CC BY
69
УДК 543.544; 637.07
Контроль содержания антибиотиков
в пищевых продуктах хроматографическими методами
Часть 1
В.К. Кирничная, канд. хим. наук, , канд. хим. наук, доцент
Московский государственный университет технологий и управления им. К.Г. Разумовского
, канд. биол. наук НИИ питания РАМН
Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохраняемости кормов и т. п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется [1, 2]. Особое внимание уделяется загрязнению пищевых продуктов лекарствами, применяемыми в медицине, так как при этом возможно
Остаточные количества АБ могут помешать проведению ветеринарно-санитарной экспертизы, выполнению ряда технологических операций, ухудшать качество готовых продуктов.
снижение эффективности лечения ими людей [3].
К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относят антибиотики (АБ). Известно большое число АБ, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия на бактерии, распределением в организме животного, характером метаболизма и др. Проблема загрязнения пищи АБ возникла вследствие достаточно широкого их применения в ветеринарии и животноводстве, а также при хранении и технологической переработке ряда продуктов.
Случайное введение в организм человека без соответствующих ме-
Ключевые слова: пищевые продукты; антибиотики; хроматографичес-кие методы определения; контроль содержания.
Key words: food products; antibiotics; chromatographic methods of determination; control of contents.
дицинских показаний и контроля лекарственных препаратов крайне нежелательно. Хотя нет никаких оснований предполагать возможность острого токсического действия на людей пищевых продуктов, содержащих, в частности, АБ, существует определенная опасность хронического попадания относительно небольших количеств этих соединений с пищей в организм человека, что может приводить к различного рода аллергическим реакциям, нарушениям обмена веществ, дисбактерио-зам и т.д., кроме того, возникает опасность распространения устойчивых форм микроорганизмов [3, 4].
Кроме нежелательного воздействия на человека остаточные количества АБ могут мешать проведению ветеринарно-санитарной экспертизы, выполнению ряда технологических операций, ухудшать качество готовых продуктов.
В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйцах, рыбе, меде и других продуктах достаточно часто обнаруживают остаточные количества АБ, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля.
Для контроля содержания АБ в различных видах пищевых продуктов чаще всего используют микробиологические методы [5], в том числе метод иммуноферментного анализа (ИФА) [6-10]. Микробиологические методы обладают относительно высокой чувствительностью, но мало-
специфичны, дают плохо воспроизводимые результаты, зависят от ряда условий выполнения, требуют значительных затрат времени и плохо поддаются стандартизации. Разработан ряд физико-химических методов анализа АБ в пищевых продуктах, при этом лучшими характеристиками обладают способы, включающие хроматографическое разделение [7, 11-14]. Однако официальный контроль до сих пор осуществляется, как правило, микробиологическими способами. Это связано с отсутствием простых и надежных химических методов анализа АБ в пищевых продуктах. Работы, требующие дорогостоящего оборудования, не пригодны для серийных определений на уровне сельскохозяйственных, пи-щеперерабатывающих предприятий и санэпидстанций. Отсутствие надежных методов анализа АБ, пригодных для массовых обследований, не позволяет изучить содержание этих посторонних веществ в пищевых продуктах, сопоставить данные, полученные в различных лабораториях, и должным образом оценить проблему.
В связи с этим разработка новых надежных химических методов анализа остаточных количеств АБ в пищевых продуктах важна и актуальна.
Рассматривая современное состояние проблемы, представлялось целесообразным модифицировать некоторые имеющиеся и разработать новые методы анализа остаточных количеств АБ, наиболее часто встречающихся в пищевых продуктах.
Левомицетин (хлорамфеникол, хлормицетин) - АБ широкого спектра действия, обладающий высокой активностью в отношении грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий и риккетсий. Эффективен в лечении брюшного тифа, холеры, бруцеллеза и др. [1, 2]. Левоми-цетин относится к токсичным веществам; он медленно выводится из организма и очень устойчив в продуктах питания. У больных, применяющих левомицетин в качестве терапевтического средства, отмечаются осложнения, связанные с поражением кроветворных органов: эритро-пения, лейкопения, тромбоцитопе-ния. Левомицетин обладает гемоток-сическими свойствами и может вызвать аплазию костного мозга и, вследствии этого, апластическую анемию, сопровождающуюся быстрым снижением уровня гемоглобина и эритроцитов в крови. Весьма часты аллергические реакции, выражающиеся в покраснении кожных покровов, лихорадке и др. Наибольшее токсические влияние оказывает про-
QUALITY AND SAFETY
должительность поступления в организм левомицетина [3].
