CC BY
24УДК 619:615.33.637
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОРМОВОГО АНТИБИОТИКА ЦИНКБАЦИТРАЦИНА
Г.Г.Галяутдинова - кандидат биологических наук, ст.н.с.; В.И.Босяков - вед.инженер лаб. хим. анализа; Н.Г.Шангараев - зав. лаб. хим. анализа; В.И.Егоров - кандидат биологических наук,
зав. лаб. пестицидов.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научныйгородок-2, тел.+7(843)239-53-20, е-mail: vnivi@mail.ru).
Целью исследований был поиск оптимальных режимов и условий хроматографирования методом ВЭЖХ для идентификации антибиотика цинкбацитрацина. В экспериментах использовали стандарт цинкбацитрацина, содержащий 90% действующего вещества (European Pharmacoponia Reference Standard). Для проведения исследований и разработки метода определения цинкбацитрацина применяли жидкостные хроматографы Agilent 1260 Infinitu с ди-одно-матричным детектором, Spectra Physics Spectra 100 с УФ-детектором, флуоресцентный спектрометр Hitachi 850 с проточной ячейкой в качестве детектора. Разделение проводили на колонках ReproSil-Pur ODS 150*4 мм 5 мкм, Repro Sil ODS -AC 18 (5 мкм) (250:4 мм), Equisil BDS - С18 (250*4,6 мм) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы. Установлена ВЭЖХ система для аналитического и препаративного разделения компонентов антибиотика цинкбацитрацина. Оптимальные аналитические результаты были получены при использовании колонки Reprosil ODS -AC 18 с подвижной фазой ацетонитрил-метанол (1:3 v/v) - водным раствором КН2РО4 (0,05М рН=6,0) (60:40 v/v). Выше указанные режимы хроматографирования дали удовлетворительные результаты как на УФ, так и на флуоресцентном детекторе. Выделение ВС-А, ВС- В1, ВС-В2 и ВС-В3 и ВС-F было достигнуто без разложения компонентов при УФ детектировании на хроматографах Aggilent 1260 Infinitu и Spectra Physics Spectra 100 при длине волны 254 нм. Использованиие предколоночной дериватизации с орто-фтальдиальдегидом в присутствии 2-меркаптоэтанола позволило идентифицировать мажорный компонент ВС-А на хроматографе Hitachi 850 при концентрациях 5-10 мкг/ мл. В качестве мобильного модификатора фазы для усиления чувствительности пиков бацитрацина при низких концентрациях отобран 0,1 М раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в водной части подвижной фазы. Таким образом, на основе проведенных исследований методами ВЭЖХ, используя диодно-ма-тричный, УФ- и флуоресцентный детекторы, произведен анализ состава цинкбацитрацина. Показана возможность повышения чувствительности ВЭЖХ анализа при добавлении эквимолярного количества ЭДТА в подвижную мобильную фазу. Разработан метод идентификации ZnB с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с предколоночной дерива-тизацией с ортофталевым диальдегидом для усиления флуоресценции.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антибиотики, цинкбацитрацин, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), комбикорм.
В России в качестве кормовых (ростостимули-рующих) препаратов разрешено использовать только антибиотики немедицинского назначения, не применяющиеся в ветеринарной практике как лечебные и профилактические средства. Цинкбацитрацин является одним из наиболее часто используемых кормовых антибиотиков. В корма разрешается добавлять препараты антибиотика цинкбацитрацина, вырабатываемые промышленным способом. Промышленность для этого выпускают следующие препараты цинкбацитрацина: бациллихин-10, бациллихин-20, бацилли-хин-30, в 1 г которого содержится соответственно 10, 20 или 30 мг антибиотика цинкбацитрацина [2].
Однако, эффективное использование антибиотиков возможно лишь при соблюдении требований дозированного использования препаратов в соответствии с установленными нормами, равномерное смешивание с кормами, своевременное исключение из рациона перед сдачей животных на убой.
Нарушение этих условий приводит не только к снижению эффективности от применения антибиотиков,
но и может вызывать ряд нежелательных последствий, вплоть до возникновения опасности для здоровья человека за счет проявления ярко выраженных токсичных и аллергенных свойств.
В связи с этим, одним из главных мероприятий по обеспечению безопасности животноводческой продукции от загрязненности антибиотиками является необходимость разработки высокочувствительных и доказательных методов их определения в объектах ветеринарного надзора [1].
В отсутствие химических методов определения ВС традиционно использовались микробиологические методы, иммуноферментный анализ (ИФА), колоночная хроматография и тонкослойная хроматография (ТСХ).
При использовании ИФА, проведении микробиологических исследований, колоночной хроматографии и ТСХ возможно лишь качественное определение цинкбацитра-цина. Однако эти методы недостаточно специфичны, могут давать ложноположительные результаты, а продолжительность анализа достигает нескольких часов и не могут определить отдельные компоненты бацитрацина [3].
