CC BY
107
УДК 561.284.579.61
сравнительная характеристика морфологии ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ КСиЛОТрОФНЫХ БАЗидиОМиЦЕТОВ рОДА PLEUROTUS -продуцентов биологически активных веществ
В.В. тарнопольская, Е.А. Мельникова, О.в. киселева, Е.в. Алаудинова, П.в. Миронов
ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail:[email protected]
Приведена сравнительная макро- и микроморфологические характеристика чистых культур ксилотрофных базидиомицетов Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius и Pleurotus djamor, используемых в технологии глубинного культивирования мицелярной биомассы с целью получения комплекса биологически активных веществ.
Ключевые слова: вешенка устричная (Pleurotus ostreatus), вешенка легочная (Pleurotus pulmonarius), вешенка розовая (Pleurotus djamor), ксилотрофные базидиомицеты, мицелий, глубинная культура, морфология.
A comparative morphological characteristic of pure cultures of the three species of xylotroph basidiomycetes Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, and Pleurotus djamor are presented in this study; the cultures are used in submerged cultivation technology with the purpose of obtaining a spectrum of biologically active compounds.
Keywords: Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus djamor, xylotroph basidiomycetes, mycelium, submerged culture, morphology.
введение
Биоконверсия растительного сырья представителями царства Fungi- грибами - одно из перспективных направлений современной промышленной биотехнологии. Культуры высших грибов-базидио-мицетов широко применяются для получения плодовых тел, культурального мицелия, фармацевтических препаратов, ферментов и т.д. Плодовые тела грибов характеризуются высоким содержанием полноценных белков, витаминов, микроэлементов, а липиды, входящие в состав грибов, содержат, в основном, ненасыщенные жирные кислоты. Важнейшей группой биологически активных соединений базидиомице-тов являются полисахариды. Доказано противоопухолевое, иммуностимулирующее, противовирусное, гиполипидемическое и гипохолистеринимическое действие полисахаридов, синтезируемых базидио-мицетами [1], а препараты и биологически активные добавки к пище на их основе активно используются в медицине стран азиатско-тихоокеанского региона.
Во многих странах традиционным является организация грибоводческих хозяйств для получения плодовых тел грибов поверхностным культивированием на растительных субстратах, составляемых из отходов сельскохозяйственных и деревообрабатывающих производств (опилки, кора, солома, мякина, мезга, несортовое зерно и корнеплоды и т.д.). Однако получение плодовых тел является энерго- и трудоемким процессом, кроме того, носит сезонный характер и довольно продолжительно по времени - от инокуля-
ции субстрата мицелием до получения урожая зачастую проходит более месяца.
Современная биотехнология предлагает альтернативу традиционному грибоводству - выращивание вегетативного мицелия базидимицетов погружным способом в специальных аппаратах -биореакторах. Глубинный мицелий, выращиваемый в оптимизированных условиях, не уступает, а зачастую превосходит плодовые тела по содержанию белка и биологически активных веществ [2,3]. Кроме того, к неоспоримым преимуществам данного метода следует отнести существенное сокращение производственного цикла, возможность получения биомассы с контролируемым химическим составом, стерильность получаемого продукта.
Качество и количество получаемой в глубинной культуре биомассы и синтезируемых мицелием биологически активных веществ во многом зависят от вида продуцента, отобранных штаммов, параметров культивирования и состава питательной среды.
Одним из важнейших этапов технологии глубинного культивирования является выбор продуцента. Среди множества родов базидиомицетов наиболее перспективными для глубинного культивирования считаются дереворазрушающие грибы, являющиеся быстрорастущими, непритязательными к составу питательных сред, что, наряду с их нетоксичностью и высокой пищевой ценностью, имеет существенное значение для использования в качестве объекта культивирования.
Учитывая сказанное, нами для разработки технологии глубинного культивирования с выделе-
В.В. Тарнопольская, Е.А. Мельникова: Сравнительная характеристика морфологии глубинной культуры ксилотрофных базидиомицетов..
нием комплекса биологически активных веществ были выбраны лигнотрофные сапрофиты рода Pleurotus.
Поскольку для поддержания чистоты культуры в биотехнологическом производстве необходим постоянный микробиологический контроль продуцента, прежде всего по морфологическим признакам, целью данного исследования явилось сравнительное изучение микроморфологических особенностей штаммов вешенки устричной, вешенки легочной и вешенки розовой в поверхностной и глубинной культуре.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом настоящего исследования являлись штаммы базидиальных грибов PO-4.1 Pleurotus ostreatus (P. ostreatus), PP-3.2 Pleurotus pulmonarius (P. pulmonarius), PD-3.2 Pleurotus djamor (P. djamor), чистая культура которых была выделена из коммерческих плодовых тел. Систематическое положение: царство Fungi; отдел Basidiomycota; класс Agaricomycetes; подкласс Agaricomycetidae; порядок Agaricales; семейство Pleurotaceae; род Pleurotus; виды Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus djamor [4].