Несколько лет назад левомицетин был запрещен к использованию, но в настоящее время запрет снят. Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие левомицетина в пищевых продуктах не допускается. Содержание левомицетина нормируется во всех пищевых продуктах, но методики его количественного определения разработаны нами только для мяса, молока и куриных яиц, т. е. для продуктов с массовой долей жира не более 20 % [7]. Современные методики определения левомицетина в пищевых продуктах методом ИФА также не решают проблему выделения этого антибиотика из продуктов с различной массовой долей жира [9, 10].
АБ тетрациклинового ряда (окси-, хлор- и др.) занимают особое положение среди антибиотиков. Многообразие производных, отличающихся спектром антимикробного действия, позволяет в большинстве случаев подобрать наиболее эффективный из тетрациклинов для лечения различного рода заболеваний: холеры, пневмонии, бруцеллеза, брюшного тифа и других желудочно-кишечных заболеваний [1, 2]. Хлортет-рациклин (биомицин), окситетра-циклин (террамицин) и тетрациклин особенно часто используют в птицеводстве для профилактики падежа. Тетрациклины медленно выводятся из организма животных, что существенно увеличивает возможность загрязнения пищевых продуктов их остатками. Остаточные количества АБ тетрациклинового ряда обладают токсическими действиями: угнетают микрофлору кишечника, могут спровоцировать дисбактериоз, вторичные грибковые инфекции, проявления аллергического характера, вызвать тошноту, рвоту, расстройства функции кишечника, изменения слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, снижают сопротивляемость организма и повышают устойчивость патогенных микроорганизмов.
Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие АБ тетрациклинового ряда в пищевых продуктах не допускается. Для определения остаточных количеств тетрациклинов в продуктах животноводства применяют метод ИФА [6, 8] и арбитражный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором [12]. Однако микробиологические методы определения тетрацик-линов малоспецифичны, дают плохо воспроизводимые результаты и тре-
буют значительного времени, а метод ВЭЖХ с масс-спектрометричес-ким детектором не всегда доступен, так как предусматривает использование дорогостоящего оборудования.
Цель работы - разработка комплексов хроматографических методов определения левомицетина и тетрациклинов, позволяющих проводить разделение, обнаружение, идентификацию и предварительную оценку содержания этих антибиотиков в пищевых продуктах скрининг-методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и определение с помощью ВЭЖХ; а также, применяя разработанные нами методы анализа антибиотиков, провести определение их уровней в различных видах отечественных и импортируемых пищевых продуктов.
Использовали левомицетин 100 %-ной активности WHO Centre for Chemical Referense Substances (Швеция); тетрациклин, хлортетра-циклин и окситетрациклин 95,6, 95 и 96 %-ной активности соответственно, полученные из Государственного научного центра экспертизы и контроля качества лекарственных средств Минздрава РФ. Применяли реактивы марки «ЧДА» или «ХЧ», растворители классификации «для спектроскопии» и «для жидкостной хроматографии». ТСХ проводили на пластинках: с силикагелем фирмы Merk (США), Whatman серии Diamond (Великобритания),
Whatman УФ254 серии Diamond (Великобритания), сорбфиле (Россия), сорбфиле УФ254 (Россия), NANO-SIL RP С18-100 УФ254 фирмы MACHEREY-NAGEL (Германия), Сорбтон RP-2 (Россия). Визуализацию пятен флуоресцирующих соединений, а также веществ, поглощающих УФ-свет на хроматографических пластинках с люминесцентным индикатором, проводили, используя лампу серии Е фирмы Grace (США). Для расслоения эмульсий применяли настольную центрифугу ОП-8.
Спектры поглощения растворов и их оптическую плотность регистрировали на спектрофотометрах Hitachi-557 (Япония), Юнико-1201 (Россия) и СФ-26 (Россия) в кюветах с l = 10 мм. Для определения максимов спектров возбуждения и флуоресценции и измерения ее интенсивности использовали спектрофлуори-метр PERKIN ELMER MPF 43 A (Япония) с кюветами l = 10 и 4 мм.