Цинкбацитрацин - смесь полипептидных антибиотиков, причем каждое вещество в смеси обладает сложной структурой. Бацитрацин представляет собой полипептидный антибиотик с различными активными компонентами в виде А1, В1, В2 и В3, обладающие основным терапевтическим ¡значением, в то время как бацитрацин F представляет собой продукт разложения, который показывает нейротоксичность. Это означает, что анализ содержания бацитрацина в пробах - непростая задача. Кроме того, в качестве кормовых добавок используются смеси, содержащие и другие вещества различного происхождения и целевого назначения. Это еще больше осложняет определение бацитрацина в корма и пищевых продуктах [4].
Монография Фармакопии США для цинкбацитраци-на включает композиционный тест, который содержит изократические нормы для метода ВЭЖХ, при котором содержание бацитрацина А должно быть не менее 40%, и не менее 70% от суммы бацитрацинов А, В1, В2, В3 и не более 6% от продукта деградации бацитрацина F [6].
Предел композиции форм бацитрацина служат уровни качества стандарта цинкбацитрацина. Коммерческий бацитрацин представляет смесь сходных полипептидов. Часто он используется в виде комплекса с цинком (Zn-BC), поскольку эта комбинация более стабильна, чем только ВС [5].
Таким образом, актуальность проблемы как качественного, так и количественного анализа антибиотических лекарственных препаратов в кормах является очевидной.
Целью исследований являлось разработка хро-матографического метода идентификации кормового антибиотика цинкбацитрацина методом ВЭЖХ.
Материалы и методы. В экспериментах использовался стандарт цинкбацитрацина, содержащий 90%действующего вещества (European Pharmacoponia Reference Standard).
Для приготовления подвижной фазы использовались следующие реактивы: ацетонитрил,.ч.; калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.; калий фосфорнокислый двузамещенный, ч.; натрий фосфорнокислый
однозамещенный, ч.; натрий фосфорнокислый двузамещенный, х.ч; натрий тетраборнокислый, ч.; метанол, х.ч.; этилацетат, х.ч.; динатриевая соль этилендиаминтетра-уксусной кислоты (ЭДТА), ортофосфорная кислота.
Стандартные растворы с концентрациями 5-10 мг/кг готовили в водном растворе этанола (50/50, v/v). Полученный раствор хранили в холодильнике при +40С.
Для проведения исследований и разработки определения цинкбацитрацина применялись жидкостные хроматографы Agilent 1260 Infinitu с диодно-матрич-ным детектором, Spectra Physics Spectra 100 с УФ-де-тектором, флуоресцентный спектрометр Hitachi 850 с проточной ячейкой в качестве детектора. Разделение проводили на колонках ReproSil-Pur ODS 150 х 4 мм 5 мкм, ReproSil ODS -AC 18 (5 мкм) (250:4 мм), Equisil BDS -С18 (250 x 4,6 мм) в режиме градиентного элюи-рования подвижной фазы.
Результаты исследований. Одним из важнейших разделов в разработке ВЭЖХ метода анализа стал вопрос подбора оптимального состава подвижной фазы. Было изучено несколько вариантов систем с различными концентрациями и соотношениями: от 45% до 55% 0,01М аммония ацетата и от 45% до 100% метанола. Далее состав фазы был изменен с целью получения наилучшего разделения при минимальном времени анализа. Были изучены трехкомпонентные системы: ацетонитрил-метанол (1:1 v/v) - водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0) (49:51 v/v) и ацето-нитрил-метанол (1:1 v/v) - водный раствор КН2РО4 (0,05М, рН=6,0) (60:40 v/v). Последняя система была отобрана в качестве оптимальной подвижной фазы для хроматографической колонки Reprosil ODS - AC 18. Компоненты ВС были полностью разделены на основные пики ВС-А, ВС-В1, ВС-В2 и ВС-В3 и ВС-F.
Подбор условий проводили при скорости потока 0,5 мл/мин и 1,0 мл/мин. При применении хроматогра-фической колонки с обращенной фазой AC 18 (250:4 мм 5 мкм) оптимальной является скорость потока 1,0 мл/мин при температуре термостатирования 300С. Аналитический сигнал регистрировали с помощью УФ детектора на длине волны возбуждения 245 нм (рис.1).
Рис.1. Разделение компонентов цинкбацитрацина с использованием ВЭЖХ.
Однако возникла проблема восстановления пика бацитрацина А при низких концентрациях. Двухвалентные катионы металлов, такие как Ре2+ и Си2+, как правило, присутствующие в системах ВЭЖХ могут взаимодействовать с бацитрацином, чем можно объяснить его потерю при низких концентрациях.
