CC BY
124
УДК 543.544; 637.07
Контроль содержания антибиотиков
в пищевых продуктах хроматографическими методами.
Часть II
В.К. Кирничная, канд. хим. наук, Г.Р. Касьяненко, канд. хим. наук, доцент Московский государственный университет технологий и управления им. К.Г. Разумовского Т.В. Киселёва, канд. биол. наук НИИ питания РАМН
В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяют антибиотики (АБ) для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств [1,
Для точного количественного определения левомицетина важно максимально полно выделить антибиотик из пищевого продукта, что затруднено присутствием балластных веществ.
2]. Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания АБ необходимо осуществлять путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб мо-
Таблица 1
Степень извлечения левомицетина из пищевых продуктов, %
Продукт Количество образцов Определено левомицетина х+8, %
Мясо мороженое
говяжье 6 91+9
Колбаса останкинская 12 86+10
Почки мороженые говяжьи 6 84+9
Печень мороженая говяжья 7 85+9
Сметана 6 6 80+8 84+7
Кефир 6 92+8
Ключевые слова: пищевые продукты; антибиотики; хроматографичес-кие методы определения; контроль содержания.
Key words: food products; antibiotics; chromatographic methods of determination; control of contents.
лока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них АБ. Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества АБ, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением АБ в животноводстве и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью доступных и чувствительных методов, пригодных для серийных определений и арбитражного контроля.
В связи с этим целью нашего исследования стала разработка и усовершенствование ряда способов выделения, очистки и определения наиболее часто встречающихся в пищевых продуктах АБ — левомицетина и тетрациклинов.
Достоверность определения АБ в значительной степени зависит от избранного способа извлечения их из пищевых продуктов и метода очистки экстрактов. Основные требования, предъявляемые к используемым для этой цели приемам: полнота извлечения АБ или группы АБ, если речь идет, например, о тетра-циклинах, получение экстрактов, свободных от примесей, мешающих проведению анализа выбранным методом, а также простота и быстрота выполнения операций. Желательно также, чтобы методика извлечения была в максимальной степени универсальной и позволяла проводить выделение и идентификацию
АБ из твердых и жидких продуктов различных видов.
Левомицитин
Левомицетин, как правило, содержится в пищевых продуктах в следовых количествах, а сами пищевые продукты представляют собой сложную многокомпонентную систему. Поэтому для точного количественного определения левомицетина важно максимально полно выделить антибиотик из пищевого продукта, что затруднено присутствием балластных веществ, к которым, прежде всего, относят липиды. В разработанных нами ранее методах извлечения из пищевых продуктов левоми-цетина [7, 15], основанных на депро-теинизации продукта с помощью смеси Н2Б04 и Ыа2504 и экстракции этилацетатом, не были предложены методики, применимые для продуктов с достаточно высоким содержанием жира (сметана, сыр, творог и др.). В настоящей работе предложен усовершенствованный способ извлечения левомицетина из продуктов с содержанием жира более 20 %. При анализе сметаны ее разбавляют водой в 2,5-5 раз в зависимости от жирности. Сыр и творог смешивают с водой до получения гомогенной массы. Затем проводят депротеини-зацию продукта с помощью смеси Н2Б04 и Ыа2504, экстракцию этилаце-татом и очистку экстрактов промывкой растворами с щелочными и нейтральными значениями рН. Извлечение левомицетина из сливок, кефира, ряженки и йогуртов производили аналогично извлечению АБ из молока [7]. Так же по известной методике [7] проводили извлечение левоми-цетина из мяса, мясных продуктов и яиц.
Для определения степени извлечения к трем группам образцов пищевых продуктов, не содержащих левомицетин, добавляли этот АБ так, чтобы концентрация его в каждой группе была на уровне 0,1; 1 и 5 мг/ кг. Образцы хранили 3-12 ч в холодильнике и анализировали с помощью ВЭЖХ или ТСХ. Полученные данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что полнота извле-
чения левомицетина, достигаемая по предлагаемой методике, колеблется в пределах 80-92 % в зависимости от вида продукта и должна быть учтена при расчете результатов анализа.
Для определения содержания левомицетина в пищевых продуктах в последние годы наиболее часто используют ВЭЖХ [7, 16]. Обычно разделение проводят в обращенно-фа-завом варианте на колонках С18 с водно-метанольными (ацетонит-рильными) элюентами, иногда с буферными растворами. Применение для анализа метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором затруднительно для большинства пищевых лабораторий, так как требует дорогостоящего оборудования. Как правило, детектирование осуществляют по поглощению УФ-света при л = 278-282 нм.
В связи с тем, что в экстракте из пищевых продуктов с содержанием жира более 20 % обнаруживалось достаточно большое количество примесных веществ, нами проведена работа по оптимизации условий хроматографирования [7] в части подбора элюента, обеспечивающего максимальное отделение левомице-тина от коэкстрактивных веществ. Предложена усовершенствованная методика хроматографирования, основанная на введении в систему растворителей ацетонитрил — вода 40:60 в качестве модификатора элюента дециламина в количестве 5Ч0-3 об. ч., что значительно повышает селективность разделения, сдвигая пик левомицетина в область, практически свободную от примесных веществ. Полученные нами условия хроматографирования позволяют обнаруживать левомицетин в количествах 1 нг/мкл экстракта и выше и дают хорошо воспроизводимые результаты (относительное стандартное отклонение = 0,07-0,10). Для подтверждения наличия левомицетина использовали разработанный нами ранее способ [7], основанный на обработке образующегося после гидролиза левомицетина амина аце-тилхлоридом. При этом на хромато-грамме исчезает пик левомицетина и появляется ранее не наблюдавшийся пик 1-п-нитрофенил-2-ацетилами-нопропандиола-1,3.
Разделение левомицетина методом ТСХ в нормально-фазовом варианте проводят на силикагеле, полиамиде или кизельгеле с различными системами растворителей, в которые, как правило, входят спирты. Хорошие результаты дает введение в подвижную фазу растворов аммиака. После разделения лево-
мицетин обнаруживают на пластинках биоавтографически; по окраске, образующейся в результате восстановления хлоридом олова и взаимодействия с п-диметиламинобен-зальдегидом; по поглощению УФ-света люминесцентного индикатора; по флуоресценции с флуореска-мином.
Была проведена работа по усовершенствованию разработанного нами ранее экспресс-метода определения левомицетина с помощью ТСХ [15]. Для максимального отделение левомицетина от коэкстрактивных веществ, что особенно важно для продуктов с высоким содержанием жира, предложена система растворителей хлороформ — метанол 10:2. Установлен предел обнаружения ле-вомицетина по реакции с п-димети-ламинобензальдегидом (5-10 нг в зоне) и с флуорескамином (1-2 нг в зоне) и рассчитаны (0,10-0,15 и 0,08-0,12 соответственно).
Тетрациклины
Для извлечения тетрациклинов испытывали методики, основанные на колоночной хроматографии на фазах С18. Колоночная хроматография позволяет получать достаточно чистые экстракты из пищевых продуктов, но требует дорогостоящей фазы С18 и является причиной больших потерь определяемых тетрациклинов (выход 50-60 %). Стремясь избежать применения дорогостоящей фазы С18 и повысить степень извлечения тетрациклинов, проводили экстракцию бутанолом гомогената продукта по следующей схеме: к жидким или измельченным твердым продуктам добавляли сульфат аммония и 0,01 н НС1 и гомогенизировали. Гомогенат центрифугировали, декантировали, отбирали аликвот-ный объем супернатанта и обезжиривали экстракцией изооктаном. Тетрациклины извлекали бутанолом, бутанол упаривали досуха, остаток растворяли в метаноле и использовали для анализа.
Такой ход выделения тетрацикли-нов оказался менее трудоемким, чем с применением колоночной хроматографии, он обеспечивал высокие выходы тетрациклинов 75-85 % (табл. 2) и удовлетворительную чистоту конечных экстрактов после предварительной хроматографичес-кой очистки и разделения. Эксперименты по определению степени извлечения проводили на образцах пищевых продуктов, в которых тетрациклины не были обнаружены. Для этого к ним добавляли растворы тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрациклина так, чтобы кон-
Таблица 2
Степень извлечения тетрациклинов из пищевых продуктов, %
Количество образцов Определено, х+8, %
Продукт тетрациклин окситет-рациклин хлортет-рациклин
Мясо
мороженое
говяжье 6 79 + 8 81 + 8 77+7
свиное 6 77+7 78+7 75 + 5
Почки мороженые 6 82+8 85 + 8 76+6
Молоко 8 82+8 80+7 78+7
Сметана 30%-ная 6 76 + 5 77+6 75+4
Сыр Российский 6 81+9 83 + 8 80+7
центрация его в каждой группе была на уровне 0,01, 0,1 и 1 мг/кг. Образцы хранили 12-24 ч в холодильнике и анализировали с помощью ВЭЖХ.