Анализ проводили с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа LaChrom 2000 фирмы Hitachi (Япония) на колонках ультрасфер ODS, 5 мкм (250 х 4,6 мм) с УФ-детектором.
Левомицетин
Сливки, кефир, ряженка, йогурты: 25±0,1 мл насыщают 10 г Na2SO4, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, интенсивно встряхивают 12 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10
Содержание левомицетина нормируется во всех пищевых продуктах, но методики его количественного определения разработаны только для мяса, молока и куриных яиц.
мин при 4000 мин-1. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование. Эти-лацетатный слой объединяют.
Сметана: 10±0,1 г смешивают с 30 мл воды, насыщают 10 г Na2SO4, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 мин-1. Эти-лацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости проводя центрифугирование для расслоения.
Творог, сыр: 10±0,1 г гомогенизируют с 40 мл воды, перетирают с 10 г №^04, приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н Н^04, интенсивно встряхивают 1-2 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10 мин при 4000 мин-1. Этилацетат декантируют, а су-пернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости проводя центрифугирование для расслоения суспензии.
Очистку экстракта проводят по методике [7, 15]: объединенные этила-цетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%-ного раствора Na2CO3, насыщенного NaCl и 10 мл насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре < 50 0С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 мл смеси ацетонитрил - вода 1:4 и экстрагируют 3 х 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацета-том (3 х 5 мл). Этилацетатный экстракт сушат над №^04 (1 г), декантируют, Na2SO4 промывают 3 мл этила-
цетата, присоединяют его к экстракту и упаривают на ротационном испарителе объединенный экстракт при температуре < 50 0C досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола.
Непосредственное определение
Аликвотный объем экстракта из пищевого продукта и известное количество стандарта левомицетина вводят в жидкостной хроматограф, используя колонку Ультрасфер ODS 5 мкм (250 х4,6 мм) и систему растворителей ацетонитрил — вода + дециламин 40:60 + 5х10-3 об.ч. при X = 278 нм при скорости потока 1 мл/мин. Время удерживания левомицетина — 6,1 мин. Подтверждение определения проводят по предложенной нами ранее методике [7]: в случае обнаружения левомицетина в пробе аликвотную часть экстракта из пищевого продукта отдувают азотом досуха, приливают 150 мкл 10 %-ной
АБ тетрациклинового ряда (окси-, хлор- и др.) занимают особое положение среди антибиотиков. Согласно требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, наличие АБ тетрациклинового ряда в пищевых продуктах не допускается.
HCI и нагревают при температуре 98 0C в течение 1 ч. Затем добавляют 120 мкл 10 %-ного раствора КОН в метаноле до рН 9-10, отдувают азотом досуха и приливают 0,2 мл хлористого ацетила. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего избыток хлористого ацетила отдувают азотом, остаток растворяют в 200 мкл метанола и аликвотную часть вводят в жидкостной хроматограф в условиях проведения определения левомицетина. Исчезновение пика левомицетина и появление нового — с временем удерживания 6,5 мин свидетельствует о наличии левомицетина в анализируемом образце.
Определение по производным
Определение с n-диметиламино-бензальдегидом. На пластину для ТСХ Whatman наносят аликвотный объем экстракта из пищевого продукта, различные количества стандарта левомицетина и хроматогра-фируют в системе растворителей хлороформ — метанол 10:2. После просушивания пластинку опрыскивают раствором SnCI2 в HCI, приготовленным следующим образом: к 3 мл 15 %-ного раствора SnCI2 (в воде)
приливают 15 мл HCI и 180 мл
1 конц.
Н2О, оставляют на 10 мин и вновь опрыскивают раствором n-диметила-минобензальдегида в метаноле (2 мг/мл). Сравнивая интенсивности окраски пятен на хроматограммах стандарта и экстракта из анализируемого объекта, оценивают содержание левомицетина в пробе. На хро-матографическую пластинку наносят в ряд близко расположенных точек аликвотную часть экстракта из анализируемого пищевого продукта и различные объемы раствора стандарта левомицетина. Пластинку хро-матографируют в вышеуказанной системе, сушат и обрабатывают, как описано выше. Проявленные желтые зоны хроматограмм опыта и стандартов, а также соответствующую по Rf и площади зону пластинки, служащую контролем, элюируют смесью метанол - HQ 99:1 и полученные
конц.
растворы упаривают досуха. К сухому остатку приливают по 200 мкл 5 %-ного раствора SnCI2 в 5 % HQ и нагревают при температуре 98 0C в течение 40 мин. После охлаждения добавляют ко всем пробиркам по 2 мл 1 %-ного раствора n-диметила-минобензальдегида в метаноле и спектрофотометрируют в кюветах с I = 1 см при X = 437 нм. Определение содержания левомицетина в анализируемой пробе проводят, сравнивая оптические плотности полученных растворов.
Определение с флуорескамином. На пластину для ТСХ Whatman наносят аликвотную часть экстракта из пищевого продукта, различные количества стандарта левомицетина и хроматографируют в системе растворителей хлороформ — метанол 10:2. Пластинку сушат, затем хрома-тограмму одного из стандартов ле-вомицетина обрезают, опрыскивают раствором SnCI2 в HQ, приготовленным следующим образом: к 3 мл 15 %-ного раствора SnCI2 (в воде) приливают 15 мл НС! и 180 мл
конц.
Н2О. Пластинку оставляют на 10 мин, вновь опрыскивают раствором флуо-рескамина в ацетоне (0,1 мг/мл) и помещают в камеру с аммиаком на 3-5 мин. На хроматограммах опыта и остальных стандартов отмечают карандашом зоны, по Rf соответствующие проявленному пятну левоми-цетина, кроме того, обводят зону пластинки, служащую контролем. Зоны левомицетина и контроля элю-ируют метанолом, упаривают досуха, приливают по 200 мкл 5 %-ного раствора SnCI2 в 5 %-ной HQ и нагревают при температуре 98 0C в течение 40 мин. Избыток кислоты нейтрализуют 10%-ным раствором Na2CO3 до рН 7-8, приливают по 250
мкл раствора флуорескамина в ацетоне (0,3 мг/мл) и измеряют интенсивность флуоресценции растворов опытной пробы и стандартов относительно контроля. Содержание левомицетина в анализируемой пробе расчитывают путем сравнения интенсивности флуоресценции полученных растворов.
Тетрациклины
10±0,1 г гомогената твердого продукта или 25±0,1 мл молока перемешивают с 10 мл 0,01 н HCl и 10 г (NH4)2SO4 до полного растворения соли. Гомогенат центрифугируют, декантируют, отбирают аликвотный объем (10-15 мл) супернатанта и обезжиривают последний экстракцией изооктаном 3 х 10 мл, при необходимости применяя для расслоения эмульсии центрифугирование. Водную фазу экстрагируют 3 х 20 мл бутанола. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе, сухой остаток растворяют в 200 мкл метанола и используют для анализа.
На пластинку Сорбтон RP-2 наносят аликвотный объем экстракта из пищевого продукта, различные количества стандартов тетрациклина, окситетрациклина и хлортетра-циклина и хроматографируют в 10 %-ной щавелевой кислоте, насыщенной бутанолом. После прохождения фронтом элюента всей пластинки ее помещают в камеру с аммиаком, выдерживают 3 мин, сушат и рассматривают в УФ-свете с X = 366 нм. Пятна тетрациклинов в пробе идентифицируют по желтой флуоресценции и Rf, соответствующих стандартам, оценивают их количества, сравнивая со стандартами и обводят карандашом. Для подтверждения правильности идентификации пластинку опрыскивают 0,5 %-ным водным раствором прочной синей В соли и нагревают 3 мин в сушильном шкафу при температуре 105 0C. Ярко-розовое (в случае окситетрациклина — оранжевое) окрашивание обведенных карандашом пятен свидетельствует о наличии тетрациклинов в продукте.
Для определения тетрациклинов аликвотный объем экстракта и известные количества стандартов тетрациклина, окситетрациклина и хлор-тетрациклина вводят в жидкостной хроматограф, используя колонку Ультрасфер ODS 5 мкм (250х4,6 мм) и элюент 0,01 М щавелевая кислота - ацетонитрил — ди-метилформамид 60:34:6 + 10 мкл дециламина при скорости потока 1 мл/мин и X = 355 нм.
Продолжение следует