Для того чтобы проверить, что низкое восстановление бацитрацина происходит из-за хелятации с ионами металла, вводили 0,1М раствор соли дина-триевой этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в водной части подвижной фазы. ЭДТА обычно исполь-
зуется в качестве сильного металл-хелатирующего агента для двухвалентных катионов металла, присутствующих в системе ВЭЖХ [7].
Максимальную чувствительность цинкбацитраци-на измеряли от 0,5% до 100% от уровня концентрации раствора ЭДТА.
Это показало, что добавление ЭДТА к подвижной фазе улучшила перехват до приемлемого уровня.
На рисунке 2 представлена хроматограмма с 0,5% концентрацией испытуемого раствора без ЭДТА, как мобильного модификатора фазы.
Рис.2. Хроматограмма с 0,5% стандартным раствором цинкбацитрацина без ЭДТА.
Эти данные свидетельствуют о том, что потери в процессе восстановления были вызваны взаимодействием в системе ВЭЖХ.
На рисунке 3 показана хроматограмма с 0,5% концентрацией испытуемого раствора при условии добавления ЭДТА в подвижной фазе.
Рис.3. Хроматограмма с 0,5% стандартным раствором цинкбацитрацина с ЭДТА.
Пики бацитрацинов А, Вг В2, В3 были восстановлены. Модифицированная подвижная фаза была успешной в выявлении бацитрацина при всех концентрациях необходимых для исследования [8].
В молекуле цинкбацитрацина кроме гидрок-сильных и карбонильных групп также содержится аминогруппа, которую можно дериватизировать для
получения флуоресцентных соединений [9]. С целью повышения чувствительности 7п-БС произведена дериватизация первичных аминогрупп в боковой цепи аминокислот ВС с орто-фталевым диальдегидом (ОРА) в присутствии 2-меркаптоэтанола, что дало возможность усилить флуоресценцию изоиндольных продуктов (рис.4).
Рис.4. Разделение компонентов цинкбацитрацина с использованием флуоресцентного спектрометра
Hitachi 850.
Заключение. Таким образом, подобрана оптимальная мобильная фаза и проведена оптимизация режима хроматографирования для индикации цинкбацитрацина в стандартных образцах.
Низкое обнаружение пиков бацитрацина А, В,, В2, В3 вызвано способностью данного антибиотика образовывать комплексы с ионами металлов в системе ВЭЖХ. Добавление небольшого количества ЭДТА позволило предотвратить это явление.
Метод добавления ЭДТА в подвижную фазу увеличил чувствительность анализа при определении цинк-бацитрацина.
Разработан метод определения 7пБ в стандартных образцах с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и предколоночной дериватизацией орто-фталевым диальдегидом для обнаружения флуоресцентным детектором.
Литература
1. Барам, Г.И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе / Г.И.Барам, Д.В.Рейхарт, Е.Д Гольдберг // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Том 135, №1. - С. 75-79.
2. Инструкция по применению антибиотиков при выращивании и откорме с/х животных: утв. Министерством сельского хозяйства СССР 08.12.1980. - М.: Колос, 1982. - 7 с.
3. МУ 3049-84. Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства. - М.: «Стандартинформ», 1984. - 24 с.
4. Wai-mei Sin, D. Analytical methodologies for identifying a polypeptide antibiotic / D.Wai-mei Sin, YWong // Trends in Analytical Chemistry. - 2003. - Vol. 22 (11). - P. 799-809.
5. Hisao, Oka Improvement of chemical analysis of antibiotics. Journal of Chromatography / Oka Hisao, YMasuo // Chromatography. - 1989. - Vol. 462. - P. 315-322.
6. Pavli, V. Optimization of HLPC method for stability testing of bacitracin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis / V.Pavli, V.Kmetec // Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2001. - Vol. 24 (10). - P. 977-980.
7. Potts, Alan R. Validation of quantitative HLPC method for bacitracin and zinc bacitracin using EDTA as a mobilephase modifier. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis /Alan R.Potts, T.Psurek // Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2012. - Vol. 70. - P. 619-623.
8. Hormazabal, V. Rapid assay for the determination of zinc bacitracin in feed by liquid chromatography - mass spectrometry. Journal Liq. Chrom.& Rel. Technol / V.Hormazabal, M.Yndestad // Journal Liq. Chrom.& Rel. Technol. -2000. - Vol. 21 (7). - P. 1083-1088.
9. Capitan-Vallvey, L.F. High-performance liquid chromatography determination zinc bacitracin in animal feed by post-column derivatization and fluorescence detection / L.F. Capitan-Vallvey, A.Titos // Chromatography. - 2002. - Vol. 943. - P. 227-234.
