CC BY
49
УДК 615.322
Е. В. Красюк (асп.)1, К. А. Пупыкина (д.фарм.н., проф.)1, И. Е. Анищенко (к.б.н., с.н.с.)2
ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ВИДОВ МОНАРДЫ, ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН
1 Башкирский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел. 8(347) 2712285, e-mail:[email protected] 2Ботанический сад-институт УНЦ РАН лаборатория дикорастущей флоры и интродукции травянистых растений г. Уфа, 450080, ул. Полярная, 8; тел.8(347)2281355
E. V. Krasyuk1, K. A. Pupykina1, I. E. Anischenko2
THE FEATURE PHENOL COMPOUNDS TYPE MONARDAE INTRODUCTION IN THE REPUBLIC BASHKORTOSTAN
1 Bashkir State Medical University 3, Lenina Str, 450000, Ufa, Russia; ph. 8(347)2724173, e-mail:[email protected] 2The Botanical Garden-Institute of the USC of the RAS 8, Polyarnaya Str., 450080, Ufa, Russia; ph.8(347)2281355
Представлены результаты по качественной оценке, идентификации и количественному определению фенольных соединений, содержащихся в пяти видах монарды, интродуцирован-ных в Республике Башкортостан: монарда трубчатая, монарда двойчатая, монарда гибридная, монарда лимонная, монарда Рассела. Методом хроматографии в тонком слое сорбента проведено изучение качественного состава фе-нольных соединений и установлено присутствие следующих веществ — лютеолин, нарингенин, лютеолин-7-гликозид, рутин, гиперозид, галловая кислота, катехин и хлорогеновая кислота. С использованием метода денситометрии произведена обработка пятен на хроматограмме, перевод их в форму хроматографических пиков, рассчитаны значения Rf, площадь и высота пиков. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществлено подтверждение качественного состава фенольного комплекса, определено количественное содержание исследуемых веществ в смеси и установлено, что результаты их количественного определения коррелируют с данными, полученными методом денситометрии.
Ключевые слова: качественная характеристика; количественное содержание; монарда трубчатая; монарда двойчатая; монарда гибридная; монарда лимонная; монарда Рассела; феноль-ные соединения.
Дата поступления 23.07.15
In article information on qualitative estimation, identifications and quantitative determination of phenol compounds contained in five types Monarda introdaction in the Republic Bashkortostan: Monarda fistulosa, Monarda didyma, Monarda hybrida, Monarda citriodora, Monarda Rassela are described. The study of the qualitative composition of phenol compounds is made by the method of chromatography in fine layer of the sorbent (the plates «Sorbfil PTSH-P-A-UV» size 20x20 cm, as rolling phase mixture solvents: ethylacetate— glasial acetic acid—water (5:1:1)) and it is installed presence of following substances: lyuteolin, naringenin, lyuteolin-7-glycozid, rutin, giperozid, gallic acidi, catehin and chlorogenic acid. Using the method of densitometry produced treatment spots on the chromatogram, translating them into the shape of chromatographic peaks, the calculated Rf values, area and peak height. Confirmation of the qualitative composition of phenolic complex is carried out using the method of high performance liquid chromatography, the quantitative determination of substances in a mixture and found that the results of quantification are correlated with the data obtained by densitometry, i.e. spots with brighter luminescence intensity and contain a greater number of substances, and vice versa, less intensely luminous spots on the chromatograms contain them in smaller quantities.
Key words: Monarda fistulosa; Monarda didyma; Monarda hybrid; Monarda citriodora; Monarda Rassela; phenol compounds; the qualitative feature; the quantitative contents.
В современную эпоху мощных антропогенных воздействий на природные экосистемы интродукция растений стала одним из действенных путей рационального использования, воспроизводства и охраны природных растительных ресурсов, в том числе лекарственных, ценных для практического использования. В последние годы возрос интерес к проблеме интродукции пряно-ароматических и эфирномасличных растений, так как они содержат богатый набор биологически активных веществ, обеспечивающих организм человека необходимыми витаминами, пектиновыми веществами, макро- и микроэлементами. Повышенный радиоактивный фон во многих регионах России является одной из острейших экологических проблем нашей страны. Наиболее приемлемым способом радиозащиты является включение в рацион пряно-ароматических и эфирномасличных растений, которые способны уменьшить отрицательное воздействие радиации 2'4. Перспективным в плане изучения являются растения рода Моnаrda.
