CC BY
10
DOI 10.31588/2413-4201-1883-242-2-36-40
УДК 619:615.33.637
ИНДИКАЦИЯ АНТИБИОТИКА ЦИНКБАЦИТРАЦИНА В КОРМАХ МЕТОДОМ
ВЭЖХ
Галяутдинова Г.Г. - к.б.н., Маланьев А.В. - к.б.н., Мухамметшина А.Г. - вед. инженер, Балымова М.В. - мл. науч. сотр., Егоров В.И. - к.б.н.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: антибиотик, индикация, бацитрацин, корма, ВЭЖХ метод Keywords: antibiotic, indication, bacitracin, feed, HPLC method
В настоящее время организация кормления сельскохозяйственных животных основана на массовом применении биологических соединений (ферменты, аминокислоты, пробиотики и др.). Сегодня агропромышленный комплекс России имеет ёмкий рынок этих продуктов. Однако не все сельскохозяйственные производители используют кормовые добавки.
Ежегодно в животноводстве в качестве кормов используют от 40 до 50 млн. т зерна. Его доля в отечественных комбикормах составляет 70-75 %. К сожалению, более половины общего количества зерна, предназначенного для их приготовления, вводят в рационы в не переработанном виде. При таком подходе конверсия корма существенно хуже мировых показателей, а себестоимость получаемой продукции -намного выше, что снижает конкурентоспособность российского животноводства.
Выпуск микробиологических
средств (а сегодня достаточно большой ассортимент кормовых добавок производят путем микробного синтеза) требует обеспеченности энергоресурсами и специальным оборудованием, в том числе установками для обработки продукта паром под высоким давлением, навыками работы в асептических условиях, наличия квалифицированных специалистов. Поэтому появление на рынке России, к примеру, антибиотиков, якобы произведенных отечественной компанией, не имеющей условий для производства, вызывает некоторое сомнение в происхождении и качестве таких препаратов. В нашей стране кормовые антибиотики относят к лекарственным сред-
ствам, но это отнюдь не означает, что их не применяют как добавки и стимуляторы. Использование этих препаратов в кормлении молодняка и взрослого поголовья способствует снижению падежа, нормализации обменных процессов, повышению резистентности организма, что обеспечивает повышение продуктивности и уменьшение производственных затрат [2, 5]. Одним из разрешенных кормовых антибиотиков к использованию на территории Российской Федерации является бацилихин [6].
Действующее вещество бацилихина - полипептидный антибиотик немедицинского назначения бацитрацин, природный антибиотик, продуцентом которого является Bacillus licheniformis. Одним из преимуществ бацитрацина является то, что он не всасывается в кровь, действует в просвете желудочно-кишечного тракта и практически не накапливается в органах и тканях животных. В животноводстве разрешено использовать кормовые формы бацитрацина: бацилихин-10, бацилихин-20, бацилихин-30 и др.
В последнее время в связи с нечистоплотностью некоторых коммерческих структур и низкого уровня контроля над производителями покупатели сталкиваются с отсутствием положительного результата от применения такой продукции. И как избежать риска приобретения неэффективных кормовых добавок, единственное «преимущество» которых заключается в низкой цене?
Установлено, что при добавлении антибиотиков в корм происходит значительное сокращение отхода молодняка в
результате различных заболеваний, ускорение процесса роста и развития животных и птиц и заметное (5-10 %) сокращение потребления кормов.
Комбикорма, обогащенные антибиотиками, усваиваются организмом животных намного лучше. Примерно, 15-20 % антибиотиков всасывается в желудке, 70-80 % в тонком отделе кишечника и 5-10 % в толстом отделе кишечника.
К сожалению, существующие проекты надзора не содержат требования к мониторингу использования антибиотиков.
На сегодняшний день в Российской Федерации наиболее распространенными методами определения антибиотика бацитрацина в продуктах питания являются микробиологический и иммунофер-ментный. Микробиологический метод основан на чувствительности бактерий к этому антибиотику, способности диффузии его в агаровую среду со спорами тест-микроба, препятствованию их росту с образованием прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотика в объектах устанавливают по диаметру зон ингибиции.
Тест-система «RГОAS-
CREEN®Bacitracin» основана на методе иммуноферментного анализа. Она выполнена в формате микротитровального планшета и позволяет быстро и эффективно определять содержание бацитрацина в пробах пищевых продуктов.
Однако эти методы имеют ряд недостатков:
- низкая специфичность. В настоящее время в объектах ветнадзора используются большое количество добавок (консерванты, красители, усилители вкуса и т.д.), которые могут давать ложноположи-тельный эффект;
- длительный период проведения анализа. Требуется время для выращивания спор тест-культур (1-7 суток) и для проведения самого анализа (18 часов), т.е. одно исследование занимает от 2 до 8 суток. Кроме того, для исследования необходимо постоянно поддерживать чистоту тест-культур. Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика бацитрацина является метод высокоэффек-
тивной жидкостной хроматографии с масс-детектированием. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.
