CC BY
67
МИКОЛОГИЯ
УДК 582.284
ХАРАКТЕРИСТИКА РЯДА ДИКОРАСТУЩИХ ШТАММОВ ВЕШЕНКИ С ЦЕЛЬЮ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОМ ГРИБОВОДСТВЕ
ВТ;.Никитина, Н.Л.Маринииа*, В.А.Нолдырев*, Р.Л.Озерова*4 Институт биохимии и физиологии растении и микроорганизмов РАИ *Саратовский государственный университет им. 111\ Чернышевского **С.аратовскии государственный аграрный университет им. Н И.Вавилова
Достаточно широкое культивирование грибов рода Р1еигоШ$ во многих странах мира, в том числе и России, обусловлено их способностью расти и плодоносить на самых разных липюцеллюлозных субстратах. Рентабельность производств по выращиванию вешенки во многом зависит от особенностей и состояния культуры применяемой в производстве. Поэтому грибоводство, как отрасль, постоянно нуждается в появлении новых высокоурожайных штаммов. 15 связи с этим необходим целенаправленный и расширенный поиск и выделение в чистую культуру дикорастущих пггаммов вешенки, которые могут использоваться как для непосредственного культивирования, так и в качестве селекционного материала.
Целью настоящей работы было осуществление поиска и вг,¡деление культур дикорастущих грибов рода ПеигоШя, определение видовой принадлежности выделенных штаммов, изучение их свойств и урожайности в сравнении со штаммами, уже широко используемыми в производстве.
Объектом исследований служили штаммы Зоммер и Флорида из коллекции высших грибов лаборатории микробиологии и микологии ИБФРМ РАН, а также четыре дикорастущих изолята Р1еигоШ, обозначенные как Д1, Д2, Волжский, Академический. Сбор плодовых тел грибов, принадлежащих к роду Р1еи-тШя, осуществлялся в лиственных и смешанных лесах Саратовской области. Выделение чистых культур с базидиом проводилось по стандартной методике тканевым способом. Культуры подвергались микроскопическому контролю и очистке от посторонней микрофлоры с помощью обычных методов микробиологической техники (Методы ..., 1982). Сведения о местах сбора грибов и древесных породах представлены в таблице 1.
Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов использовали описание некоторых характерных признаков плодовых тел, предложенное Л.В. Гарибовой с сотр. (1992). Результаты показали, что базидиомы образуют сростки но 4-7 (реже более 7) штук; шляпка 10-12 см в диаметре, округлая, раковиновидная, плоская, реже воронковидная; пластинки серовато-белые до кремовых, низбегающие; ножка 3-6 х 1,1-2 см, серовато-белая, в нижней части опушенная; мякоть серовато-белая, плотная; споровый порошок лилово-серый. Таким образом, по признакам базидиом найденные дикорастущие изо-ляты были определены как принадлежащие к виду Р1еигоШ оМгеаШх (Рт.) Китт.
Для подгвёржения видовой принадлежности, кроме исследований на стадии плодовых тел, проводили определение культур по ключу, касающемуся их мицелиальных форм, предложенному теми же авторами (Гарибова и др., 1992). В связи с этим изучались характеристики роста выделенных культур на сусло-агаре в чашках Петри: скорость роста, зональность колонии гриба, структура и окраска мицелия, определение качественных реакций на полифенолоксидазы.
Таблица I. Первичные сведения о выделенных дикорастущих
штаммах вешенки
Шгамм Период сбора Место сбора (Адм. район) Древесная порода Дата получения плодовых тел в лабораторных условиях
Д1 сентябрь 98 Лысогорский Populas nigra 07.05.99
Д2 октябрь 98 Базарно-Карабулакский Ulmus pumila 05.05.99
Волжский октябрь 98 Базарно-Карабулакский Tilia cordata 31.04.99
Академический октябрь 98 Воскресенский Populus trémula 02.05.99
Для изучения линейного роста изучаемую культуру высевали равным количеством в центр чашки Петри с сусло-агаром и выращивали в термостате при 26°С. Диаметр колонии измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях на 3, 5, 7, 9 сутки роста. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Линейный рост штаммов Р. оя/геаШи на среде сусло-агар
Штамм Радиус колонии, мм
3-й сутки 5-е сугки 7-е сугки 9-е сутки
Д1 10,6 20,7 35,2 43,0*
Д2 7,3 19,3 33,8 43,0*
Волжский 10,5 23,8 35,5 43,0*
Академический 13,4 27,4 43,0* -
* Полное зарастание чашки Петри
Наиболее быстрый рост, т. е. полное зарастание чашки Петри с сусло-агаром на 7-е сутки культивирования, наблюдался у штамма Академический.