Для изучения особенностей роста в различных биотехнологических системах и определения макро-и микроморфологических признаков проводили культивирование штаммов в поверхностных и глубинных условиях. Поверхностное культивирование осуществляли на сусловом агаре и агаризованном овсяном отваре [5] в чашке Петри при температуре 26±1 оС в течение 7 суток.
Глубинное культивирование проводили в стационарном лабораторном биореакторе «CeCa-Cx650, Великобритания» в течение 96 часов при температуре 26±1 оС , рН 5,0 и непрерывном перемешивании путем барботирования стерильным воздухом (расход воздуха 100 л/ч на 1л среды). Среду предварительно стерилизовали в автоклаве в течение 30 минут при 0,5 кгс/см2. В качестве питательной среды использовали 3 % крахмальную среду с добавками минеральных солей. Перед стерилизацией среду для снижения вязкости обрабатывали при 60 оС промышленным ферментным препаратом -термостабильной а-амилазой (термоамил 120 L, Германия).
Посевным материалом служили глубинные культуры P. ostreatus, P. pulmonarius и P. djamor, выращенные на лабораторном шейкере в колбах объемом 250 мл; количество вносимого инокулята составило 5 % от расчетного выхода абсолютно сухой биомассы. Выход биомассы определяли гравиметрически.
Микроморфологические особенности изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ ТМ-1000, Toshiba, Япония), изображения
культур на чашках Петри получали с помощью цифровых камер Nikon PIX 4500 и Canon Power Shot A650IS.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно литературным данным, мицелиальная культура, полученная из плодового тела, состоит из диплоидного мицелия с характерными пряжками, наличие которых служит несомненным доказательством принадлежности гриба к высшим базидиомицетам [6]. Кроме пряжек имеется целый ряд микроскопических признаков, характерных для базидиальных грибов, но встречающихся и у грибов других систематических групп. Это анастомозы, медальоны, вздутия, тяжи, ризоморфы, инкрустированные гифы и др. При идентификации культур эти признаки должны приниматься во внимание в совокупности со всеми морфоло-го-культуральными особенностями данного вида в условиях искусственной культуры. Важным характеризующим признаком также является характер и скорость роста на различных средах, окраска мицелия и субстрата, выделение экссудата, запах. Все эти особенности базидиомицетов нами использовались для описания морфологии исследуемых штаммов.
Чистые культуры P. ostreatus, P. pulmonarius и P. djamor, выделенные из плодовых тел, выращивали на агаризованной среде в чашке Петри (рисунок 1). В ходе радиального роста все штаммы сформировали колонии, характеризующиеся следующими признаками: форма округлая, цвет матово-белый, край ворсинчатый, профиль плоский, структура волокнистая, мицелий пушистый, с трудом отделяемый от субстрата, на поверхности колонии четко выражены радиальные кольца. Отличительной чертой поверхностной культуры P. djamor является то, что на свету выросший воздушный мицелий приобретает характерную розоватую окраску, что является дополнительным идентификационным признаком культуры вешенки розовой. Также отмечено интенсивное розовое окрашивание среды через 14 суток культивирования.
Мицелий P. pulmonarius (рисунок 2а) представляет собой систему разветвленных септированных гиф толщиной 2,0-3,0 мкм, на которых присутствуют одиночные пряжки, являющиеся одним из отличительных признаков базидиальных грибов.
Мицелий P. ostreatus (рисунок 2б) также представлен сильно разветвленными септированными гифами диаметром 2,0-3,0 мкм отличительной чертой является наличие многочисленных пряжек. На гифах вешенки устричной образуются шаровидные головчатые структуры, отсутствующие в поверхностной культуре P. pulmonarius, причем их количество возрастает с увеличением срока культивирования (21 сутки культивирования и более).
а - штамм P. pulmonarius;
б - штамм P ostreatus;
в - P djamor.
Рисунок 1 - Морфология видов рода Pleurotus при культивировании на агаризованной среде
Микроморфологические особенности воздушного мицелия штаммов рода Pleurotus приведены на рисунке 2.
а - штамм P pulmonarius; б - штамм P ostreatus;
Рисунок 2 - Микроморфология воздушного мицелия видов рода Pleurotus
в - P djamor.
Вегетативный мицелий P. djamor (рисунок 2б), как и мицелий P. ostreatus, состоит из тонкостенных, септированных и ветвящихся гиф с множественными пряжками. Диаметр генеративной гифы составляет 1,5-3,0 мкм, также отмечается образование немногочисленных мицелиальных тяжей. На мицелии зафиксировано
формирование шаровидных головчатых структур, что характерно для видов рода Pleurotus (рисунок 3). В ряде отечественных и зарубежных работ эти структуры называют бластоконидиями, псевдоконидиями или экскреторными конидиями [1,7]. Отмечают, что экскреторные конидии выделяют капли токсина, который оказывает подавляющее действие на бактерии, дрожжи и некоторые микроскопические грибы [7].
а - воздушный мицелий P. ostreatus; б - воздушный мицелий P. djamor.
рисунок 3 - Бластоконидии на воздушном мицелии P. ostreatus и P. djamor
Для мицелия всех анализируемых видов грибов характерно наличие гиф простого ветвления, между гифами наблюдается формирование единичных анастомозов, которые у высших базидиомицетов обеспечивают эффективный обмен и передвижение питательных веществ и ядер в мицелии.