Для создания ТСХ-метода определения тетрациклинов использовали отечественные пластинки Сорбтон КР-2. С помощью найденного нами элюента 10 %-ной щавелевой кислоты, насыщенной бутанолом, удалось добиться полного отделения зон тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрациклина. Испытание известных из литературы цветных реакций на фенольную группу тетрацик-линов позволили предложить реакцию с тетраазотированным о-диани-зидином (прочной синей В солью), позволяющую обнаруживать тетрациклины в количестве 5-10 нг в зоне. Она использована для подтверждения правильности идентификации этих АБ на хроматографической пластинке.
Анализ тетрациклинов методом ВЭЖХ выполняют почти исключительно в обращенно-фазовом варианте, используя Лихрособ С8, Нукле-осил С8, Новопак С18 и другие ОБ- и ODS-привитые фазы. Идентификацию проводят с помощью масс-спек-трометрических, УФ- и флуоримет-рических детекторов. Использование для анализа метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором [12] затруднительно для большинства пищевых лабораторий, так как требует дорогостоящего оборудования. В качестве элюентов при-
Анализ пищевых продуктов на наличие в них тетрациклинов выполняли с помощью разработанного нами комплекса хроматографических методов.
Таблица 3
Содержание левомицетина в пищевых продуктах, мкг/кг или мкг/л_
Количество образцов % обнаружения Пределы колебаний
Продукт Проанализировано Найден левомицитин с ТСХ с ВЭЖХ
Мясо:
Говяжье 12 1П 3 1 25 1П 28,5-113,7 П — "Ж 3 30,1-95,6
Свиное Куриное (без кожи) 15 1 3 20 и 25,3 0-54,2 0-20,0 10,3-46,1
Куриное (без кожи), США 6 0 0 Не обнаружено
Колбасы:
Докторская 12 2 17 0-20,2 12,0-19,7
Останкинская 12 2 17 13,9-18,4 10,8-16,9
Почки говяжьи 7 1 14,3 0-164,2 0-183,4
Печень говяжья 7 0 0 Не обнаружено
Кожа куриная 15 3 20 60,1-125,4 49,1-106,5
Молоко (~МРТЯ мя 28 8 9 0 32 0 15,4-74,1 1—|р ппн; 12,8-62,5
ч_IV! С; 1 О Па Творог 12 1 8,3 1 1С и^пс 0-18,4 у/тчСПи 0-15,6
Кефир 21 2 9,5 17,8-32,3 15,8-30,9
Таблица 4
Содержание тетрациклинов в пищевых продуктах, мкг/кг или мкг/л
Количество образцов Пределы колебаний
Продукт Проа-нали-зиро-вано Найдено тетрациклин окситетрациклин хлортетрациклин
тетрациклин окситетра-циклин хлортетрациклин
Мясо
говяжье 8 0 0 0 Не обнаружено
свиное 6 0 0 0 Не обнаружено
куриное 14 6 1 6 8,0-22,3 10,4-17,0 7,1-83,4
куриное (США) 6 0 0 0 Не обнаружено
Колбасы:
Докторская 10 0 0 0 Не обнаружено
Останкинская 10 1 0 0 4,4 Не обнаружено
Почки говяжьи 6 0 0 2 Не обнаружено 15,6-28,3
Печень говяжья 6 0 0 0 Не обнаружено
Кожа куриная 12 5 2 5 12,3-40,2 14,9-20,6 18,1-100,5
Молоко 15 2 0 1 10,0-15,1 Не обнаружено 6,2
Сметана 30%-ная 6 0 0 2 Не обнаружено 18,5-29,1
Творог 6 1 0 1 12,8 Не обнаружено 22,6
Сыр Российский 6 0 0 0 Не обнаружено
меняют буферные растворы с добавкой растворителей: ацетонитрил, ди-метилформамид и модификаторов — четвертичного аммонийного основа-
В результате проведенных исследований разработаны методы извлечения левомицитина, тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрациклина из продуктов питания.
ния и его солей. В ряде случаев удается разделить тетрациклин, окси-тетрациклин и хлортетрациклин, однако используемые при этом условия (рН 2) приводят к быстрому износу колонок и потере эффективности.
