINE
ANTIBIOTIC
Gаlyautdinova G.G., Bosyakov V.I., Khairullin D.D., Egorov V.I.
Summary
Based on the conducted studies using HPLC methods, using diode-matrix, ultraviolet and fluorescent detectors, the composition of zincbacitracin was analyzed. It has been proposed to use for effective extraction of antibiotic from the feed an effective intake of sample preparation on the
basis of acetonitrile / methanol / aqueous solution КН2РО4 (0,05М, рН=6,0) (15:45:40 v/v/v), as well as for solid-phase extraction, the Oasis HLB cartridge was selected with a polymer sorbent content that simultaneously possesses hydrophilicity and lipophilicity properties. A method for identifying zincbacitracin by reversed-phase HPLC with pre-columnar derivatization with ortho-phthalic dialdehyde was developed to enhance fluorescence. Based on the range of detectable contents, this technique will allow to determine the trace amounts of antibiotic at the level of permissible differentiated standards of full-feed mixed fodders, premixes, protein-vitamin supplements, and whole milk substitutes.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-236-4-72-76 УДК 619:577.114:636.064:599.323.45
ВЛИЯНИЕ ПОЛИСАХАРИДА «РАСПОЛ» НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЦЫПЛЯТ
Гарипов С.М. - аспирант ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: гематологические показатели, полисахарид, иммуностимулятор, цыплята, биохимические показатели.
Key words: hematological parameters, rats, polysaccharide, immunostimulator, chickens, biochemical parameters.
Одной из важнейших задач для эффективного ведения животноводства является сохранение здоровья молодняка. В условиях ведения промышленного животноводства молодняк подвергается воздействию различных неблагоприятных факторов, таких как нарушение норм кормления, скученность содержания, нарушение микроклимата и санитарного состояния помещений, а также воздействие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [1,3]. Все эти факторы негативно влияют на иммунный статус животных и приводят к возникновению заболеваний [4,7].
В настоящее время как одно из перспективных направлений повышения защитных сил организма используются иммуномодуляторы, воздействующие непосредственно на активизацию адаптационных способностей и иммунобиологического статуса организма животных[2]. В последнее время большое внимание уделяется поиску и изучению средств, оказывающих влияние на иммунные реакции организма. Многие исследователи свя-
зывают иммуномодулирующие свойства растений и фитопрепаратов с полисахаридами [5,6].
Целью наших исследований было разработать схему применения «Распол» в качестве иммуностимулятора при вакцинации цыплят против инфекционного бронхита.
Материал и методы исследований. Исследования проводили на 45 цыплятах яичного направления кросса «Ломанн ЛСЛ». Контроль за подопытными цыплятами проводили до достижения ими 16-недельного возраста. Птице первой группы двукратно с интервалом в 3 дня вводили гетерополисахарид «Распол» в дозе 133,2 мг/кг за 3 дня и в день вакцинации. Вторая группа цыплят получала «Рас-пол» в такой же дозе в день вакцинации и через три дня после неё.
Контролем при этом служили 15 цыплят, которых вакцинировали против инфекционного бронхита кур без иммуностимулятора. Схема опыта представлена в таблице 1.
