CC BY
214
УДК 579.67 О.В. Киселева, П.В. Миронов, Ю.А. Литовка
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА LAETIPORUS SULPHUREUS В ПОВЕРХНОСТНОЙ И ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЕ
В статье представлены результаты изучения биологических особенностей сибирского штамма LS-11 laetiporus sulphureus (Bull) Bond. et Sing и оценки перспективы его глубинного культивирования в биотехнологических целях.
Ключевые слова: мицелий, базидиомицеты, серно-желтый трутовик, глубинное культивирование, белково-пищевая добавка.
O.V. Kiseleva, P.V. Mironov, Yu.A. Litovka
MORPHOLOGICAL PECULIARITIES OF THE BASIDIOMYCETE LAETIPORUS SULPHUREUS IN SURFACE AND SUBSURFACE CULTURE
The results of studying the biological peculiarities of the Siberian strain LS-11 laetiporus sulphureus (Bull) Bond. et Sing and the prospect estimations of its submerged cultivation in the biotechnological purposes are given in the article.
Key words: mycelium, basidiomycetes, sulfur-shelf mushroom, subsurface cultivation, protein food additive.
Введение. В последние годы значительно расширились исследования по возможности использования культур базидиальных грибов для получения различных биологически активных веществ. Отдельные разработки касаются получения биомассы съедобных грибов для пищевых и кормовых целей, а также использования глубинного мицелия в качестве посевного материала в промышленном грибоводстве и процессах биоконверсии растительных остатков [1-5, 7, 8]. Среди различных групп базидиомицетов значительное внимание уделяется дереворазрушающим грибам, которые сравнительно легко выделяются из природных источников в чистую культуру, характеризуются быстрым ростом, не требуют сложных питательных сред для культивирования и способны утилизировать трудногидролизуемые полимеры растительной ткани, в том числе отходы деревоперерабатывающей промышленности и сельскохозяйственного комплекса. Все это создает предпосылки для широкого использования культур дереворазрушающих грибов для получения белково-углеводных продуктов пищевого и кормового назначения.
Экспериментальное изучение высших базидиальных грибов стало возможным благодаря разработке доступных методов получения чистых культур. Оценку их биологии, физиологии и биохимии осуществляют с помощью методов, которые применяются для изучения грибов гифального типа строения из других таксономических групп.
Среди разнообразных аспектов искусственного выращивания мицелия базидиомицетов важным моментом является поддержание стабильной культуры и контроль ее чистоты в процессе культивирования. Одним из наиболее надежных идентификационных признаков является плодовое тело гриба-продуцента, однако его получение является трудоемким и длительным процессом. Поэтому при работе с культурами на стадии выращивания мицелия таксономическое значение приобретает комплекс признаков, включающий культуральные, морфологические и физиолого-биохимические характеристики [2].
Сведения, характеризующие особенности чистых культур серно-желтого трутовика, произрастающих на территории Сибири, практически отсутствуют. В связи с этим целью нашей работы является изучение некоторых биологических особенностей сибирского штамма LS-11 Laetiporus sulphureus (Bull.) Bond. et Sing и оценки перспективы его глубинного культивирования в биотехнологических целях. В задачи исследования входило изучение культурально-морфологических признаков штамма в поверхностной и глубинной культуре и выявление наиболее типичных морфологических характеристик, пригодных для контроля чистоты культуры на стадии получения мицелия.
Объекты и методы исследований. Объектом исследования служил штамм LS-11 Laetiporus sulphureus, выделенный из плодового тела серно-желтого трутовика, которое было обнаружено нами в широколистных лесах на юге Красноярского края (вблизи п. Ермаковское в 2010 г.). Систематическое положение изучаемого штамма: царство Fungi, отдел Basidiomycota, класс Basidiomycetes, порядок Aphyllophorales, семейство Polyporaceae, род Laetiporus, вид Laetiporus sulphureus [5].