Монарда — эфиромасличное, травянистое растение семейства губоцветных (Lamiaceae). Родина ее — Северная Америка и Мексика, где монарда распространена местами очень широко, словно сорняк. Растения рода монарда содержат разнообразные ценные биологически активные вещества: эфирные масла, каротино-иды, витамины В!, В2, аскорбиновую кислоту, флавоноиды, антоцианы, горечи, дубильные вещества, которые обусловливают различные лекарственные свойства растения. Монарда занимает одно из первых мест среди растений по своим бактерицидным свойствам, является перспективным эфиромасличным растением, так как обладает также противовоспалительными, антибиотическими, антигельминтными, иммуномодулирующими свойствами. Бактерицидную активность растения связывают с содержанием большого количества тимола и кар-вакрола в эфирном масле. Монарда издавна используется как душистая и полезная пряность, улучшающая пищеварение 3. В Республике Башкортостан род Монарда представлен как культивируемое растение.
Целью настоящей работы является изучение фенольных соединений различных видов монарды, интродуцированных в Республике Башкортостан.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили образцы сырья пяти видов монарды, выращенных в Ботаническом саду-институте Уфимского научного центра РАН: монарда трубчатая (Monarda fistulosa), монарда двойчатая (Monarda didyma), монарда гибридная (Monarda hy brida), монарда лимонная (Monarda citriodora), монарда Рассела (Monarda Rassela).
Пробоподготовка сырья проводилась следующим образом: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 2 мм. Около 0.50 г (точная навеска) высушенного сырья монарды помещали в колбу вместимостью 100 мл, приливали 20 мл 70% этилового спирта, закрывали колбу пробкой, взвешивали с точностью до 0.01 г, перемешивали 5 мин и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч при периодическом помешивании. После охлаждения смесь перемешивали, колбу закрывали пробкой и взвешивали. Потерю в массе доводили до исходной растворителем. Давали отстояться в течение 10 мин, а затем декантировали жидкость через бумажный складчатый фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили соответствующим растворителем до метки.
Изучение качественного состава феноль-ных соединений проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента (пластинки «Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ» размером 20x20 см, в качестве подвижной фазы смесь растворителей: этилацетат—ледяная уксусная кислота-вода (5:1:1). В качестве растворов сравнения использовали 0.05% растворы стандартных образцов рутина, кверцетина, лютеолина, лютео-лин-7-гликозида, гиперозида, нарингенина, кем-пферола, галловой кислоты, катехина в 70%-ном растворе этилового спирта.
На линию старта хроматографической пластинки, предварительно активированной в течение 30 мин при температуре 105 оС, микрошприцем наносили по 5 мкл подготовленного извлечения и 5 мкл 0.05% растворов стандартных образцов веществ. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе, затем помещали в предварительно насыщенную камеру, и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил 10 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе 5 мин. Затем ее просматривали в УФ-свете при длине волны 245 и 365 нм до и после обработки хромогенными реактивами.
Пластинки проявляли 5%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия и наблюдали изменение окраски пятен. Результаты исследования водно-спиртовых извлечений видов монарды методом ТСХ представлены на рис. 1.
образцах проводили по площади пиков. Расчет фенольных соединений проводили по формуле:
lis*
lllkft
R/~0.96 R/-0.94 Rj~0.91-0.92
Rf ~0.80-0.83 Rf ~0.72-0.74 Rf ~0.60-0.62 Rf ~0.48 Rf~0.37-0.41
X =
mCT ■ S ■ 25-100-100 SCT ■ m■V1 ■ (100-W)
где
Рис. 1. Хроматограмма фенольньх соединений видов монарды: 1 — монарда трубчатая; 2 — монарда двойчатая; 3 — монарда гибридная; 4 — монарда лимонная; 5 — монарда Рассела.
Для обработки хроматографических данных использовали метод денситометрии. Сканирование проводили с использование денситометра «Сорбфил».