17i
Штаммы Д1 и Волжский имеют практически равные показатели, а штамм Д2 наименее акгивен среди исследуемых культур по показателям линейного роста колоний.
Все выделенные штаммы по скорости роста (табл.3) относя тся к быстрорастущим, что характерно для производственных штаммов Р. о.ИгеаШя (Леком-цева и др., 1997). По типу окраски мицелия среди изучаемых штаммов наблюдалось некоторое однообразие. Штаммам Д1, Волжский и Академический свойственна белая окраска, штамму Д2 - светло-желтая.
Таблица 3. Основные показатели ключа к определению видовой принадлежности выделенных штаммов Р. оМгеашз
Штамм Структура мицелия Зональность колонии Скорость роста, см/сут Окраска мицелия Цветовая реакция с
бензидином а- нафтолом
Д1 высокий, пушистый слабо выражена 0,50 белая коричневая фиолетовая
Д2 высокий, пушистый слабо выражена 0,48 светло-желтая коричневая фиолетовая
Волжский высокий, пушистый ярко выражена ОД) белая коричневая фиолетовая
Академический высокий, пушистый ярко выражена ОД) белая коричневая фиолетовая
При этом у Д2 на 7-е сутки роста появлялось кольцо с янтарно-желтым окрашиванием. Изученным штаммам P. ostreatus на первых этапах роста не свойственно проявление зональности. Позднее, к 7-м суткам, появляется выраженная зональность. В процессе роста мицелий имеет равномерно-пушистую структуру. К 9-м суткам или позднее иногда формируются мицелиальные тяжи с узелками, как показатель старения мицелия.
Известно, что при идентификации мицелиальных ксилогрофов в природных субстратах необходимо знать особенности вегетативных структур грибов. Среди исследований морфологии мицелия ксилотрофов с помощью микроскопии следует отметить работу A.C. Бухало и др. (1985), где рассматриваются особенности мицелия in vitro у культивируемых видов съедобных грибов. Характерной морфологической особешюстью гиф высших базидиомицетов является наличие пряжек ыа диплоидном мицелии, которые представляют собой небольшие дугообразной формы клетки, расположенные против поперечной перегородки гифы. При многократных пассажах в лабораторных условиях может идти процесс дедикариотизации гиф, сопровождающийся потерей пряжек, что, в свою очередь, приводит к потере урожайности, т.е. снижению образования плодовых тел (Бухало и др., 1988). В связи с этим вопрос о стабильности морфологического признака, а именно наличия ггряжек на гифах, имеет большое значение.
В нашей работе определялось число пряжек ка мицелии 9-дневпых культур Р. о.ИгеаШх . В процессе исследования были отмечены различия во внешнем виде и количестве пряжек, а также толщине гиф мицелия дикорастущих штаммов. Как видно из таблицы 4 и в связи с вышеизложенным, можно предположить, что штаммы Д1 и особенно Академический наиболее урожайные из всех в нашем эксперименте.
Таблица 4. Особенности внешнего вида мицелия Р. о.ч1геа№ ___в световом микроскопе (40x10) _
Штамм Количество пряжек Вид пряжек Сравнительная толщина гиф
Д1 3,7 ±0,2 одиночные, медаяьонные средние
Д2 1,6±0,1 парные, медальотшые тонкие
Волжский 2,6 ±0,4 мелкие, одиночные, без зазора средние
Академический 2,8 ±0,1 крупные, одиночные, медаль-онные толстые
Проведены сравнительные исследования физиологии роста и накопления биомассы выделенных культур и производственных штаммов Зоммер и Флорида на жидкой питательной среде - 2 пивном сусле.
Как видно из рис. 1, исследуемые штаммы к 7-м суткам выращивания разделились на 3 группы: штамм Д2 накапливает менее 2 г/л, Зоммер, Волжский, Флорида и Академический - от 2 до 3 г/л, штамм Д1 - более 3 г/л сухой биомассы. По к 14 суткам картина меняется. Штаммы Академический и Д2, накапливая биомассу с прежней интенсивностью, показывают наименьшие результаты - 4,38 и 2,74 г/л соответственно. Штамм Д1, резко снижая активность, теряет ведущее положение - 5,57 г/л, в то время как Зоммер, Волжский и Флорида увеличивают темпы накопления биомассы. Причем Волжский (7,24 г/л), незначительно уступая штамму Зоммер (8,27 г/л), показывает большие результаты, нежели Флорида (6,19 г/л). В связи с этим штаммы Волжский и Д1 представляют интерес в качестве продуцентов биомассы кормового и пищевого назначения, а также промежуточного жидкого посевного материала для производства коммерческого мицелия.
Параллельно с определением сухой массы мицелия проводили микроскопические исследования глубинного мицелия. В глубинной культуре внутривидовые штаммовые различия, заметные у мицелия, выращенного на твердом субстрате, не выражены.
Внешний вид пряжек у всех 6 исследуемых штаммов принимает одинаковые очертания. Количество пряжек на гифах чистой культуры приближается к 2 в поле зрения. Толщина гиф уменьшается по сравнению с субстратным мицелием.
Рис. 1 Накопление сухой биомассы различными штаммами Р. <тге.Шш.
Исследуемые гптаммы показали высокую ферментативную активность. Изучение 6 штаммов Р. охОеашх показало, что все они обладают по-лифснолоксидазной активностью (табл. 5).
У всех штаммов выявлено наличие лакказы и пероксидазы. Тирозиназа в пробах не обнаружена. Нужно отметить, что у выделенных нами 4 дикорастущих штаммов цветовые реакции на лакказу и пероксидазу проявлялись примерно через 10 мин после внесения реактива, а у производственных штаммов Зоммер и Флорида это время составляло 60 мин. Если учесть, что проявление реакции в течение ча-
са показатель высокой активности, то полученные результаты свидетельствуют об очень высокой ферментативной активности, изучаемых штаммов.
Таблица 5. Цветовые химические реакции (время появления окраски, мин после
начала реакции) на оксидазы у Р. 0й1геаш
Штамм Фенолоксидазы Лакказа Тирозиназа Пероксидаза
Д1 + 10 — 10
Д2 1 10 — 10
Волжский + 10 10
Академический + 10 — 10
¡¡от тег + 60 — 60
Р1оп<1а + 60 — 60
Дчя оценки урожайности дикорастущих штаммов Р. о$1геа1ш получали плодовые тела. В первую очередь необходим подбор контрольного штамма. В связи с тем, что наиболее распространенными в грибоводстве являются штаммы Зоммер и Флорида, мы сочли возможным использовать их в качестве стандарта.
Чтобы дать оценку урожайности новых штаммов по сравнению с производственными штаммами, мы постарались свести до минимума влияние всех посторонних факторов. В первую очередь следует обратить внимание на качество посевного мицелия. Необходимым условием является его однородность, т.е. он выращен па субстрате одного происхождения, по одной технологии и имеет одинаковый возраст. Это важно в связи с тем, что от качества посевного материала зависит его приживаемость, а в конечном счете и урожайность грибов. В течение 2 недель с субстрата снимали плодовые тела с размером шляпки от 4 до 7 см и с ножкой не длиннее 4 см. В связи с тем, что плодовые тела вешешеи очень гигроскопичны, и их масса может меняться с изменением влажности окружающей среды, определяли содержание сухого вещества в полученных плодовых телах, высушивая их до постоянного неса. Для оценки величины урожайности штаммов делали расчет по предложенному А.И. Иванововым и Л.В. Гарибовой (1989) способу, исходя из общепринятой доли содержания воды в плодовом теле - 90% от массы триба.
Полученные результаты позволяют судить об урожайности изучаемых штаммов. Из рис. 2 видно, что по этому показателю Академический превышает производственные штаммы, а Волжский, уступая Зоммер, все-таки урожайнее, чем Флорида. Штаммы Д1 и Д2 значительно отстают по этой характеристике как от Зоммер и Флорида, так и от дикорастущих Академическою и Волжского.