COMPARATIVE ANALYSIS OF METHODS FOR IDENTIFICATION OF ZINCBACITRACIN ANIMAL ANTIBIOTIC
Galyautdinova G.G. - Candidate of Biological Sciences; Bosyakov V.I. - technical assistant;
Shangaraev N.G. - Head. Lab. Chem. Analysis; Egorov V.I. - Candidate of Biological Sciences.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
The aim of these studies was to search for optimal modes and conditions for chromatography by HPLC to identify the antibiotic zincbacitracin. rials and methods. In the experiments, a standard of zincbacitracin containing 90% active ingredient (European Pharmacoponia Reference Standard) was used. To conduct research and develop the definition of zincbacitracin, liquid chromatograph Agilent 1260 Infinitu with diode array detector, Spectra Physics Spectra 100 with UV detector, fluorescence spectrometer Hitachi 850 with a flow cell as a detector was used. The separation was carried out on ReproSil-Pur ODS150x4 mm 5 мm Repro Sil ODS - AC 18(5 мm) (250:4 mm), EquisilBDS-C18(250x4.6mm) in the gradient elution mode of the mobile phase. An HPLC system was established for the analytical and preparative separation of the components of the zincbacitracin antibiotic. Optimum analytical results were obtained using a Reprosil ODS - AC18 column with a mobile phase of acetonitrile-methanol (1:3 v / v) - an aqueous solution of KHfO4 (0.05M pH = 6.0) (60:40 v/v). The aforementioned chromatography regimes produced satisfactory results for both the UV and the fluorescent detector. Isolation of BC-A, BC-Bt, BC-B2 and BC-B3 and BC-F was achieved without decomposition of components in UV detection using Agilent 1260 Infinitu and Spectra Physics Spectra 100 chromatographs at a wavelength of254 nm. Using pre-columnar derivatization with ortho-phthalic dialdehyde in the presence of 2-mercaptoethanol, it was possible to identify the major component of BC-A on a Hitachi 850 chromatograph at concentrations of 5-10 Mg/ml. A 0.1 M solution of ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) in the aqueous part of the mobile phase was selected as a mobile phase modifier to enhance the sensitivity of bacitracin peaks at low concentrations. Based on the conducted studies using HPLC methods, using diode-matrix, Uv and fluorescent detectors, the composition of zincbacitracin was analyzed. The possibility of increasing the sensitivity of HPLC analysis when adding an equimolar amount of EDTA to the mobile mobile phase is shown. A method for identifying ZnB using reverse phase HPLC with pre-columnar derivatization with ortho-phthalic dialdehyde was developed to enhance fluorescence.
KEYWORDS: antibiotics, zincbacitracin, high-performance liquid chromatography (HPLC), mixed fodder.
References
1. Baram, G.I. Novye vozmozhnosti vysokoeffektivnoy zhidkostnoy khromatografii v farmakopeynom analize [Novel opportunities for using HPLC method in pharmacopoeia] / G.I.Baram , D.V.Reykhart , Ye.D.Gol'dberg // Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. - 2003. - Vol.135, №1. - P.75-79.
2. Instruktsiya po primeneniyu antibiotikov pri vyrashchivanii i otkorme s / kh zhivotnykh [A guideline on using antibiotics at livestock breeding and fattening]: approved by the USSR Ministry of Agriculture in 08.12.1980. - Moscow: Kolos, 1982. - 7 p.
3. MU 3049-84. Metodicheskiye ukazaniya po opredeleniyu ostatochnykh kolichestv antibiotikov v produktakh zhivotnovodstva [Methodological guideline on assessment of number of residual antibiotics in animal products]. -Moscow: «Standartinform», 1984. - 24 p.
4. Analytical methodologies for identifying a polypeptide antibiotic. Journal of Trends in Analytical Chemistry / Della Wai-mei Sin, Yiu-chung Wong // Trends in Analytical Chemistry - 2003/ - Vol.22 (11). - P. 799-809.
5. Improvement of chemical analysis of antibiotics. Journal of Chromatography. / Hisao Oka, Masuo Yamada // Chromatography - 1989. - Vol.462. - P. 315-322.
6. Optimization of HLPC method for stability testing of bacitracin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis / Viljem Pavli, Vojko Kmetec // Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2001. - Vol.24 (10). - P. 977-980.
7. Validation of quantitative HLPC method for bacitracin and zinc bacitracin using EDTA as a mobile-phase modifier. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis /Alan R. Potts, Tatiana Psurek // Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2012. - Vol.70. - P. 619-623.
8. Rapid assay for the determination of zinc bacitracin in feed by liquid chromatography - mass spectrometry. Journal Liq. Chrom.& Rel. Technol./ Victor Hormazabal, Magne Yndestad // Journal Liq. Chrom.& Rel. Technol. - 2000. -Vol.21 (7). - P. 1083-1088.
9.High-performance liquid chromatography determination zinc bacitracin in animal feed by post-column derivatization and fluorescence detection. / L.F.Capitan-Vallvey, A.Titos // Chromatography - 2002. - Vol.943. - P. 227-234.
