CC BY
17
КЛ1Н1ЧНА ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА
йО! 10.29254/2077-4214-2018-1-1-142-103-108 УДК 612.822.014.1:577.112
Беленичев И. Ф., Литвиненко Е. С., Камышный А. М.
ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ мРНК И!Р-1а И И!Р-3а, УРОВЕНЬ НИТРОТИРОЗИНА, цГМФ И ИНТЕРЛЕЙКИНОВ В ГОМОГЕНАТЕ МОЗГА МОНГОЛЬСКИХ ПЕСЧАНОК С ОСТРЫМ НАРУШЕНИЕМ МОЗГОВОГО КРОВОТОКА И НА ФОНЕ ПРОВОДИМОЙ ТЕРАПИИ МОДУЛЯТОРАМИ
СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА
Запорожский государственный медицинский университет (г. Запорожье)
Связь публикации с плановыми научно-исследовательскими работами. Данная работа выполнена в рамках кафедральной НИР «HSP70 / HIF- 1a- опосередкован мехаызми ендогенно'| не-йропротекци: розробка пiдходiв до ÏÏ фармаколо-пчно'| регуляци», № государственной регистрации 0117U000658.
Вступление. Высокий риск смертности и ин-валидизации в последствие острой церебральной ишемии диктует необходимость поиска новых подходов фармакологической коррекции данной патологии [1,2]. Поиск эффективных нейропротекторов на сегодня идет по двум направлениям: первое это повышение устойчивости нервной ткани к условиям гипоксии и второе ограничение интенсивности ок-сидативного и нитрозативного стресса, снижение местной воспалительной реакции и последствий ишемии/гипоксии тканей [1].
В свете проблемы гипоксии при церебральных патологиях головного мозга, большое значение уделяется регуляторным белкам, которые индуцируются в ответ на гипоксию - белкам семейства HIFs. Данные белки играют ведущую роль в системном ответе организма на снижение кислорода и синтезируются в большинстве тканей, а максимальная их экспрессия отмечена в нейронах [9-13,15].
Гипоксия является фактором, при котором клетки переходят на нитратно-нитритное дыхание с образованием NO. Оксид азота в условиях оксидатив-ного стресса в нервной ткани образует токсичные активные дериваты пероксинитрит (ONOO-), ион нитрозония (NO+), нитроксил (NO-) и диазоттриок-сид (N2O3), которые являются главными факторами нитрозирующего стресса при ишемии. При фокальной форме ишемии к 3-4 суткам гиперпродукция токсичных форм азота в условиях сохраняющегося оксидативного стресса является результатом действия индуцибелной NOS, которая интенсивно продуцируется активированными глиальными клетками и клетками воспаления при участии провоспали-тельных цитокинов (TNF-a, IL-1 в) [6].
Факторы HIF- 1а и HIF-За, которые участвуют в формировании основы долговременной адаптации к гипоксии, а также регуляция гиперпродукции активных форм азота (АФА) и активности NOS являются перспективными мишенями для разработки стратегии лечения острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), в генезе которых ведущую роль играет гипоксия. В литературе имеются убедительные данные положительного действия индукторов HIF-1 а и ингибиторов NOS по ограничению прогрессирования ишемии мозга [9].
Цель исследования. Изучить характер экспрессии мРНК HIF-1 а и HIF-За, уровень цитокинов (IL-4, IL-1 в, TNF-а), нитротирозина и цГМФ в гомо-генате мозга монгольских песчанок с экспериментальной ОНМК на фоне курсового лечения модуляторами системы глутатиона-селеназы, глутоксима и глуторедоксина.
Объект и методы исследования. Экспериментальная часть выполнена на 60 самцах монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) массой 60-80 г. Животные содержались на стандартном рационе питания и питья с 12 часовым циклом смены света/темноты на протяжении всего эксперимента. Исследования на животных проводились в соответствии с Директивой Европейского Союза 2010/10/63 EU. Экспериментальные группы формировали по 10 особей одинакового веса в группе. Согласно с программой исследования, использовали общепринятую в данное время модель экспериментального острого нарушения мозгового кровообращения - необратимую одностороннюю перевязку общей сонной артерии. Операцию выполняли под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), путём хирургического доступа выделяли общую сонную артерию, подводили под нее шелковую лигатуру и перевязывали. Для изучения действия препаратов животным вводили селеназу (ArzneimittelGmbH, Germany) - 50 мкг/кг, глутоксим (ФАРМА-ВАМ, Москва) - 50 мг/кг и глутаредоксин (Sigma, Aldrich) - 200 мкл/кг в течение всего срока наблюдения (4 суток). Препараты вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки. Животным
контрольной группы на протяжении эксперимента внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Животным группы сравнения по той же схеме вводили пирацетам в дозе 500 мг/кг. В качестве интактной группы использовали ложнооперированных (ЛО) животных, которым выделяли сонную артерию, но не перевязывали. По окончании эксперимента согласно протоколу исследования, животных наркотизировали тиопен-талом натрия (40 мг/кг), декапитировали, вскрывали черепную коробку и извлекали головной мозг
Исследование биохимических маркеров проводили в гомогенате головного мозга. Мозг промывали в 0,25 М сахарозном буфере (рН 7,4) охлажденном до 20C и измельчали в 10 кратном объеме этого же буфера, используя гомогенизатор Silent Crusher S (Heidolph). Грубую часть гомогената удаляли путем центрифугирования при 40С на центрифуге Eppendorf-5804R при 3000 об/мин в течение 20 мин. Содержание нитротирозина, цГМФ, IL-4, IL-1 в, TNF-a определяли с помощью твердофазного им-муноферментного анализа методом ELISA с использованием тест-наборов («HyCult biotechnology», «e-Bioscience» и «ENZO») в соответствии с прилагаемыми к наборам инструкциями.
Полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов использовали амплификатор CFX96™Real-Time PCR Detection Systems («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) и набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green R-402 («Синтол», Россия). Финальная реакция смеси для
амплификации включала краситель SYBR Green, ДНК - полимеразу SynTaq с игибирующими активность фермента антителами, по 0,2 мкл прямого и обратного специфических праймеров, dNTP- дезок-синуклеозидтрифосфаты, 1 мкл матрицы (кДНК). Реакционную смесь доводили до общего объема 25 мкл добавлением деионизированной Н2О. Специфические пары праймеров (5'-3') для анализа исследуемых и референс генов были подобраны с помощью программного обеспечения PrimerBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и изготовлены фирмой ThermoScientific, США. Амплификация происходила при таких условиях: инициированная денатурация 95°C - 10 мин.; далее 50 циклов: денатурация - 95°С, 15 сек., отжиг праймеров - 58-63°С, 30 сек., эллонгация -72°С, 30 сек. Регистрация интенсивности флуоресценции происходила автоматически в конце стадии эллонгации каждого цикла по каналу автоматически SybrGreen. В качестве референс-гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии исследуемых генов был использован ген actin, beta (Actb). Нормальность распределения оценивали по критериям Колмогорова-Смирнова (D) и Shapiro-Wilk (W). Полученные данные были проанализированы вариационно-статистическим методом с использованием критерия U-параметра Манна-Уитни. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA® for Windows 6.0» (StatSoft Inc., № AXXR712D833214FAN5). Все результаты представлены в виде M ± m, где М - среднее значение, m - ошибка среднего, для всех видов анализа статистически значимыми считали различия при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Анализ экспрессии мРНК HIF-1 а и HIF-3a у животных с ОНМК представлен в таблицах 1 и 2. Показатели экспрессии мРНК HIF-1 а в группах, получавших исследуемые препараты, имеют относительно контроля более высокие цифровые значения, чем соответствующие значения по отношению к ЛО группе. Характер экспрессии мРНК HIF-3a в экспериментальных группах получавших модуляторы ТДС, имеет обратную зависимость - более низкое значение по отношению к контролю и более высокое значение в отношении ЛО, что может объясняться экспрессией данной изоформы в более раннем ги-поксическом периоде.
Наглядно видно из рисунка 1, что курсовое назначение исследуемых препаратов в течение 4 суток после модельной ОНМК, приводит к достоверному повышению экспрессии HIF-1a, лидирует
Таблица 1.