100
Рис. 2. Урожайность дикорастущих и производственных штаммов Р. ostrealus
Таким образом, собранные в Саратовской области дикорастущие штаммы псшенки выделены в чистую культуру и зарегистрированы в коллекции высших грибов лаборатории микробиологии и микологии ИБФРМ РАН как Д1, Д2, Волжский и Академический. Установлено, что все 4 выделенные штамма являются Р. ostreatus (Fr.) Kumm. - вешенка обыкновенная, или устричная. Наибольшим накоплением биомассы в жидкой культуре характеризуется штамм Волжский, который по этому показателю превосходит производственный штамм Флорида и незначительно уступает производственному штамму Зоммер. Другие исследуемые штаммы обладают меньшей скоростью накопления биомассы. Штамм Академический имеет наиболее высокую урожайность, по которой превышает производственные штаммы Зоммер и Флорида. Штамм Волжский характеризуется большей урожайностью, чем Флорида, но меньшей, чем Зоммер. Штаммы Д1 иД2 являются наименее урожайными. На основании изученных свойств дикорастущих штаммов рекомендуем к внедрению в практическое грибоводство штаммы Академический и Волжский как перспективные.
Литература
Методы экспериментальной микологии. Киев, 1982,550 с.
Гарибова JI.B., Барсукова Т.Н., Иванов А.И., Иманкулов М.О. Виды вешенок, перспективные для промышленного культивирования // Биол. науки. 1992. Вып. 3, С. 109-115.
Лекомцева С.Н., Чайка М.Н., Инсарова И.Д., Гарибова Л.В. Характеристика некоторых видов и ш таммов грибов из рода Pleurotus II Наука и практика грибоводства: Материал),IIV Междунар. конф. Москва, 1997. С. 57 60.
Macc.i плчл тел. г
110
Академ. Sommer Волжск Florida Д1
№ Шммм
Бухало Л.С., Закордонец О.Л., Шашек В. Исследование культур высших ба-зидиальных грибов в сканирующем электронном микроскопе. 1. Пряжки. //Миколотя и фи топатология. ) 985. Г. 19. Вып. 3. (1 199 - 202.
Бухало A.C., Митропольская Н.Ю., Качуровская В.П., Косман Н.1 . Биологические особенности вешенки обыкновенной Р. ostreatus (Fr.) Kumm. При длительном культивировании // Микология и фи топатология. 1988. Т. 22. Вып. 5. С. 385-388.
Иванов А.И., Гарибова Л.В. Методика оценки урожайности новых штаммов Р. ostreatus (Jaca.: Fr.) Kumm. // Микология и фитопатология. 1989. Т. 23. Вып. 5. С. 485-487.
УДК 582.284
ОСОБЕННОСТИ РОСТА МИЦЕЛИЯ LENTINIJS EDODES IIA РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ
В.Р..Г1нкитина, Р.А.Озерова*, О.М.Цивилева Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН * Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова
С древних времен Lentinus edades, или шиитаке, или черный лесной гриб считают эликсиром жизни. В естественных условиях он встречается только в лесах Дальнего Востока, Японии, Китая, Кореи и на Филиппинах, и уже более двух тысяч лет используется в пищу и для лечебных целей. В последнее время интерес к шиитаке резко возрос, что связано с его ноистине уникальными целебными свойствами.
В мировом производстве грибов L. edodes занимает второе место после шампиньонов. В России культивирование шиитаке только начинается. 11роцесс получения плодовых тел в искусственных условиях состоит из двух этапов. На первом этане выращивают мицелий сначала на различных плотных и жидких средах, а затем на зерне, на втором - получают плодовые тела грибов на древесных обрезках или на опилках лиственных пород деревьев. Для наиболее успешного внедрения данной культуры в практическое грибоводство необходимо провести подбор наиболее подходящих для каждого штамма питательных сред lía всех этапах его производства.
Целью настоящей работ ы было изучение мицелиального роста L. edodes на минеральных и органических средах. Объектом исследования служили штаммы L. edodes 2Т, F-249, NY и 0779 из коллекции высших базидиальных грибов ИБФРМ PAFI (г. Саратов). В эксперименте использовали минеральную среду Планкетта и 5 вариантов органических сред: мелассу, солодовый экстракт, пивное сусло, пшеничную муку, муку с дубовым отваром.
Оценку роста культуры на плотной среде проводили по ростовому коэффициенту, на жидких средах - но накоплению биомассы (Бисько и др., 1983; Бухало, 1988; Александрова и др., 1998; Методы ..., 1982)). Результаты учитывали через день, начиная с 5-го дня при культивировании на плотной среде и с 1-го дня - на жидких средах.
