CC BY
27
© Горбачева С. В., Беленичев И. Ф. УДК: 616.831-091/.092.001.57 Горбачева С. В., Беленичев И. Ф.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ КОЭФФИЦИЕНТА НИТРОТИРОЗИН/ГЛУТАТИОН В КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ МОЗГОВОГО ИНСУЛЬТА Запорожский государственный медицинский университет (г. Запорожье)
swg18@yandex.ua
Работа выполнялась на кафедре фармакологии и медицинской рецептуры Запорожского государственного медицинского университета в рамках госбюджетной темы «Молекулярно-биохимические механизмы формирования митохондриальной дисфункции нейронов головного мозга в условиях острой церебральной ишемии: новые мишени для нейропротекции» (№ государственной регистрации 0113, шифр U000797).
Вступление. Сосудистые заболевания головного мозга являются глобальной медицинской и социальной проблемой в связи с высокими показателями заболеваемости, смертности и ин-валидизации. Среди них церебральная ишемия формирует наиболее многочисленный и тяжелый контингент неврологических больных, так как сопровождается выраженными когнитивными расстройствами и неврологическим дефицитом в виде парезов и параличей в конечностях [2].
Церебральная ишемия подразумевает динамический процесс и потенциальную обратимость вызываемых изменений. В связи с этим понимание механизмов гибели нейронов при ишемии мозга являются современной проблемой и интенсивно изучаются во всем мире. Накопление в нейрональ-ной клетке продуктов окислительной модификации липидов, белков, нуклеиновых кислот приводит к токсической и апоптической гибели нервных клеток и, как следствие развитие когнитивного дефицита. Помимо апоптической гибели части нейронов, в условиях генерации АФК происходят и метаболические изменения в нейрональной клетке. Так, окислительная атака SH- групп NMDA-рецепторов приводит к подавлению их функции. Снижение функции белков в цепи переносчиков электронов, активности АТФ-азы, избирательности действия транспортных пор происходит также в результате окислительной модификации белковых молекул. Изменение Red/Ox- потенциала митохондриальной мембраны может вызывать дисфункцию каскада дыхательной цепи нейрональной клетки. Окислительная деструкция белковых и липидных фрагментов мембран нейроцитов, ухудшает чувствительность и специфичность рецепторов, генерацию, образование и проводимость нервного импульса, нарушает синаптическую передачу. Дан-
ные изменения, в конечном итоге, приводят к нарушению секреторной, инкреторной, транспортной функции нейрона, в конечном итоге приводя к ослаблению когнитивно-мнистических функций организма [1].
В лабораторной диагностике оценки степени тяжести ОНМК прослеживаются существенные недостатки. Выявляемые современными лабораторными и инструментальными методами изменения часто указывают на глубокий, мало обратимый характер повреждений тканей [4]. В то же время нашими предыдущими работами и другими исследователями раскрыта перспективность определения содержания восстановленного глутатиона и метаболитов системы N0 в биологическом материале при оценке тяжести ОНМК [1,8]. Экспериментальными исследованиями показано, что роль нарушений системы глутатиона и N0 в патогенезе ишеми-ческой нейродеструкции на различные сроки этого процесса и его выраженности далеко не одинакова. Подтверждением этого может служить и низкая эффективность антиоксидантов - нейропротек-торов, которые назначаются порой без должных на то показаний. Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона и N0 в головном мозге на острую ишемию является важной проблемой современной клинической биохимии, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи больным, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.
Цель исследования - на основании экспериментальных данных выявить корреляционную зависимость между неврологическими нарушениями у животных с различной степенью тяжести ОНМК и соотношением нитротирозин/глутатион в головном мозге, а также обосновать использование этого коэффициента в качестве диагностического критерия в клинической биохимии.
Объект и методы исследования. Исследования проведены на белых беспородных крысах массой 180-200 г, обоего пола. Острое нарушение мозгового кровообращения моделировали путем необратимой двухсторонней окклюзией общих
сонных артерий. Процедуру выполняли под этами-нал-натриевым наркозом (40 мг/кг), путём хирургического доступа выделяли общие сонные артерии, подводили под них шёлковые лигатуры и перевязывали. Учитывая высокую смертность при данной модельной патологии, общее количество животных включенное в эксперимент составляло 100 особей. На 4 сутки животных выводили из эксперимента под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) [6].
Эксперименты на животных проведены в соответствии с Общими принципами работы на животных, одобренными 1-м Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2001) и согласованными с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, Франция, 1985).