Показатели экспрессии мРНК HIF-1 а в гомогенате мозга монгольских песчанок с ОНМК и на фоне лечения (M±m, п=10)
Группа животных Экспрессии мРНК HIF-1a, у.е.
По отношению к ЛО По отношению к контролю
Ложно-оперированные 1.00000±0.32381
ОНМК 1.00000±0.21165
ОНМК+селеназа 0.88749 ±0.06702 20.36108±1.03035*
ОНМК+глутоксим 1.56550±1.27181 37.89533 ±7.18197*
ОНМК+глутаредоксин 0.70213±0.13905 15.74745±3.05498*
ОНМК+пирацетам 0.73577±0.30162 17.07044±4.36168*
Примечание. * - отличия достоверны (р<0,05) по отношению к группе контроля.
Таблица 2.
Показатели экспрессии мРНК HIF-3a в гомогенате мозга монгольских песчанок с ОНМК и на фоне лечения (M±m, п=10)
Группа животных Экспрессии мРНК HIF^a^
По отношению к ЛО По отношению к контролю
Ложно-оперированные 1.00000±0.23806
ОНМК 1.00000±0.08766
ОНМК+селеназа 0.08465±0.04886 0.12623 ±0.07283
ОНМК+глутоксим 1.78905±0.17758 2.66670±0.26479
ОНМК+глутаредоксин 6.05445±1.84938* 9.02424±2.68003
ОНМК+пирацетам 1.10734±0.08257 1.65044±0.12303
Примечание. * - отличия достоверны (р<0,05) по отношению к группе контроля.
Рис. 1. Экспрессия мРНК HIF-1a. Рис. 2. Экспрессия мРНК HIF-3a.
1-селеназа; 2-глутоксим; 3-глутаредоксин; 4-пирацетам, с-контроль.
в этом ряду глутоксим (в 37 раз выше контрольной группы) >селеназа (в 20 раз выше контроля) >пи-рацетам (в 17 раз выше контроля) > глутаредоксин (в 15 раз выше контроля). Такое индуцирующее действие исследуемых препаратов на экспрессию HIF-1a имеет достаточно важное значение в условиях гипоксии. Стабилизированная HIF-1, впоследствии активирует экспрессию генов способствующих клеточной адаптации к этим условиям. К ним относятся EPO, VEGF, HSPs, белки увеличивающие метаболизм глюкозы (переносчики глюкозы, глико-литические ферменты). Некоторые из генов, таких как ЕРО и VEGF, обеспечивают прямую защиту клеток от гипоксического стресса. Другие, такие как HSPs, могут повышать уровень GSH, способствуя стабилизации HIF-1. Кроме того ряд зарубежных работ указывает на то, что HIF-1 может повышать уровень GSH в мозге крыс, подверженных гипоксии [12,14,16], что приведет к повышению выживаемости нейронов в условиях гипоксии и истощении антиоксидантной защиты клетки. В ранних наших исследованиях показана способность у изучаемых препаратов повышать уровень GSH в условиях гипоксии/ишемии [3,4,5], что с другой стороны обеспечивает оптимальные условия для стабилизации HIF-1. Все вышесказанное указывают на то, что поддержание уровня GSH и снижение токсичности ROS является частью HIF-1-опосредованной нейрозащиты под действием проводимой терапии [13,14,15]. Как видно из таблицы 2 и рисунка 2 достоверные отличия (р< 0,05) в отношении экспрессии HIF-3a, показал только глуторедоксин (в 9 раз выше группы контроля). Изменения этого показателя, при лечении остальными препаратами носил лишь характер тенденции, а селеназа вообще оказалась не эффективной в отношении экспрессии HIF-3a. Выявленный у глутаредоксина эффект, может быть обусловлен стабилизирующей и индуцирующей ролью аддуктов глутатиона, образующихся в реакциях S-глутатионилирования под действием GRx-1 в условиях ишемии [16]. Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют, что
экспрессия HIF-1a, обеспечивает защиту на более поздних этапах гипоксии, тогда как HIF-3a, оказывает позитивное модулирующее действие в первые часы ишемии, что согласуется с литературными источниками [12].