Культуру, выращенную поверхностным способом, в дальнейшем использовали в качестве посевного материала для глубинного культивирования с предварительной стадией получения инокулята в колбах объемом 250 мл. В результате культивирования P. pulmonarius получена биомасса молочно-
В.В. Тарнопольская, Е.А. Мельникова: Сравнительная характеристика морфологии глубинной культуры ксилотрофных базидиомицетов.
белого цвета, состоящая из скопления многочисленных структур округлой формы, формирование которых зависело от степени и интенсивности перемешивания. Биомасса P. ostreatus представляет собой крупные агломераты округлой формы белого цвета с гладкой поверхностью. При глубинном культивировании P. djamor образовывались глобулы мицелия, из которых по мере роста культуры формировались плотные структуры округлой формы с гладкой поверхностью, на третьи сутки куль-
тивирования биомасса P. djamor приобретала бледно-розовую окраску.
Гифы глубинного мицелия изучаемых видов рода Pleurotus, также как и выращенного поверхностным способом, септированы (рисунок 4).
Мицелий Р. pulmonarius, полученный методом глубинного культивирования, характеризуется следующими микроморфологическими особенностями: гифы толщиной 3,0- 5,0 мкм, бесцветные, разветвленные, септиро-ванные, с многочисленными одиночными пряжками.
а - штамм Р. риШопапт; б - штамм Р. ostreatus; в - штамм Р. ф'атог.
Рисунок 4 - Микроморфология глубинного мицелия видов рода Р1еигоШв
Толщина гиф глубинного мицелия Р. ostreatus составляет 2,0-3,0 мкм, гифы разветвленные, септиро-ванные, в культуре отмечены многочисленные одиночные пряжки.
Гифы глубинного мицелия Р. djamor толщиной 3,0-5,0 мкм разветвлены, септированы, с многочисленными пряжками. Характерной отличительной чертой глубинного мицелия Р. ostreatus и Р. djamor (рисунок 4а и 4б) является образование многочисленных мицелиальных тяжей и очень плотное прилегание гиф друг к другу, образующих трехмерные концентрические петли по всему объему биомассы. Очевидно, формирование плотных глобул мицелия в питательной среде обусловлено таковым расположением гиф в пространстве.
Необходимо также отметить, что биомасса мицелия всех исследованных штаммов, полученная как в поверхностной, так и в глубинной культуре, обладает выраженным грибным запахом, а для Р. djamor характерно розоватое окрашивание.
выводы
В результате изучения морфологических особенностей штаммов трех видов ксилотрофных базидиомицетов рода РЬшои определен ряд макро-и микроморфологических признаков, пригодных для контроля чистоты штамма продуцента, разработки и ведения технологии глубинного культивирования мицелярной биомассы грибов вешенки устричной, вешенки легочной и вешенки розовой с целью получения комплекса биологически активных веществ.
Воздушный и глубинный мицелий всех трех штаммов характеризуется наличием септированных гиф простого ветвления с одиночными пряжками. К отличительным особенностям воздушного мицелия P ostreatus и P. djamor следует отнести образование бластоконидий, единичных мицелиальных тяжей и анастомозов.
В глубинном мицелии всех изученных штаммов по сравнению с воздушным мицелием отмечается увеличение толщины гиф и количества пряжек; при этом в глубинной культуре P. djamor и P.ostreatus формируют плотные трехмерные концентрические петли.
Культура P djamor выделяется розоватой окраской как воздушного, так и глубинного мицелия; этот ма-кроморфологический признак дает дополнительные преимущества при текущем визуальном определении чистоты культуры.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Биологические особенности лекарственных макро-мицетов в культуре: Сборник научных трудов в двух томах. Т.1/ Под ред. С. П. Вассера. - Киев: Альтерпрес, 2011. - 212 с. Соломко, Э. Ф. Сравнительный химический состав и питательная ценность мицелия съедобных грибов, выращенных глубинным методом / Э. Ф. Солом-ко // Производство высших съедобных грибов в СССР. - Киев: Наук. думка, 1978. - С. 98-104. Vamanu, E. Biological activities of the polysaccharides produced in submerged culture of two edible Pleurotus ostreatus mushrooms / E. Vamanu // Journal of
Biomedicine and Biotechnology. - Vol. 2012, article ID565979. - 8 p. Жизнь растений в шести томах. Т.2. Грибы / Под ред.
М.В. Горленко. - М.: Просвещение, 1976. - 479 с. Бухало, А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / А. С. Бухало. - Киев: Наук. думка, 1988. - 144 с.
Билай, В. И. Методы экспериментальной микологии
/ В. И. Билай. - Киев: Наук. думка, 1973. - 545 с. Микроморфологические особенности штаммов Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. и P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm., культивируемых отдельно и совместно с дрожжами / О. В. Камзолкина [и др.] // Цитология. -2006. - Т.48, Вып. 2. - С. 153-160.
Поступила в редакцию 22.04.14 Принята к печати 03.10.14