Нам удалось разделить тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклин, надежно отделить их от примесей, используя введение в лучшую из предложенных смесь: 0,01 М щавелевая кислота — ацетонитрил — метанол 73:10:17 диметил-формамида и дециламина в качестве модификатора элюента, не при-
менявшегося ранее для этой цели. Предел обнаружения метода составляет 0,1 нг/мкл для тетрациклина и окситетрациклина, 0,3 нг/мкл для хлортетрациклина.
Сочетание данного метода с скрининг-тестом ТСХ, применяемым для разделения, идентификации, подтверждения наличия тетрациклинов в образце и предварительной оценки их концентраций, позволил предложить комплекс хроматографичес-ких методов определения тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрациклина в пищевых продуктах, в котором ВЭЖХ используется для образцов с установленным наличием тетрациклинов.
Нами был осуществлен контроль содержания АБ в различных видах отечественных и импортируемых пищевых продуктов. Анализы выполняли разработанными нами методами, пригодными для серийных анализов (ТСХ) и арбитражного контроля (ВЭЖХ). Определение проводили не менее чем в шести образцах каждого вида продукта, часто двумя различными способами. Для анализа отбирали образцы товарных продуктов из торговой сети Москвы.
При определении АБ большое внимание было уделено анализу мяса, важного продукта питания и основного ингредиента всех мясных продуктов.
Степень загрязнения и концентрации левомицетина в свином мясе существенно ниже (0-25,3 мкг/кг), чем в говяжьем (28,5-113,7 мкг/кг) и курином (0-125,4 мкг/кг). В колбасах они существенно ниже из-за разбавления мяса другими ингредиентами (0-20,2 мкг/кг). Интересен факт отсутствия левомицетина в импортном курином мясе и обнаружение его, хотя и не частое (три образца из 15), в отечественных курах. Из субпродуктов частотой обнаружения и остаточным количеством левоми-цетина существенно выделялась кожа кур (60,1-125,4 мкг/кг). Концентрации левомицетина в молоке и молочных продуктах невелики (074,1 мкг/кг), хотя вызывает беспокойство высокая частота обнаружения в них АБ. В молоке, купленном в торговой сети Москвы, она составляет 32 %. В рыбе, мёде и яйцах лево-мицетин отсутствует на уровне предела обнаружения метода с использованием ВЭЖХ - 10 мкг/кг. Результаты контроля содержания левоми-цетина в пищевых продуктах представлены в табл. 3.
Анализ пищевых продуктов на наличие в них тетрациклинов выполняли с помощью разработанного нами комплекса хроматографических ме-
тодов. На первом этапе все образцы подвергали скринингу с помощью ТСХ, оценивали содержание тетра-циклинов в пробе и в случае подтверждения наличия этих АБ проводили определение с помощью ВЭЖХ. Как видно из результатов, представленных в табл. 4, основную опасность с точки зрения поступления в организм человека неконтролируемых количеств тетрациклинов из мясных продуктов представляют отечественные куры (до 83,4 мкг/ кг). Загрязненность хлортетрацик-лином выявлена и при анализе говяжьих почек (до 28,3 мкг/кг). Результаты определения остаточных количеств тетрациклинов в молоке и некоторых молочных продуктах свидетельствует о невысокой частоте загрязнения. В ряде случаев наблюдается превышение ПДК. Например, в молоке, приобретенном в торговой сети, твороге и сметане содержание тетрациклинов составляет для тетрациклина от 10,0 до 15,1 мкг/кг, для хлортетрациклина от 6,2 до 24,6 мкг/кг. Окситетра-циклин в этих видах продуктов не обнаружен. В целом, загрязненность молочных продуктов тетра-циклинами ниже, чем левомицети-на. Проведенный анализ рыбы и мёда показал, что ни в одном из восьми образцов указанных продуктов тетрациклины обнаружены не были. Достаточно высока частота обнаружения тетрациклинов в яйцах, а содержание составляет до 89,4 мкг/кг, причем тетрациклины накапливаются в основном в желтке. Результаты загрязненности пищевых продуктов АБ согласуются с результатами контроля, полученными нами ранее [17, 18].
Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны методы извлечения левомицити-на, тетрациклина, окситетрацикли-на и хлортетрациклина из продуктов питания. Усовершенствованы хроматографические методы определения левомицитина в продуктах питания с различным содержания жира.
Разработан комплекс хромато-графических методов определения тетрациклинов, заключающийся в разделении, обнаружении, идентификации и предварительной оценке содержания в образце с кри-нинг-методом и их определении с помощью ВЭЖХ. Предел обнаружения 1 мкг/кг, относительное стандартное отклонение не превышает 0,14.