Локальное воспаление является обязательным последствием оксидативного и нитрозирующе-го стресса, развивающегося вследствие ишемии мозга, что приводит к активации микроглии. Активированная микроглия является источником гиперпродукции АФА, АФК и индуцибельной NOS. В полученном нами на 4 сутки ишемии гомогенате мозга монгольских песчанок отмечено статистически значимое (р<0,05) повышение уровня нитротирозина (в 4,3 раза), TNF-а (в 4,6 раза), IL-1 ß (в 2,5 раза) с одновременным снижением цГМФ на 33,3%, что говорит о повышении продукции токсичных дериватов оксида азота и снижении биодоступности NO в условиях гипоксии. Уровень IL-4 снизился на 82,9% в сравнении с ложно-оперированными животными, что свидетельствует о наличии локальной воспалительной реакции в зоне экспериментальной ишемии (табл. 3).
Курсовая терапия модуляторами системы глутатиона приводит к статистически значимому (р<0,05) повышению содержания противоспалительного IL-4 (селеназа на 11,8%, глутоксим на 23,7% и глутаредоксин на 19,7% в сравнении с группой контроля). Такое повышение IL-4 подавляет провос-палительную активность макрофагов и секрецию ими TNF-а и IL-1ß. Это выражается в достоверном (р<0,05) снижении содержания TNF-а у всех изучаемых препаратов (селеназа на 69,6%, глутоксим на 75,9%, глутаредоксин на 31,6% в сравнении с контрольной группой), снижение уровня IL-1 ß не показало статистически значимых отличий в сравнении с группой контроля и носило лишь характер тенденции. Описанное изменение соотношений между противовоспалительными и провоспалительными цитокинами первое ограничивает локальную воспалительную реакцию в зоне ишемической полутени, что повышает шансы нервной клетки к выживанию,
Таблица 3.
Уровень цГМФ, нитротирозина и цитокинов при экспериментальном ОНМК и при терапии модуляторами ТДС (M±m, п=10)
Группы Нитротирозин, TNF-a, IL-1ß, IL-4, цГМФ,
животных нмоль/г ткани пг/мл пг/мл пг/мл мМоль/мл
ЛО 10,90+1,28 0,17±0,061 0,16 ±0,046 12,9±0,25 0,12 ±0,0032
ОНМК 47,60+4,20* 0,79 ±0,18 * 0,4±0,13 * 7,05 ±0,14 * 0,09±0,0032*
ОНМК+селеназа 21,40±2,24# 0,24±0,026# 0,39±0,057 7,88 ±0,52# 0,08±0,0021#
ОНМК+глутоксим 12,40+1,15# 0,19 ±0,038# 0,37±0,076 8,72±1,28# 0,037±0,004#
ОНМК+глутаредоксин 11,9 0±1,13# 0,54±0,2# 0,31 ±0,12 8,44±0,75# 0,045±0,038#
Примечание. * изменения статистически значимы по отношению к группе ЛО (р < 0,05), # изменения статистически значимы по отношению к группе контроля (р < 0,05).
и второе предотвращает цитокин-опосредованное повышение активности индуцибельной NOS. Последнее, проявляется в снижении гиперпродукции NO (снижение уровня цГМФ селеназа на 11,1%, глу-токсим на 58,9%, глутаредоксин на 50%), а также уровня токсичных дериватов оксида азота-нитротирозина (в группе с введением глутоксима - на 73,94 %; селеназы - на 55%; глутаредоксина - на 75%). Все вышеперечисленное приводит к снижению цитотоксического отека в зоне пенумбры в острый период ишемии и ограничению реакций нитрозирующего стресса. Снижение концентрации провоспалительных цитокинов под действием изучаемых препаратов возможно оказывает по нашему мнению позитивное регулирующее действие на активность редокс-чувствительных транскрипционных факторов (NF-1, AP-1, NF-kB), главных участников апоптотического и некротического сценария гибели клетки. Таким образом, свойства селеназы, глутоксима и глутаредоксина ограничивать реакции оксидативного и нитрозативного стресса за счет их антиоксидантного, энерготропного и митопротек-тивного действия [3,4,5,7,8] дополняется способностью снижать цитотоксический отек в зоне ишемии и повышать устойчивость нейрона к гипоксии, что объясняет возможность их использования в качестве средств, вторичной нейропротекции.
Выводы
1. Моделирование ОНМК приводит к достоверному повышению мРНК HIF-1 а, HIF-За нитротирозина, TNF-а и IL-1 в, с одновременным снижением IL-4 и цГМФ.
2. Курсовое назначение модуляторов ТДС (селеназы, глутоксима и глуторедоксина) приводит к статистически значимой экспрессии мРНК HIF-1 а, что определяет важность этого гена в отдаленном периоде гипоксии.
3. Влияние исследуемых препаратов на экспрессию мРНК HIF-За не оказались достоверными, кроме группы глутаредоксина, что по-видимому связано со способностью у препарата повышать экспрессию данного гена в первые часы гипоксии.
4. Курсовое введение препаратов (селеназы, глутоксима и глутаредоксина) приводило к ограничению реакций нитрозирующего стресса (снижение значений нитротирозина и цГМФ).
5. Терапия изучаемыми препаратами оказала позитивное влияние на соотношение провоспали-тельного цитокина TNF-а и IL-4 в пользу последнего.
6. Введение селеназы, глутоксима и глуторедоксина не оказало достоверных отличий от группы контроля на показатель IL-1 ß.
7. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для применения глутоксима, глутаредоксина и селеназы в комплексной терапии острого нарушения мозгового кровотока.
Перспективы дальнейших исследований. Углубление изучения нейропротективных способностей селеназы, глутоксима и глуторедоксина и возможность их использования в качестве вспомогательных средств, в составе базисной нейропро-тективной терапии.
Литература
1. Belenichev IF, Cherniy VI, Nagornaya YeA, Pavlov SV, Cherniy TV, Bukhtiyarova NV, i dr. Neyroprotektsiya i neyroplastichnost'. Kuiv: Logos; 2015. 510 s. [in Russian].
2. Belenichev IF, Cherniy VI, Kolesnik YuM, Pavlov SV, Andronova IA, Abramov AV, i dr. Ratsional'naya neyroprotektsiya. Donetsk: Izdatel' Zaslavskiy A.Yu; 2009. 262 s. [in Russian].
3. Belenichev IF, Litvinenko YeS. Fermentativnoye i nefermentativnoye zveno tiol-disul'fidnoy sistemy v golovnom mozge eksperimental'nykh zhivotnykh s tserebral'noy ishemiyey: effekty selenazy. Farmakologíya ta likars'ka toksikologíya. 2015;1(42):13-6. [in Russian].
4. Belenichev IF, Litvinenko YeS. Neyroprotektivnyye effekty pri modulyatsii glutationovoy sistemy golovnogo mozga, vliyaniye na letal'nost', nevrologicheskiy defitsit, oksiddativnyy stress v usloviyakh eksperimental'noy ONMK. Visnik problem bfologff' i meditsini. 2016;3(2):94-9. [in Russian].
5. Belenichev IF, Litvinenko YeS. Neyroprotektivnaya aktivnost' modulyatorov tiol-disul'fidnoy sistemy v usloviyakh modelirovaniya glutamatnoy eksaytotoksichnosti in vitro. Farmakologíya ta likars'ka toksikologíya. 2017;4-5(55):20-7. [in Russian].
6. Belenichev IF, Steblyuk VS, Kamyshnyy AM. Kharakter ekspressii mRNK iNOS I yeNOS v miokarde krys s alkogol'noy kardiomiopatiyey i na fone provodimoy terapii metabolitotropnymi. Visnik problem bfologff' i meditsini. 2017;2(136):82-7. [in Russian].
7. Burova YeB, Vasilenko KP, Antonov VG, Nikol'skiy NN. Transaktivatsiya retseptora epidermal'nogo faktora rosta okislennym glutationom i yego farmakologicheskim analogom glutoksimom v kletkakh A 431. Doklady akademii nauk. 2005;1(404):1-3. [in Russian].
8. Novikov VYe, Levchenkova OS. Novyye napravleniya poiska lekarstvennykh sredstv s antigipoksicheskoy aktivnost'yu i misheni dlya ikh deystviya. Eksper. i klin. farmakol. 2013;5(76):37-46. [in Russiаn].
9. Alan McIntyre & Adrian L Harris. Metabolic and hypoxic adaptation to antiangiogenic therapy: a target for induced essentiality. EMBO Molecular Medicine. 2015;4(7):368-79.
10. Badawi Y, Ramamoorthy P, Shi H. Hypoxia-inducible factor 1 protects hypoxic astrocytes against glutamate toxicity. ASN NEURO [Internet]. [cited 2012];4(4):art:e00090. Available from: http://journals.sagepub.com/doi:10.1042/AN20120006
11. Florian Rieß. Regulation of expression and functional characterization of human HIF-3a. München; 2015. 111 p.
12. Heidbreder Marc, Fro Frederike Hlich, Olaf Jo Hren. Hypoxia rapidly activates HIF-3 mRNA expression. The FASEB Journal. 2003;17:1541-3.
13. Prabhu Ramamoorthy and Honglian Shi. Ischemia induces different levels of hypoxia inducible factor-1a protein expression in interneurons and pyramidal neurons. Acta Neuropathological Communications [Internet]. [cited 2014];2(51):1-10. Available from: www.actaneurocomms. org/content2014
14. Qingdong Ke, Max Costa. HIF-1, a new target for therapy. Mol Pharmacol. 2006;70:1469-80.
15. Shrivastava K, Shukla D, Bansal A, Sairam M, Banerjee P, Ilavazhagan G. Neuroprotective effect of cobalt chloride on hypobaric hypoxiainduced oxidative stress. Neurochem Int. 2008;52:368-75.
16. Yosuke Watanabea, Colin E. Murdocha, Soichi Sanob, Yasuo Idoc, Markus M. Bachschmida, Richard A. Cohena, et al. Glutathione adducts induced by ischemia and deletion of glutaredoxin-1 stabilize HIF-1a and improve limb revascularization. PNAS [Internet]. [cited 2016 May 24];113(21):6011-6. Available from: www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1524198113 PNAS
ХАРАКТЕР ЕКСПРЕСП мРНК HIF-1 a i HIF-3a, Р1ВНЯ Н1ТРОТИРОЗИНУ, цГМФ I 1НТЕРЛЕЙК1Н1В В ГО-МОГЕНАТ1 МОЗКУ МОНГОЛЬСЬКИХ П1ЩАНОК З ГОСТРИМ ПОРУШЕННЯМ МОЗКОВОГО КРОВООБ1-ГУ I НА ТЛ1 ТЕРАПП МОДУЛЯТОРАМИ СИСТЕМИ ГЛУТАТ1ОНУ Белешчев I. Ф., Литвиненко О. С., Камишний А. М.
Резюме. На моделi незворотно! односторонньо! оклюзiI загально! сонно! apTepil у монгольських пщанок вивчено вплив модулятоpiв системи глутатюну - глутоксiмa, селенази i глутаредоксша на характер експре-сп мРНК HIF-1 a i HIF-3a. Дослiджeно вплив перерахованих препара^в на piвeнь TNF-a, IL-4, IL-1ß, цГМФ i нггротирозину. Селеназа в дозi 50 мкг/кг, глутокЫм в дозi 50 мг/кг i глутаpeдокciн в дозi 200 мкл/кг в piзного ступеня вираженост приводили до зростання експресп HIF-1 a i HIF-3a, що на нашу думку, може пщвищува-ти стмкють нейрона до умов ппокси. На тл модуляци глутатюново! системи дослщжуваними препаратами зареестровано зниження piвня TNF-a, ытротирозину i цГМФ з одночасним пщвищенням IL-4, що пiдвищуe шанси нейрона до виживання в гострому поcтiшeмiчному пepiодi.
Ключовi слова: церебральна iшeмiя, HIF-s, iнтepлeйкiни, цГМФ, ытротирозин, селеназа, глутокciм, глу-таpeдокciн.
ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ мРНК HIF-1a И HIF-3a, УРОВЕНЬ НИТРОТИРОЗИНА, цГМФ И ИНТЕРЛЕЙ-КИНОВ В ГОМОГЕНАТЕ МОЗГА МОНГОЛЬСКИХ ПЕСЧАНОК С ОСТРЫМ НАРУШЕНИЕМ МОЗГОВОГО КРОВОТОКА И НА ФОНЕ ПРОВОДИМОЙ ТЕРАПИИ МОДУЛЯТОРАМИ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА Беленичев И. Ф., Литвиненко Е. С., Камышный А. М.
Резюме. На модели необратимой односторонней окклюзии общей сонной артерии у монгольских песчанок изучено влияние модуляторов системы глутатиона - глутоксима, селеназы и глутаредоксина на характер экспрессии мРНК HIF-1 a и HIF-3a. Исследовано влияние перечисленных препаратов на уровень TNF-a, IL-4, IL-1 ß, цГМФ и нитротирозина. Селеназа в дозе 50 мкг/кг, глутоксим в дозе 50 мг/кг и глутаре-доксин в дозе 200 мкл/кг в разной степени выраженности приводили к росту экспрессии HIF-1a и HIF-3a, что по нашему мнению, может повышать устойчивость нейрона к условиям гипоксии. На фоне модуляции глутатионовой системы изучаемыми препаратами зарегистрировано снижение уровня TNF-a, нитротирозина и цГМФ с одновременным повышением IL-4, что повышает шансы нейрона к выживанию в остром по-стишемическом периоде.
Ключевые слова: церебральная ишемия, HIF-s, интерлейкины, цГМФ, нитротирозин, селеназа, глутоксим, глутаредоксин.
THE mRNA EXPRESSION CHARACTER OF HIF-1 a AND HIF-3a, NITROTYROSINE, cGMP AND INTER-LEUKINS IN THE MONGOLIAN GERBILS BRAIN WITH ACUTE ISCHEMIA DURING THE GLUTATHIONE SYSTEM MODULATORS THERAPY
Belenichev I. F., Lytvynenko E. S., Kamyshnyi A. M.
Abstract. The growth and spread of ischemic brain lesions among people around the world continues to grow steadily, in spite of the progress made in modern neuropharmacology. Under these circumstances an important aspect in the treatment of cerebral stroke becomes the pharmacological regulation of the molecular and biochemical mechanisms of endogenous neuroprotection. The important directions of modern neuroprotection are: increasing the resistance of the nervous tissue to hypoxia, reducing the local inflammatory response and limiting the reactions of nitrosative stress.
The aim of our study was to investigate the effect of glutathione system modulators- selenase, glutoxim and glu-taredoxin - on the mRNA expression character of HIF-1 a and HIF-3a, markers of nitrosative stress and interleukins in the Mongolian gerbils brain with acute ischemia.
Object and methods. The experimental part was conducted on 60 male Mongolian gerbils (Meriones unguicu-latus) weighing between 60 and 80 g. In accordance to the research program, an irreversible one-way ligation of
the common carotid artery was utilized, which presently is generally accepted as an experimental model of acute cerebral circulatory disorders. To study the effect of experimental drugs they were administered intraperitoneally one time daily for 4 days, starting from the first ones, after recovery from anesthesia. Comparison drug and physiological solution (control group) were administered in the same way. Efficiency of glutathione system modulators (selenase - 50 |ig/kg, glutoxim - 50 mg/kg, glutaredoxin - 200 |il/kg) and comparison drug (pyracetam - 500 mg/ kg) evaluated by their influences on the mRNA expression state of HIF-1a and HIF-3a, real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in brain tissue was used. The nitrotyrosine, TNF-a, IL-4, IL-ip, cGMP levels was determined by ELISA in brain tissue. The results of the study were processed using a statistical package of the licensed programs «STATISTICA for Windows 6.1» (StatSoft Inc.), «SPSS 16.0», «Microsoft Excel 2003».
Results. It has been established that the cerebral ischemia modeling leads to a significant increase mRNA expression of HIF-1a and insignificant mRNA expression of HIF-3a on the 4th day of model pathology in brain tissue. The course injection of the study drugs within 4 days after the experimental ischemia leads to a significant increase in the expression of HIF-1a, leading in this series glutoxim (37 times higher than the control group) >selenase (20 times higher control) >pyratsetam (17 times higher control) > glutaredoxin (15 times higher control). This increase in HIF-1a expression increases the neuron's resistance to hypoxia. It should be noted that injections of glutaredoxin resulted in an increase in mRNA of HIF-3a expression relative to control values, and selenase and glutoxim did not significantly change the expression of this gene. The results of these studies show that compared with the sharm operated animals, the group of gerbils with stroke showed significant increase of nitrotyrosine, TNF-a, IL-1 p, levels and a decrease in IL-4 cGMP levels. A course of treatment with selenase, glutoxim and gutaredoxin increase of IL-4 level and decrease nitrotyrosine, TNF-a and cGMP levels. The results confirm the presence of neuroprotective properties in selenase, glutoxim and glutaredoxin. These properties were identified by their ability to restore the thiol-disulfide balance, to raise the level of IL-4 and the expression of HIFs and reduce the high levels of nitrotyrosine and pro-inflammatory interleukins in ischemic brain injury, resulting in the reduction of neuronal loss following a stroke.
Conclusion. The obtained data are experimental justification for the use of selenase, glutoxim and glutaredoxin in the complex therapy of cerebral ischemia.
Key words: cerebral ischemia, HIF-s, interleukins, cGMP, nitrotyrosine, selenase, glutoxim, glutaredoxin.
Рецензент - проф. Дев'ятюна Т. О.
Стаття надшшла 29.01.2018 року
DOI 10.29254/2077-4214-2018-1-1-142-108-112 УДК 616-001.1/616.8-089/616-085.2/3-092.18:073.173 Блецький О. В.
ЕФЕКТИВН1СТЬ ЗАСТОСУВАННЯ КОМПЛЕКСУ ЗАХОД1В ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ ПРОЦЕС1В ТКАНИННОГО ДИХАННЯ В СКЛАД1 1НТЕНСИВНО1 ТЕРАПИ ДЛЯ ПОСТРАЖДАЛИХ З ТЯЖКОЮ ЧЕРЕПНО-МОЗКОВОЮ ТРАВМОЮ
КЗОЗ «Харк1вська мюька ктшчна л1карня швидко'Гта невщкладноТ медично'Гдопомоги
iM. проф. О. I. Мещаншова» (м. Харк1в)
Зв'язок публшацм з плановими науково-до-слщними роботами. Результати дослщження, що представлен^ е часткою виконання НДР кафедри медицини невщкладних стаыв та медицини катастроф Харювсько! медично! академи пюлядиплом-но! освгги на тему «Недиференцмна тератя у хворих на гостру церебральну недостатнють», № державно! реестраци 0115Ш00147.
Вступ. Вщновлення функци свщомост у по-страждалих на тяжку черепно-мозкову травму (ТЧМТ) та зменшення вщсотку Ывалщизаци та ле-тальност в зазначеного контингенту пащенпв яв-ляють найскладнш проблеми сучасно! медицини, зокрема в галузi штенсивно! терапи. Ктькють по-страждалих на ТЧМТ з кожним роком зростае [12]. На сучасному етап в процес проведення л^вання
постраждалих на ТЧМТ в умовах вдцшень штенсивно! терапи (В1Т) фахiвцi керуються авторитетними мiжнародними рекоменда^ями, основний змют яких е вельми близьким [5,6]. Одним з важливих механiзмiв патогенезу тривалих розладнань функ-цм головного мозку в умовах ТЧМТ е формування нейронально! мiтохондрiальноI дисфункци. Фахiвцi з нейрохiрургiI та штенсивно! терапи Кембридж-ського уыверситету визначають мiтохондрiальну дисфунк^ю як «нездатнють кгитин виробляти та накопичувати енерпю нав^ь при достатньому по-стачанн !х киснем та енергетичними субстратами». Мiтохондрiальна дисфунк^я обумовлена порушен-нями функцюнування мiтохондрiального дихального ланцюга та асоцмована з пстотоксичною ппокЫею [7,10].