Каждый день определяли выраженность неврологического дефицита по шкале McGrow. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов: до 3 баллов - лёгкая степень, от 3 до 7 баллов - средняя степень и от 7 баллов и выше - тяжёлая степень. Отмечали парезы, параличи конечностей, тремор, манежные движения, птоз, положение на боку, подвижность, также как проявление неврологического дефицита рассматривали удерживание крыс на вращающемся стержне диаметром 15 см со скоростью вращения 3 об/мин. Животных тестировали ежедневно, выставляя сумму баллов [9].
Для биохимических исследований использованы фрагменты, находящихся в области сенсо-моторной зоны коры головного мозга и гомогенизированные в жидком азоте. Цитозольную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования (15 000 g) при температуре +4оС на 0,15 М фосфатном буфере рН 7,8. Содержание восстановленного глутатиона определяли флюорометрически [7]. Содержание нитротирозина определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа методом ELISA с использованием стандартного тест-набора «Nitrotirosine ELISA Kit» («HyCult biotechnology») в соответствии с прилагаемой к набору инструкцией.
Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего значения (М ± m). Результаты исследования обработаны с использованием статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA® forWindows 6.0» (StatSoftInc., № AXXR712D833214FAN5), а также «Microsoft Excel 2010». Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия с уровнем значимости менее 0,05 (95%) [5].
Результаты исследования и их обсуждение.
Моделирование острого нарушения мозгового кровообращения вызывало формирование неврологической симптоматики у всех экспериментальных животных.
Однако, балы неврологического дефицита по шкале МоОгош. Исходя из этого, всех прооперированных животных разделили на 3 группы: первая - животные с легкой неврологической симптоматикой, вторая -средняя степень, третья - группа с тяжелой степенью выраженности нарушений.
Проведенные биохимические исследования показали четкую зависимость неврологических нарушений от изученных показателей (табл. 1).
В тканях мозга животных с легким неврологическим дефицитом (средний бал - 2,4) наблюдалось падение содержания восстановленной формы глутатиона на 47,6% и накопление нитротирозина на 93,8% относительно показателей интактных животных, что свидетельствует о развитии оксидативного и нитрозативного стресса. Дальнейшее усугубление неврологических нарушений сопровождалось дальнейшим прогрессированием патобиохими-ческих реакций. Так, в группе 2, которая характеризовалась средней степенью тяжести по шкале Мойгош, повышение неврологического балла на 3,7 единицы протекало на фоне падения на 56,5% пула восстановленного глутатиона и повышении нитротирозина на 85,5% относительно показателей группы 1. У животных с тяжелыми неврологическими нарушениями в тканях мозга отмечалось существенное накопление нитротирозина, который считается маркером накопления наиболее токсичного продукта нитрозативного стресса - пе-роксинитрита. Уровень этого показателя в 7,4 раза превышал показатели интактной группы и был в 2,06 и 3,83 раза больше значений группы 2 и 1 соответственно. Усиленное образование пероксини-трита обусловлено смещением тиол-дисульфид-ного равновесия в нейронах. Восстановленные тиолы, в первую очередь, глутатион, способны связывать активные формы N0 и предупреждать образование пероксинитрита, ограничивая тем самым его токсическое действие [3]. Данное утверждение подтверждается нашими исследованиями. Снижение концентрации восстановленного глута-тиона протекало параллельно с накоплением ни-тротирозина и формированием неврологического дефицита (табл. 1 ). В группе 3 зарегистрировано падение в 12,7 раз по сравнению с интактными животными уровня восстановленного глутатиона, что в конечном итоге обусловило развитие стойкого неврологического дефицита (15,8 ± 1,65 баллов).
Таблица 1.
Неврологический дефицит и биохимические показатели у экспериментальных животных
Группы животных McGrow Stroke-index Глутатион восстановл. (GSH), мкмоль/ г белка Нитротирозин, нмоль/г белка
Интактная (n = 10) 0 3,95 ± 0,05 5,31 ± 0,16
Группа 1 (n = 5) 2,4 ± 0,29 2,07 ± 0,07* 10,29 ± 0,85*
Группа 2 (n = 7) 6,07 ± 0,5** 0,9 ± 0,06** 19,07 ± 0,62**
Группа 3 (n = 57) 15,36 ± 1,54**& 0,31 ± 0,02**& 39,4 ± 1, 24**&
Примечание: * - р < 0,001 по отношению к интактным животным Ь; # - р < 0,001 по отношению к группе 1; & * - р < 0,001 по отношению к группе 2.