Идентификацию фенольных соединений осуществляли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и последующей компьютерной обработкои результатов исследования с помощью программы Мультихром для Windows 1 на хроматографе «Gilson», модель 305, металлическая колонка размером 4.6x250 мм, неподвижная фаза Kromasil C18, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза метанол—вода—концентрированная фосфорная кислота в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0.8 мл/мин. Продолжительность анализа 70 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. Объем пробы — 20 мкл. Перед вводом в хроматограф извлечение фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.25 мкм.
Параллельно готовили серию 0.05% растворов сравнения: апигенина, рутина, кверце-тина, кемпферола, лютеолин-7-глюкозида; ка-техина; кумаровой, галловой, хлорогеновой, неохлорогеновой, кислот с чистотой более 95%.
Оценку количественного соотношения идентифицированных веществ в исследуемых
тст. — масса стандарта в граммах; 5ст — площадь пика стандарта; т — масса сырья в граммах; 5 — площадь пика исследуемого образца; У1 — объем пробы введенную в колонку.
Результаты и их обсуждение
Анализируя полученные результаты, можно отметить, что на ТС хроматограмме в исследуемых растворах пяти видов монарды обнаружено 9 зон адсорбции: зоны, окрашенные в желто-коричневый цвет — с Rf ~ 0.96 (лютео-лин), Rf ~ 0.80—0.83 (нарингенин), Rf ~ 0.72— 0.74 (лютеолин-7-гликозид), Rf ~ 0.60—0.62 (гиперозид), Rf ~ 0.37—0.41 (рутин); зоны, окрашенные в черный цвет с Rf ~ 0.91—0.92 (галловая кислота), темно-серый с Rf ~ 0.94 (кате-хин); зона, окрашенная в голубой цвет - с Rf ~ 0.48 (хлорогеновая кислота) и зона с Rf ~ 0.57 неидентифицирована (рис. 1). Сравнение значений Rf зон адсорбции в анализируемых растворах с таковыми у свидетелей стандартных образцов фенольных соединений позволяют идентифицировать следующие вещества — лю-теолин, нарингенин, лютеолин-7-гликозид, рутин, гиперозид, галловую кислоту, катехин и хлорогеновую кислоту.
Полученные изображения на хроматог-рамме исследовали методом денситометрии, использующемся для качественной и количественной оценки исследуемых веществ (рис. 2, 3).
Программа обработки хроматографичес-ких данных позволяет вводить изображения хроматограмм в денситометр и компьютер, сохранять их с высоким качеством и разрешением; производить автоматический или ручной поиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографических пиков, рассчитывать значения Rf, площади и высоту пиков. Результаты исследования представлены в табл. 1.
Анализируя денситограммы (рис. 2,3) и результаты табл. 1, в соотношении со свидетелями, можно отметить, что во всех видах монарды содержатся флавоноиды — лютеолин, нарингенин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, рутин, но в монарде лимонной и Рассела гипе-розид присутствует в меньшем количестве, также по интесивности пятен можно судить, что в монарде гибридной и лимонной неболь-
5 5005 0004 5004 0003 500£ 3 000-о о
1* 2 5002 0001 500-
|-Трек 1 -Трек 2-Трек 3-Трек 4-Трек 5-Трек 6 |
Рис. 2. Денситограмма различных видов монарды в соотношении со свидетелями флавоноидов
|-Трек 1 -Трек 2-Трек 3-Трек 4-Трек 5-Трек 6-Трек 7 |
1 000- -ч-:
Рис. 3. Денситограмма различных видов монарды в соотношении со свидетелями фенолкарбоновых и окси-коричных кислот
шое содержание рутина. Кроме того, в монарде лимонной и Рассела меньшее содержание катехина, галловой и хлорогеновой кислот.
Для достоверного подтверждения качественного состава фенольного комплекса, содержащегося в видах монарды, применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Идентификацию фенольных соединений проводили путем сопоставления времен удер-
живания компонентов смеси и растворов сравнения. Результаты исследования представлены в табл. 2. Анализируя полученные данные, следует отметить, что они коррелируют с результатами, полученными методом денсито-метрии, т.е. пятна, имеющие более яркую интенсивность свечения содержат и большее количество исследуемых веществ, и наоборот, менее интенсивно светящиеся пятна на хрома-тограммах содержат меньшее количество веществ.
Таблица 1
Показатели Rf свидетелей и исследуемых растворов
Образцы Пики и значения Rf
1 2 3 4 5 6 7 8
М.трубчатая 0.41 0.48 0.62 0.74 0.82 0.91 0.94 0.96
М.двойчатая 0.41 0.48 0.62 0.72 0.80 0.92 0,94 0.96
М.гибридная 0.37* 0.48 0.62 0.72 0.80 0.92 0,94 0.96
М.лимонная 0.37* 0.48* 0.60* 0.73 0.83 0.91* 0.94* 0.96
М.Рассела 0.40 0.48 0.61* 0.72 0.80 0.92* 0.94* 0.96
Свидетели стандартных образцов
Лютеолин 0.96
Катехин 0.94
Галловая кислота 0.92
Нарингенин 0.80-0.84
Люте олин-7-гликозид 0.72-0.75
Гиперозид 0.61-0.62
Хлорогеновая кислота 0.48
Рутин 0.37-0.41
Примечание: * — слабая интенсивность свечения пятна
Таблица 2
Идентифицированные методом ВЭЖХ соединения монарды
№ Идентифицированные соединения Виды монарды и концентрация вещества, %
трубчатая двойчатая гибридная лимонная Рассела
1 Лютеолин 0.698 0.704 0.506 0.430 0.375
2 Катехин 0.345 0.256 0.312 0.102 0.138
3 Галловая кислота 0.670 0.459 0.726 0.243 0.148
4 Нарингенин 0.547 0.481 0.528 0.289 0.216
5 Лютеолин-7-гликозид 1.137 0.989 0.715 1.430 0.982
6 Гиперозид 0.345 0.284 0.322 0,137 0.165
7 Хлорогеновая кислота 0.256 0.224 0.287 0.089 0.123
8 Рутин 0.286 0.387 0.088 0,113 0.392
Таким образом, проведена качественная и количественная оценка содержания феноль-ных соединений в видах монарды, интродуци-рованных в Республике Башкортостан, при
Литература
1. Беликов В.В. Применение ВЭЖХ в анализе флавоноидных препаратов // Проблемы стандартизации и контроля качества лек. средств.-1991.- Т.2, Ч.2.— С.14-15.
2. Никитина Т.И. Лекарственные растения. Применение. Противопоказания. Сборы.- Уфа, 2000.- 234 с.
3. Определитель высших растений Башкирской АССР: сем. Brassicaceae-Asteraceae / АН СССР, Урал. отд-ние, Башк. науч. центр, Ин-т биологии; [Ю. Е. Алексеев и др.]; отв. ред. Е. В. Кучеров, А. А. Мулдашев.- М.: Наука, 1989.- 374 с.
4. Battistutta F., Condido E., Ciola L., Giomo A., Comi G., Cjnte L., Zironi R. Valutazione delle attivita antiossidanti ed antimicrobiche degli oil esserziali di Salvia officinalis e di Thymus vulgaris. // Coltivazione e miglioramento di piante officinale. Trento, 1996. P. 481-486
этом обнаружены и количественно определены флавоноиды — лютеолин, нарингенин, лютео-лин-7-гликозид, рутин, гиперозид, а также ка-техин, галловая и хлорогеновая кислоты.
References
1. Belikov V.V. Primenenie VEZhKH v analize fla-vonoidnykh preparatov. [Application of HPLC analysis of flavonoid preparations]. Problemy standartizatsii i kontrolya kachestva lekarstven-nykh sredstv [Problems to standardizations and checking quality of herbal remedies], 1991, v.2, p.2, pp.14-15.
2. Nikitina T.I. Lekarstvennye rasteniya. Primenenie. Protivopokazaniya. Sbory. [The Medicinal plants. Application. Contraindications. Species.]. Ufa, 2000.- 234 p.
3. Opredelitel' vysshikh rastenii Bashkirskoi ASSR: sem. Brassicaceae—Asteraceae [The Finder of the high plants Bashkir ASSR: set. Brassicaceae—Asteraceae]. Moscow, Nauka Publ., 1989, 374 p.
4. Battistutta F., Condido E., Ciola L., Giomo A., Comi G., Cjnte L., Zironi R. [Valutazione delle attivita antiossidanti ed antimicrobiche degli oil esserziali di Salvia officinalis e di Thymus vulgaris]. Coltivazione e miglioramento di piante officinale. Trento, 1996, p. 481-486.