Проведен контроль содержания АБ в различных видах пищевых продуктов, отобранных из торговой сети
Москвы, и установлено, что максимально загрязнены АБ мясо и мясные продукты, несколько меньше яйца, содержание АБ в молоке и молочных продуктах находится на минимальном уровне.
ЛИТЕРАТУРА
1. Соколов, В.Д. Программные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации/ В.Д. Соколов//Международный вестник ветеринарии. - 2009.-№ 2. - С. 5-9.
2. Антипов, В.А. Вопросы развития ветеринарной фармации/В.А. Анти-пов, А.Н. Трошин//Ветеринария Кубани. - 2010. - № 6. - С. 21-22.
3. Сергеев, Т.А. Вредное влияние антибиотиков на здоровье потреби-теля/Т.А. Сергеев//Врач и аптека XXI века. - 2001. - Вып. 9. - 25 с.
4. Antibiotic use in shrimp farming and implications for environmental impacts and human health/K. Holmstrom [et al.]//International Journal of Food Science & Technology. - 2003. - Vol. 38. -№ 3. - P. 225-266.
5. ГОСТ Р 53912-2010. Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков.
6. МУК 4.1.2158-07 «Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа».
7. Определение остаточных количеств левомецитина (хлорамфени-кола, хлормецитина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммунофермент-ного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912-04/В.А. Тутельян [и др.]. - М., 2004. - 24 с.
8. Буркин, А.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Иммуноферментный анализ тетрациклинов/А.А. Буркин, Г.П. Кононенко, М.А. Буркин// Сельскохозяйственная биология. -2010. - № 4. - С. 110-117.
9. Gasilova N.V. Determination of Chloramphenicol in Milk by a Fluorescence Polarization Immuno-assay/N.V. Gasilova, S.A. Eremin//J. of Analytical Chemistry. - 2010. - Vol. 65. - № 3. - Р. 255.
10. Determination of Residues in Milk by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Improvement by Biotin-Streptavidin-Amplif ied System/Li Wang [et al.]//J. of agricultural and food chemistry. - 2010. - Vol. 58. -№ 6. - P. 3265 - 3270.
11. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа многокомпонентных лекарственных препаратов/А.В. Кос-тарной [и др.]// Журнал аналитической химии. - 2008. - Т. 63. - № 6. -С. 566-580.
12. ГОСТ Р 53601-2009 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
13. Кирничная, В.К. Хроматогра-фические методы исследования антибиотиков в пищевых объектах/ В.К. Кирничная, Г.Р. Касьяненко// Материалы Всерос. научно-практ. семинара «Методы и приборное обеспечение аналитического контроля для агропромышленного комплекса и пищевой промышленности» 7-й Международной специализированной выставки ЛабораторияЭкс-по-2009. - М., 2009. - С. 41-42.
14. Dispersive Liquid-Liquid Mikroextraction Followed by High-Perfomance Liquid Chromatography as an efficient and sensitive technique for simultaneous determination of chloramphenicol and thiamphenicol in honey/H. Chen [et al.]//Analitica Chimica Acta. - 2009.- V. 632.-№ 1. - P. 80.
15. Метод. рекомендации по обна-руж., идентификации и определению остаточных количеств левомецитина в продуктах животного происхождения/Б.Г. Ляпков [и др.]. Минск - Москва: БелГИУВ МЗСССР, 1991. - 12 с.
16. Rodziewicz, L. Rapid determination of chloramphenicol residues in milk powder by liquid chromato-graphy-elektrospray ionization tandem mass spectrometry/L. Rodziewicz// Talanta. - 2008. - V. 75. - P. 846850.
17. Кирничная, В.К. Загрязнение пищевых продуктов лекарственными препаратами и возможности использования хроматографических методов для их контроля. Сб. науч. трудов VI научно-практической конф. «Наука, образование, производ-ство»/В.К. Кирничная, Д.Б. Мела-мед. - Калуга, 2007. - С.162-165.
18. Кирничная, В.К. Идентификация и определение содержания ле-вомицетина в продуктах детского питания: Сб. науч. статей Всероссийской научно-практической конф. «Школьное питание: инновационные технологии и современные формы организации»/В.К. Кирнична-я, Г.Р. Касьяненко. - М.: МГУТУ им. К.Г. Разумовского, 2012. - С. 87-89.