Scatterplot: McGrow vs. GSH (Casewise MD deletion) GSH = 1,6549 - ,0828 * McGrow Correlation: r = -,8289
2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
О
........ ° О
О о
о
о
Во *
о
о о О о to
10
12 McGrow
14
16
18
20
22
24
POs.95% confidence
Рис. 1. Зависимость степени неврологического дефицита от уровня восстановленного глутатиона у экспериментальных животных.
Scatterplot: McGrow vs. НТЗ (Casewise MD deletion) HT3 = 9,3123 + 1,8864 * McGrow Correlation: r = ,82722
70
60
50
40
i
30
20
10
о
fif
о О о ________________ о
о о ов о j > " о о °
о о >оо
>£8
>'о о
10
12 Mc Grow
14
16
Рис. 2. Зависимость степени неврологического дефицита от уровня нитротирозина у экспериментальных животных.
Таблица 2.
Коэффициент соотношения нитротирозин/ восстановленный глутатион в группах животных с разной выраженностью неврологического дефицита
Группа животных Коэффициент нитротирозин/GSH
Интактная 1,35 ± 0,04
Группа 1 5,03 ± 0,57
Группа 2 22,06 ± 2,1
Группа 3 138,5 ± 7,92
Для статистической оценки результатов сначала исследовали характер распределения изучаемых переменных. Проверку нормальности распределения проводили с применением W-теста Шапиро-Уилка и критерия Колмогорова-Смирнова [5]. Наличие или отсутствие линейной связи между двумя количественными показателями, а также их тесноту и статистическую значимость определяли вычислением критерия корреляции Пирсона. Представленные диаграммы рассеяния для выбранных переменных (рис.1-2)указывают на наличие выраженной прямолинейной зависимости проанализированных данных. Для неврологической симптоматики отмечена отрицательная зависимость с восстановленным глутатионом (г = - 0,8289) и положительная с уровнем нитротирозина (г = 0,8272). Вычисленные коэффициенты корреляции Пирсона подтверждаются визуальной 3й-диа-граммой (рис. 3), на которой графически изображена взаимосвязь динамики концентраций глутатиона и нитротирозина с выраженностью неврологического дефицита.
Учитывая наличие четкой зависимости между исследованными показателями, нам представляется возможным вычисление коэффициента соотношения уровня нитротирозина к восстановленному глутатиону и возможность его использования для диагностики неврологических нарушений. Полученные данные представлены в табл. 2. Из рассчитанных коэффициентов следует, что в нормальных условиях соотношение нитроти-розин/глутатион (К Н) составляет около 1,3. Легкая степень неврологического дефицита характеризуется Кн/(35Н близким к 5,0; при тяжелых неврологических нарушениях Кн/(35Н увеличивается и составляет около 138,5. Выводы
Таким образом, сопряженность в системе «N0 -восстановленные тиолы» играет существенную роль в механизмах нейродеструкции и эндогенной нейропротекции, а ее соотношение определяет судьбу нейрона в условиях церебральной ишемии. Ключевым фактором равновесия в этой системе является поддержание на определенном уровне пула
18
20
22
24
confidence
0
6
8
0
8
восстановленных тиолов и, особенно глутатиона. Восстановленные эквиваленты глутатиона обеспечивают не только биодоступность N0, но и безопасность функционирования системы N0 для нейрона, предупреждая образование его нейротокических дериватов. Выявлена статистически достоверная линейная зависимость степени выраженности неврологического дефицита от функционирования сопряженной системы «NO - восстановленные тиолы».
Перспективы дальнейших исследований.
Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием применения в клинической биохимии коэффициента нитротирозин/восста-новленный глутатион в качестве диагностического критерия степени тяжести мозгового инсульта. Представляется перспективным проверить его эффективность при лабораторном обследовании больных с нарушениями мозгового кровообращения.
Литература
1. Беленичев И. Ф. Нейропротекция и нейропластичность / И. Ф. Беленичев, В. И. Черний, Е. А. Нагорна [и др.]. - Киев: Логос,
2015. - 512 с.
2. Гусев Е. И. Информированность населения о факторах риска сосудистых заболеваний головного мозга и клинических про-
явлениях инсульта / Е. И. Гусев, Я. Е. Фрис, Л. А. Шелякина // Журн. неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2010 -Т. 110, № 9. - С. 3-12.
3. Калинина Е. В. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов /
Е.В. Калинина, Н. Н. Чернов, М. Д. Новичкова // Успехи биол. наук. - 2014 - Т. 54. - С. 299-348.
4. Кандыба Д. В. Алгоритм диагностики и оценки эффективности медикаментозного и хирургического лечения больных
с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения при патологии экстракраниальных артерий / Д. В. Кандыба, А.А. