Научная статья на тему 'Контроль содержания антибиотиков в пищевых продуктах хроматографическими методами. Часть 1'

Контроль содержания антибиотиков в пищевых продуктах хроматографическими методами. Часть 1 Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
447
58
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Область наук
Ключевые слова
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ / АНТИБИОТИКИ / ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ / КОНТРОЛЬ СОДЕРЖАНИЯ

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Кирничная В.К., Касьяненко Г.Р., Киселева Т.В.

Разработаны методы извлечения, идентификации и определения левомицетина и антибиотиков тетрациклинового ряда, пригодные для серийных анализов. Созданы методы для арбитражных анализов остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах. Проведено исследование содержания антибиотиков в различных видах отечественных и импортируемых пищевых продуктов разработанными нами методами анализа.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Кирничная В.К., Касьяненко Г.Р., Киселева Т.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Control of Contents of Antibiotics in Food by Chromatographic Methods. Part I

The methods of extraction, identification and determination of chloramphenicol and tetracyclines, suitable for serial analysis have been developed. Methods have been developed for the analysis of arbitration antibiotic residues in food. Investigation of the content of various types antibiotics in domestic and imported food products have been carried out by our developed methods.

Текст научной работы на тему «Контроль содержания антибиотиков в пищевых продуктах хроматографическими методами. Часть 1»

УДК 543.544; 637.07

Контроль содержания антибиотиков

в пищевых продуктах хроматографическими методами

Часть 1

В.К. Кирничная, канд. хим. наук, , канд. хим. наук, доцент

Московский государственный университет технологий и управления им. К.Г. Разумовского

, канд. биол. наук НИИ питания РАМН

Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохраняемости кормов и т. п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется [1, 2]. Особое внимание уделяется загрязнению пищевых продуктов лекарствами, применяемыми в медицине, так как при этом возможно

Остаточные количества АБ могут помешать проведению ветеринарно-санитарной экспертизы, выполнению ряда технологических операций, ухудшать качество готовых продуктов.

снижение эффективности лечения ими людей [3].

К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относят антибиотики (АБ). Известно большое число АБ, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия на бактерии, распределением в организме животного, характером метаболизма и др. Проблема загрязнения пищи АБ возникла вследствие достаточно широкого их применения в ветеринарии и животноводстве, а также при хранении и технологической переработке ряда продуктов.

Случайное введение в организм человека без соответствующих ме-

Ключевые слова: пищевые продукты; антибиотики; хроматографичес-кие методы определения; контроль содержания.

Key words: food products; antibiotics; chromatographic methods of determination; control of contents.

дицинских показаний и контроля лекарственных препаратов крайне нежелательно. Хотя нет никаких оснований предполагать возможность острого токсического действия на людей пищевых продуктов, содержащих, в частности, АБ, существует определенная опасность хронического попадания относительно небольших количеств этих соединений с пищей в организм человека, что может приводить к различного рода аллергическим реакциям, нарушениям обмена веществ, дисбактерио-зам и т.д., кроме того, возникает опасность распространения устойчивых форм микроорганизмов [3, 4].

Кроме нежелательного воздействия на человека остаточные количества АБ могут мешать проведению ветеринарно-санитарной экспертизы, выполнению ряда технологических операций, ухудшать качество готовых продуктов.

В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйцах, рыбе, меде и других продуктах достаточно часто обнаруживают остаточные количества АБ, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля.

Для контроля содержания АБ в различных видах пищевых продуктов чаще всего используют микробиологические методы [5], в том числе метод иммуноферментного анализа (ИФА) [6-10]. Микробиологические методы обладают относительно высокой чувствительностью, но мало-

специфичны, дают плохо воспроизводимые результаты, зависят от ряда условий выполнения, требуют значительных затрат времени и плохо поддаются стандартизации. Разработан ряд физико-химических методов анализа АБ в пищевых продуктах, при этом лучшими характеристиками обладают способы, включающие хроматографическое разделение [7, 11-14]. Однако официальный контроль до сих пор осуществляется, как правило, микробиологическими способами. Это связано с отсутствием простых и надежных химических методов анализа АБ в пищевых продуктах. Работы, требующие дорогостоящего оборудования, не пригодны для серийных определений на уровне сельскохозяйственных, пи-щеперерабатывающих предприятий и санэпидстанций. Отсутствие надежных методов анализа АБ, пригодных для массовых обследований, не позволяет изучить содержание этих посторонних веществ в пищевых продуктах, сопоставить данные, полученные в различных лабораториях, и должным образом оценить проблему.