В настоящее время назрела необходимость разработки высокочувствительных методов определения количественного содержания антибиотиков в кормах.
На базе ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработан воспроизводимый, прецизионный ВЭЖХ метод определения антибиотика цинкбацитрацина в кормах [1, 3, 4, 7].
Целью данных исследований стал поиск оптимальных условий пробоподго-товки и режимов хроматографирования методом ВЭЖХ на диодно-матричном (ДМД) детекторе для идентификации и индикации антибиотика цинкбацитрацина в корме.
Материал и методы исследований. Искусственная затравка корма проводилась стандартным раствором цинкба-цитрацина, с содержанием действующего вещества не менее 90 % (European Pharmacopeia Reference Standard). Образцы корма, свободные от антибиотика, были использованы в качестве контрольного материала.
Пробоподготовка. Из средней пробы или комбикормового сырья методом квартования выделяли около 100 г материала, размалывали без предварительного подсушивания и просеивали через сито. Остаток на сите измельчали и добавляли к пробе, затем перемешивали.
Из полученного материала отбирали навеску 5 г корма, экстрагировали механическим встряхиванием в течение 20 мин с 20 мл 1,5 мМ водного раствора три-лона Б и 20 мл 1 % ТХК. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирали жидкий слой и к нему добавляли 150 мл деионизированной воды. Нераство-ренную матрицу корма обрабатывали 30 мл метанола и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Полученный
верхний слой объединяли с первой фракцией и доводили объем до 200 мл деиони-зированной водой. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Отбирали из полученного экстракта 10 мл в пробирку.
Очистку путем твердофазной экстракции осуществляли на картридже Oasis HLB 3 см3 х 60 мг. Предварительно картридж конденсировали 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН-4,0). Полученный экстракт пропускали через картридж со скоростью 1 мл/мин. Картридж сушили на вакууме под давлением 20 мм.рт.ст. и промывали 5 мл бидистиллированной воды. Элюировали по 2,5 мл метанола 2 раза.
Элюат выпаривали под слабым током азота при 35 0С до 1 мл и добавляли 2 мл раствора (0,05 М калия фосфорнокислого 1-замещенного (КН2РО4), ацетонит-рила и метанола в соотношении 40/15/45). Конечный объем использовали для ВЭЖХ анализа.
Для проведения исследований и разработки определения цинкбацитрацина применялся жидкостной хроматограф «Agilent 1100 Infiniti» с диодно-матричным (ДМ) детектором.
Разделение проводили на колонке «ReproSil ODS-AC» 18 (5 мкм) (250:4 мм).
Концентрирование и очистку экстрактов проводили методом ТФЭ на картриджах «Oasis HLB» 3 см3 х 60 мг.
Результаты исследований. Оптимальные аналитические результаты получены при использовании колонки «Reprosil ODS - AC 18» с подвижной фазой ацето-нитрил-метанол (1:3 v/v) - водным раствором КН2РО4 (0,05 М рН=6,0) (60:40 v/v), скорости потока 1,0 мл/мин и температуры термостатирования 25 0С. Аналитический сигнал регистрировали на длине волны возбуждения 254 нм.
На рисунках 1 и 2 представлены хроматограммы стандартного раствора цинкбацитрацина с концентрацией 0,1 мг/кг и опытной пробы, полученные методом ВЭЖХ с ДМ - детектором.
Рисунок 1 -Хроматограмма стандартного раствора цинкбацитрацина, полученная в оптимальных условиях на хроматографе «Agilent 1100 Infinity»
условиях на хроматографе «Agilent 1100 Infinity»
Заключение. Разработан метод ВЭЖХ определения качественного и количественного содержания антибиотика бацитрацина в кормах. По диапазону определяемых содержаний данная методика позволяет идентифицировать антибиотик в кормах на уровне предельно допустимых дифференцированных норм, вводимых при изготовлении полнорационных комбикормов, премиксов, белково-витаминных добавок.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Босяков, В.И. Разработка методики по определению антибиотика цинкба-цитрацина в кормах методом ВЭЖХ / В.И. Босяков, Г.Г. Галяутдинова, Н.Г. Шангара-ев, [и др.] // Материалы II междисциплинарного научно-практического форума «Уральская ветеринария и медицина» 7-8 декабря 2017 г. - Челябинск. - 2017. - С. 31-33.
2. Буряков, Н.П. Антибиотики кормовые / Н.П. Буряков, М.Н. Бурякова // Комбикормовая промышленность. - 1995. - № 95. - С 36.
3. Галяутдинова, Г.Г. Оценка возможностей хроматографических методов
анализа при установлении загрязненности кормов антибиотиком цинкбацитрацином / Г.Г. Галяутдинова, В.И. Босяков, Н.Г. Шангараев [и др.] // Материалы II междисциплинарного научно-практического форума «Уральская ветеринария и медицина» 7-8 декабря 2017 г. - Челябинск. - 2017. -С. 33-34.
4. Галяутдинова, Г.Г. Сравнительный анализ методов идентификации кормового антибиотика цинкбацитрацина / Г.Г. Галяутдинова, В.И. Босяков, Н.Г. Шангараев, В.И. Егоров // Ветеринарный врач. - 2017. - № 5. - С. 15-18.
5. Коробкова, Т.П. Современное состояние и перспективы применения антибиотиков в сельском хозяйстве / Т.П. Коробкова, Л.П. Иваницкая, Т.Н. Дробышева // Антибиотики и медицинская биотехнология. - 1987. - № 8. - С. 563-571.
6. Мозгов, И.В. Антибиотики в ветеринарии / И.В. Мозгов. - М., 1971.
7. Хайруллин, Д.Д. Идентификация кормового антибиотика цинкбацитрацина методом ВЭЖХ / Д.Д. Хайруллин, Г.Г. Га-ляутдинова, В.И. Босяков [и др.] // Ученые записки. - 2017. - Т.232 (IV). - С. 147-150.
ИНДИКАЦИЯ АНТИБИОТИКА ЦИНКБАЦИТРАЦИНА В КОРМАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ
Галяутдинова Г.Г., Маланьев А.В., Мухамметшина А.Г., Балымова М.В., Егоров В.И.
Резюме
Проблема сохранности сельскохозяйственных животных и птицы обусловливает возрастающий год от года спрос на кормовые антибиотики. Однако существующие проекты надзора не содержат требования к мониторингу использования антибиотиков. Поэтому применение антибиотических средств несет колоссальный риск. В настоящее время назрела необходимость разработки высокочувствительных способов индикации кормовых антибиотиков в объектах ветнадзора.
В Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности разработан метод ВЭЖХ определения качественного и количественного содержания антибиотика бацитрацина в кормах.
По диапазону определяемых содержаний данная методика позволят идентифицировать антибиотик в кормах на уровне предельно допустимых концентраций.
INDICATION OF ANTIBIOTICS OF ZINCBACYTRACINE IN FEED BY HPLC METHOD
Galyautdinova G.G., Malanev A.V., Balymova M.V., Mukhammetshina A.G., Egorov V.I.
Summary
The problem of preservation of farm animals and poultry causes an increasing demand for feed antibiotics from year to year. However, existing surveillance projects do not contain requirements for monitoring the use of antibiotics. Therefore, the use of antibiotics carries a tremendous risk. Currently, there is a need to develop highly sensitive methods for indicating feed antibiotics in veterinary surveillance facilities.
The Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety has developed a HPLC method for determining the qualitative and quantitative content of bacitracin antibiotic in feed.
According to the range of determined contents, this technique will allow identifying the antibiotic in the feed at the level of maximum permissible concentrations.
DOI 10.31588/2413 -4201-1883-242-2-40-43
УДК 619.616.391-07/0-8:636.22/.(470.55/.58)
СОСТОЯНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ крови коров при гипо-
КОБАЛЬТОЗЕ, СПОСОБ КОРРЕКЦИИ
Гертман А.М.1 - д.в.н., профессор, Самсонова Т.С.1 - к.б.н., доцент, Крупцова Н.Н.1 - преподаватель, Гасанов А.С.2 - д.б.н., профессор
1ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный аграрный университет» 2ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: эритроциты, лейкоциты, лейкограмма, эритроцитарные индексы, гипокобальтоз
Keywords: erythrocytes, leukocytes, leukogram, erythrocyte indices, hypocobaltosis
Животные в силу особенностей строения желудочно-кишечного тракта очень чувствительны к дефициту отдельных биоэлементов. Ведущая роль принадлежит кобальту, который принимает активное участие в процессах гемопоэза, синтеза цианкобаламина рубцовой и кишечной микрофлорой, а также в регуляции белкового обмена [5, 6, 9]. Кроме того, ионы кобальта в организме теплокровных выступают активаторами многочисленных ферментов (аргиназа, каталаза, альдолаза, декарбоксилаза и другие), блокируя цито-хромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы, оксидоредуктазы и уреазы [9, 10]. Поэтому при дефиците этого эссенциального микроэлемента у животных развивается заболевание - гипокобальтоз, которое является эндемической патологией, зарегистрированной на территории Российской Федера-
ции, стран СНГ, Австралии, США, Новой Зеландии, Шотландии, Японии и других государств [7]. У животных, больных ги-покобальтозом, изменяется гидролиз питательных веществ в рубце, нарушаются микробиоценоз и активность протеолити-ческих ферментов [2]. Все эти процессы приводят к дисбалансу веществ в организме, существенному нарушению кроветворения и иммуногенеза. В связи с выше указанным цель работы изучить состояние морфологических показателей крови у больных гипокобальтозом животных.
Материал и методы исследований. Эксперимент проведен в одном из животноводческих хозяйств Челябинской области поэтапно. Материалом исследования являлись полновозрастные коровы голштинофризской селекции в период раздоя (0-100 дней лактации). Сначала для