Для изучения особенностей роста сибирского штамма LS-11 в различных биотехнологических системах осуществляли его культивирование в поверхностных и глубинных условиях. Поверхностное культивирование проводили на сусловом агаре при температуре 26±2 оС в течение 7 суток; глубинное культивирование - в биореакторе с механическим перемешиванием в стерильных условиях при температуре, близкой к температурному оптимуму (26±2 оС), при значении рН 5 в течение 48-72 ч. Через питательную среду барботи-ровали стерильный воздух при расходе 100 л/ч на 1 л среды.
С целью стандартизации посевов в качестве посевного инокулюма для поверхностного культивирования использовали агаровые блоки, вырезанные пробойным сверлом диаметром 8 мм из зоны роста семисуточной культуры музейного штамма. При глубинном культивировании посевным материалом служили агаровые блоки с мицелием, а также глубинная культура 1_ БирЬигеив; количество вносимого инокулюма составляло 2-5 % от выхода абсолютно сухого вещества.
Урожай биомассы определяли путем высушивания мицелия при 105 о С до постоянной массы и рассчитывали количество абсолютно сухого вещества (а.с.в.). Полученный мицелий использовали для дальнейших биохимических анализов [6]. Микроморфологические особенности 1_ вирЬигеиз изучали в препаратах «отпечаток», «раздавленная капля» и микрокамере, используя световые микроскопы марки Olimpus CX41, Olimpus SZX 12, с получением компьютерных изображений с помощью камеры №№п E 4500, а также с помощью электронно-растровой микроскопии (РЭМ-100У).
Результаты и их обсуждение. После выделения мицелиальной культуры из плодового тела или ба-зидиоспор необходимо убедиться, что это действительно культура предполагаемого гриба; при этом вероятность ошибки меньше, если штамм получен путем проращивания базидиоспор, поскольку процесс прорастания можно контролировать визуально под микроскопом.
Мицелиальная культура, полученная из плодового тела, состоит из диплоидного мицелия с характерными пряжками, наличие которых служит несомненным доказательством принадлежности гриба к высшим базидиомицетам. Однако пряжки могут отсутствовать у некоторых представителей этой систематической группы, в том числе С. вирЬигеив.
Кроме пряжек имеется целый ряд микроскопических признаков, характерных для базидиомицетов, но встречающихся и у грибов из других систематических групп. Это анастомозы, медальоны, вздутия, тяжи, ризо-морфы, инкрустированные гифы и др. При идентификации культур эти признаки должны приниматься во внимание в совокупности со всеми морфолого-культуральными особенностями данного вида в условиях искусственной культуры. Кроме того, многие высшие базидиомицеты при лабораторном культивировании образуют бесполые спороношения - конидии, оидии, хламидоспоры. Важным признаком для характеристики вида является скорость и характер роста на различных средах, окраска мицелия и субстрата, выделение экссудата, запах [2].
Проведенные нами исследования макроморфологических признаков штамма LS-11 С. вирЬигеиз показали, что для культуры на твердых питательных средах характерно образование колонии с ватообразным воздушным мицелием, отдельные гифы которого беспорядочно переплетаются. Высота мицелия в среднем составляет 3-5 мм, в некоторых случаях формируются гифальные пучки, приподнимающиеся над поверхностью субстратного мицелия, из-за чего колония выглядит хлопьевидной. Мицелий в процессе роста приобретает характерную желто-оранжевую окраску, которая является дополнительным идентификационным признаком; характерный грибной запах и экссудат отсутствуют. С возрастом воздушный мицелий оседает на поверхность среды, вследствие чего колония приобретает войлочный вид.
Микроскопические исследования показали, что мицелий в поверхностной культуре состоит из длинных септированных гиф с простыми ветвлениями без образования мицелиальных пряжек, характерных для большинства базидиомицетов (рис.1). Установлено, что воздушный и глубинный мицелий различались по ширине гиф: пределы варьирования данного показателя составили 1,0-8,5 и 4,8-11,2 мм соответственно.