В связи с этим разработка новых надежных химических методов анализа остаточных количеств АБ в пищевых продуктах важна и актуальна.

Рассматривая современное состояние проблемы, представлялось целесообразным модифицировать некоторые имеющиеся и разработать новые методы анализа остаточных количеств АБ, наиболее часто встречающихся в пищевых продуктах.

Левомицетин (хлорамфеникол, хлормицетин) - АБ широкого спектра действия, обладающий высокой активностью в отношении грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий и риккетсий. Эффективен в лечении брюшного тифа, холеры, бруцеллеза и др. [1, 2]. Левоми-цетин относится к токсичным веществам; он медленно выводится из организма и очень устойчив в продуктах питания. У больных, применяющих левомицетин в качестве терапевтического средства, отмечаются осложнения, связанные с поражением кроветворных органов: эритро-пения, лейкопения, тромбоцитопе-ния. Левомицетин обладает гемоток-сическими свойствами и может вызвать аплазию костного мозга и, вследствии этого, апластическую анемию, сопровождающуюся быстрым снижением уровня гемоглобина и эритроцитов в крови. Весьма часты аллергические реакции, выражающиеся в покраснении кожных покровов, лихорадке и др. Наибольшее токсические влияние оказывает про-

QUALITY AND SAFETY

должительность поступления в организм левомицетина [3].

Несколько лет назад левомицетин был запрещен к использованию, но в настоящее время запрет снят. Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие левомицетина в пищевых продуктах не допускается. Содержание левомицетина нормируется во всех пищевых продуктах, но методики его количественного определения разработаны нами только для мяса, молока и куриных яиц, т. е. для продуктов с массовой долей жира не более 20 % [7]. Современные методики определения левомицетина в пищевых продуктах методом ИФА также не решают проблему выделения этого антибиотика из продуктов с различной массовой долей жира [9, 10].

АБ тетрациклинового ряда (окси-, хлор- и др.) занимают особое положение среди антибиотиков. Многообразие производных, отличающихся спектром антимикробного действия, позволяет в большинстве случаев подобрать наиболее эффективный из тетрациклинов для лечения различного рода заболеваний: холеры, пневмонии, бруцеллеза, брюшного тифа и других желудочно-кишечных заболеваний [1, 2]. Хлортет-рациклин (биомицин), окситетра-циклин (террамицин) и тетрациклин особенно часто используют в птицеводстве для профилактики падежа. Тетрациклины медленно выводятся из организма животных, что существенно увеличивает возможность загрязнения пищевых продуктов их остатками. Остаточные количества АБ тетрациклинового ряда обладают токсическими действиями: угнетают микрофлору кишечника, могут спровоцировать дисбактериоз, вторичные грибковые инфекции, проявления аллергического характера, вызвать тошноту, рвоту, расстройства функции кишечника, изменения слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, снижают сопротивляемость организма и повышают устойчивость патогенных микроорганизмов.

Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие АБ тетрациклинового ряда в пищевых продуктах не допускается. Для определения остаточных количеств тетрациклинов в продуктах животноводства применяют метод ИФА [6, 8] и арбитражный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором [12]. Однако микробиологические методы определения тетрацик-линов малоспецифичны, дают плохо воспроизводимые результаты и тре-

буют значительного времени, а метод ВЭЖХ с масс-спектрометричес-ким детектором не всегда доступен, так как предусматривает использование дорогостоящего оборудования.

Цель работы - разработка комплексов хроматографических методов определения левомицетина и тетрациклинов, позволяющих проводить разделение, обнаружение, идентификацию и предварительную оценку содержания этих антибиотиков в пищевых продуктах скрининг-методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и определение с помощью ВЭЖХ; а также, применяя разработанные нами методы анализа антибиотиков, провести определение их уровней в различных видах отечественных и импортируемых пищевых продуктов.

Использовали левомицетин 100 %-ной активности WHO Centre for Chemical Referense Substances (Швеция); тетрациклин, хлортетра-циклин и окситетрациклин 95,6, 95 и 96 %-ной активности соответственно, полученные из Государственного научного центра экспертизы и контроля качества лекарственных средств Минздрава РФ. Применяли реактивы марки «ЧДА» или «ХЧ», растворители классификации «для спектроскопии» и «для жидкостной хроматографии». ТСХ проводили на пластинках: с силикагелем фирмы Merk (США), Whatman серии Diamond (Великобритания),

Whatman УФ254 серии Diamond (Великобритания), сорбфиле (Россия), сорбфиле УФ254 (Россия), NANO-SIL RP С18-100 УФ254 фирмы MACHEREY-NAGEL (Германия), Сорбтон RP-2 (Россия). Визуализацию пятен флуоресцирующих соединений, а также веществ, поглощающих УФ-свет на хроматографических пластинках с люминесцентным индикатором, проводили, используя лампу серии Е фирмы Grace (США). Для расслоения эмульсий применяли настольную центрифугу ОП-8.

Спектры поглощения растворов и их оптическую плотность регистрировали на спектрофотометрах Hitachi-557 (Япония), Юнико-1201 (Россия) и СФ-26 (Россия) в кюветах с l = 10 мм. Для определения максимов спектров возбуждения и флуоресценции и измерения ее интенсивности использовали спектрофлуори-метр PERKIN ELMER MPF 43 A (Япония) с кюветами l = 10 и 4 мм.

Анализ проводили с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа LaChrom 2000 фирмы Hitachi (Япония) на колонках ультрасфер ODS, 5 мкм (250 х 4,6 мм) с УФ-детектором.

Левомицетин

Сливки, кефир, ряженка, йогурты: 25±0,1 мл насыщают 10 г Na2SO4, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, интенсивно встряхивают 12 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10

Содержание левомицетина нормируется во всех пищевых продуктах, но методики его количественного определения разработаны только для мяса, молока и куриных яиц.

мин при 4000 мин-1. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование. Эти-лацетатный слой объединяют.

Сметана: 10±0,1 г смешивают с 30 мл воды, насыщают 10 г Na2SO4, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 мин-1. Эти-лацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости проводя центрифугирование для расслоения.

Творог, сыр: 10±0,1 г гомогенизируют с 40 мл воды, перетирают с 10 г №^04, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, интенсивно встряхивают 1-2 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10 мин при 4000 мин-1. Этилацетат декантируют, а су-пернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости проводя центрифугирование для расслоения суспензии.

Очистку экстракта проводят по методике [7, 15]: объединенные этила-цетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%-ного раствора Na2CO3, насыщенного NaCl и 10 мл насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре < 50 0С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 мл смеси ацетонитрил - вода 1:4 и экстрагируют 3 х 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацета-том (3 х 5 мл). Этилацетатный экстракт сушат над №^04 (1 г), декантируют, Na2SO4 промывают 3 мл этила-

цетата, присоединяют его к экстракту и упаривают на ротационном испарителе объединенный экстракт при температуре < 50 0C досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Непосредственное определение

Аликвотный объем экстракта из пищевого продукта и известное количество стандарта левомицетина вводят в жидкостной хроматограф, используя колонку Ультрасфер ODS 5 мкм (250 х4,6 мм) и систему растворителей ацетонитрил — вода + дециламин 40:60 + 5х10-3 об.ч. при X = 278 нм при скорости потока 1 мл/мин. Время удерживания левомицетина — 6,1 мин. Подтверждение определения проводят по предложенной нами ранее методике [7]: в случае обнаружения левомицетина в пробе аликвотную часть экстракта из пищевого продукта отдувают азотом досуха, приливают 150 мкл 10 %-ной

АБ тетрациклинового ряда (окси-, хлор- и др.) занимают особое положение среди антибиотиков. Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие АБ тетрациклинового ряда в пищевых продуктах не допускается.

HCI и нагревают при температуре 98 0C в течение 1 ч. Затем добавляют 120 мкл 10 %-ного раствора КОН в метаноле до рН 9-10, отдувают азотом досуха и приливают 0,2 мл хлористого ацетила. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего избыток хлористого ацетила отдувают азотом, остаток растворяют в 200 мкл метанола и аликвотную часть вводят в жидкостной хроматограф в условиях проведения определения левомицетина. Исчезновение пика левомицетина и появление нового — с временем удерживания 6,5 мин свидетельствует о наличии левомицетина в анализируемом образце.

Определение по производным

Определение с n-диметиламино-бензальдегидом. На пластину для ТСХ Whatman наносят аликвотный объем экстракта из пищевого продукта, различные количества стандарта левомицетина и хроматогра-фируют в системе растворителей хлороформ — метанол 10:2. После просушивания пластинку опрыскивают раствором SnCI2 в HCI, приготовленным следующим образом: к 3 мл 15 %-ного раствора SnCI2 (в воде)

приливают 15 мл HCI и 180 мл

1 конц.

Н2О, оставляют на 10 мин и вновь опрыскивают раствором n-диметила-минобензальдегида в метаноле (2 мг/мл). Сравнивая интенсивности окраски пятен на хроматограммах стандарта и экстракта из анализируемого объекта, оценивают содержание левомицетина в пробе. На хро-матографическую пластинку наносят в ряд близко расположенных точек аликвотную часть экстракта из анализируемого пищевого продукта и различные объемы раствора стандарта левомицетина. Пластинку хро-матографируют в вышеуказанной системе, сушат и обрабатывают, как описано выше. Проявленные желтые зоны хроматограмм опыта и стандартов, а также соответствующую по Rf и площади зону пластинки, служащую контролем, элюируют смесью метанол - HQ 99:1 и полученные

конц.

растворы упаривают досуха. К сухому остатку приливают по 200 мкл 5 %-ного раствора SnCI2 в 5 % HQ и нагревают при температуре 98 0C в течение 40 мин. После охлаждения добавляют ко всем пробиркам по 2 мл 1 %-ного раствора n-диметила-минобензальдегида в метаноле и спектрофотометрируют в кюветах с I = 1 см при X = 437 нм. Определение содержания левомицетина в анализируемой пробе проводят, сравнивая оптические плотности полученных растворов.

Определение с флуорескамином. На пластину для ТСХ Whatman наносят аликвотную часть экстракта из пищевого продукта, различные количества стандарта левомицетина и хроматографируют в системе растворителей хлороформ — метанол 10:2. Пластинку сушат, затем хрома-тограмму одного из стандартов ле-вомицетина обрезают, опрыскивают раствором SnCI2 в HQ, приготовленным следующим образом: к 3 мл 15 %-ного раствора SnCI2 (в воде) приливают 15 мл НС! и 180 мл

конц.

Н2О. Пластинку оставляют на 10 мин, вновь опрыскивают раствором флуо-рескамина в ацетоне (0,1 мг/мл) и помещают в камеру с аммиаком на 3-5 мин. На хроматограммах опыта и остальных стандартов отмечают карандашом зоны, по Rf соответствующие проявленному пятну левоми-цетина, кроме того, обводят зону пластинки, служащую контролем. Зоны левомицетина и контроля элю-ируют метанолом, упаривают досуха, приливают по 200 мкл 5 %-ного раствора SnCI2 в 5 %-ной HQ и нагревают при температуре 98 0C в течение 40 мин. Избыток кислоты нейтрализуют 10%-ным раствором Na2CO3 до рН 7-8, приливают по 250

мкл раствора флуорескамина в ацетоне (0,3 мг/мл) и измеряют интенсивность флуоресценции растворов опытной пробы и стандартов относительно контроля. Содержание левомицетина в анализируемой пробе расчитывают путем сравнения интенсивности флуоресценции полученных растворов.

Тетрациклины

10±0,1 г гомогената твердого продукта или 25±0,1 мл молока перемешивают с 10 мл 0,01 н HCl и 10 г (NH4)2SO4 до полного растворения соли. Гомогенат центрифугируют, декантируют, отбирают аликвотный объем (10-15 мл) супернатанта и обезжиривают последний экстракцией изооктаном 3 х 10 мл, при необходимости применяя для расслоения эмульсии центрифугирование. Водную фазу экстрагируют 3 х 20 мл бутанола. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе, сухой остаток растворяют в 200 мкл метанола и используют для анализа.

На пластинку Сорбтон RP-2 наносят аликвотный объем экстракта из пищевого продукта, различные количества стандартов тетрациклина, окситетрациклина и хлортетра-циклина и хроматографируют в 10 %-ной щавелевой кислоте, насыщенной бутанолом. После прохождения фронтом элюента всей пластинки ее помещают в камеру с аммиаком, выдерживают 3 мин, сушат и рассматривают в УФ-свете с X = 366 нм. Пятна тетрациклинов в пробе идентифицируют по желтой флуоресценции и Rf, соответствующих стандартам, оценивают их количества, сравнивая со стандартами и обводят карандашом. Для подтверждения правильности идентификации пластинку опрыскивают 0,5 %-ным водным раствором прочной синей В соли и нагревают 3 мин в сушильном шкафу при температуре 105 0C. Ярко-розовое (в случае окситетрациклина — оранжевое) окрашивание обведенных карандашом пятен свидетельствует о наличии тетрациклинов в продукте.

Для определения тетрациклинов аликвотный объем экстракта и известные количества стандартов тетрациклина, окситетрациклина и хлор-тетрациклина вводят в жидкостной хроматограф, используя колонку Ультрасфер ODS 5 мкм (250х4,6 мм) и элюент 0,01 М щавелевая кислота - ацетонитрил — ди-метилформамид 60:34:6 + 10 мкл дециламина при скорости потока 1 мл/мин и X = 355 нм.

Продолжение следует

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.