СибГТУ* ОИтрыв СХ41* - 40 мкм
Рис. 1. Оптическая микрофотография штамма 18-11 СэеНрогив вирЬигеив в поверхностной культуре
Отличительной чертой исследуемого штамма являлось образование овальных, шарообразных и грушевидных структур, расположенных на гифах терминально или интеркалярно. Анализ экспериментальных и литературных данных позволяет предположить, что шарообразные структуры воздушного мицелия являются бластоконидиями, а грушевидные структуры субстратного мицелия - хламидоспорами. Оба указанных типа бесполого спороношения описаны у данного вида отечественными и зарубежными учеными [4, 8, 9].
Для получения биомассы, продуктов метаболизма и проведения различных физиологических исследований базидиомицеты культивируют на жидких питательных средах поверхностно или глубинно, как и другие мицелиальные грибы. При глубинном культивировании, как правило, происходит более быстрое накопление биомассы, однако, некоторые базидиомицеты, особенно микоризообразующие, растут только поверхностно [2]. В поверхностной культуре базидиомицеты образуют мицелиальную пленку; в погруженной культуре растут в виде мицелиальных шариков различного размера или дисперсного мицелия. Характер роста в значительной мере зависит от количества посевного мицелия, степени его измельчения и состава питательной среды.
Исследование морфологических особенностей штамма ЬБ-11 1.вирЬигвив в барботируемой глубинной культуре при отсутствии механического перемешивания показало наличие четко фрагментированных отдельно расположенных структур с плотным центром и бахромчатым краем за счет периферических мице-лиальных образований (рис. 2).
Рис. 2. Оптическая микрофотография штамма 18-11 1авИрогив вирЬигвив в глубинной культуре (а - глобулы с плотным центром и периферическим мицелием; б - биомасса после культивирования)
В условиях дополнительного механического перемешивания в биореакторе мицелий серно-желтого трутовика фрагментируется на относительно небольшие сегменты, которые не утрачивают способности к росту и накоплению биомассы. Кроме того, на электронных микрофотографиях, полученных с помощью растрового электронного микроскопа (рис. 3), видно, что в культуре накапливается значительное количество спорового материала.
Рис. 3. РЭМ-микрофотография спорового материала 18-111авИрогив вирЬигвив
На рисунке 4 хорошо видны шаровидные и грушевидные образования, которые являются бластоконидиями и хламидоспорами соответственно. Следует отметить, что на оптической микрофотографии размеры спор существенно больше, чем на электронных микрофотографиях. Это связано с тем, что образцы для РЭМ предварительно высушивают. Этим же объясняется и «вогнутая» форма спор при большом увеличении на РЭМ - микрофотографии.
СибГТУ* ОИтрыв СХ41* - 40мкм
Рис. 4. Оптическая микрофотография штамма 18-11-авИрогив вирЬигвив в глубинной культуре (А - шаровидные и грушевидные образования)
Таким образом, при глубинном культивировании штамма 1_Э-11 была установлена его морфологическая гетерогенность. Микроскопические исследования показали, что и в глубинных условиях мицелий способен образовывать толстостенные хламидоспоры. В культуральной жидкости присутствовали различные морфологические структуры - колонии (гранулы) с плотным центром и периферическим мицелием, неправильные глобулы, шаровидные и грушевидные образования, нитевидные фрагменты. Все они способны к дальнейшему росту и могут служить в качестве посевного инокулюма.
Проведенные исследования и анализ литературных данных позволяют рекомендовать в качестве основных морфологических критериев для оценки чистоты культуры и экспресс-идентификации представителей вида - вирЬигвив следующие признаки: желто-оранжевый цвет мицелия, отсутствие характерных пряжек на гифах и ярко выраженного грибного запаха, образование в культуре грушевидных и шаровидных бластоконидий и хламидоспор, быстрая фрагментация мицелия при глубинном культивировании и наличие в культуральной жидкости различных морфологических структур с преобладанием мелких фрагментов и их агрегатов.
Литература
1. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре / А.С. Бухало [и др.]. - Киев: Наук. думка, 1983. - 312 с.
2. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии - Киев: Наук. думка, 1984. - 545 с.
3. Билай В.И. Основы общей микологии. - Киев: Выш. шк., 1964. - 396 с.
4. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - Киев: Наук. думка, 1988. - 144 с.
5. Гарибова Л.В. Основы микологии (морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов). -
М.: Клышников - Комаров и К*, 2005. - 220 с.
6. Киселева О.В., Миронов П.В. Получение биомассы мицелия грибов вешенки обыкновенной Р1еиго1ив оstreatus и серно-желтого трутовика 1_Э-11 -авИрогив вирЬигвив в глубинных условиях // Хвойные бо-реальные зоны. - Т. XXVI. - №2. - Красноярск, 2009. - С. 294-296.
7. Рипачек В. Биология дереворазрушающих грибов. - М.: Лесн. пром-сть, 1967. - 267 с.
8. Соломко Э.Ф. Области применения культур высших базидиомицетов в биотехнологии. Производство съедобных грибов в СССР. - Киев: Наук. думка, 1985. - С. 15-17.
9. Суворов П.А. Биология серно-желтого трутовика Laetiporus sulphureus (Bull.) Bond. et Sing // Бюл. Моск.
общ. испыт. природы. Отделение биологии. - 1963. - Вып. 5. - С. 65-73.
10. Mandels M., Weber J. The production of cellolases. Adv.chem. - 1969. - V. 95. - № 2. - Р. 391.
---------♦------------
УДК 581.5, 581.9 И.В. Горбунов
ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОИЗРАСТАНИЯ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ
(ВОСТОЧНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ)
Исследовано четыре популяции Pinus sibirica Du Tour. - сосны кедровой сибирской в Восточном Забайкалье на примере бассейна реки Ингода. Проведено описание фитоценозов с участием P. sibirica. Выявлены экологические и географические особенности местообитаний популяций кедра.
Ключевые слова: сосна кедровая сибирская, популяция, фитоценоз, местообитание, флористический состав, экологическая и географическая характеристика, Восточное Забайкалье.
I.V. Gorbunov
EKOLOGICAL AND GEOGRAPHICAL PECULIARITIES OF THE SIBERIAN CEDAR PINE GROWTH (EASTERN TRANSBAIKALIA)
Four populations of Pinus sibirica Du Tour. which is Siberian cedar pines in Eastern Transbaikalia are researched on the example of the Ingoda river basin. Phytocenosis description with P. sibirica participation is conducted. Ecological and geographical peculiarities of cedar population habitats are revealed.
Key words: Siberian cedar pine, population, phytocenosis, habitat, floristic structure, ecological and geographical characteristics, Eastern Transbaikalia.
Введение. Сибирский кедр (правильное ботаническое название - сосна кедровая сибирская - Pinus sibirica Du Tour.) можно по праву считать российским национальным деревом, так как растет оно в естественном состоянии почти исключительно в нашей стране. Общая площадь насаждений с преобладанием кедра составляет более 35 млн га. Произрастают они в основном на территории Сибири, Урала, Алтайского края и северо-востока европейской части России.
Предполагают, что первое знакомство русских с кедрами Сибири состоялось еще в XI веке. Кедровые леса привлекали внимание путешественников и исследователей по двум основным причинам. Во-первых, это единственное местообитание соболей, которые долгое время в Древней Руси заменяли даже денежные знаки. Во-вторых, путешественников привлекали вкусные целебные орехи, ядра которых наполнены ценным кедровым маслом.
Сибирский кедр - это дерево-фармацевт. Многие полезные свойства, как самого дерева, так и кедровой тайги, издавна используются человеком в лечебных целях. Орехи, смолу и хвою кедра можно превращать в чудодейственные средства.
Главное достоинство кедра - это его семена (орехи), высококалорийные, целебные и питательные. Ядра орехов содержат 63,9% высококачественного масла, 17,2% белка. В состав белков входит 14 аминокислот, из них 70% - незаменимых, что указывает на высокую их биологическую активность. С давних пор в Сибири и на Урале из ядер кедровых орехов извлекали масло. Оно значительно превосходит лучшие сорта прованского масла, получаемого из маслины.
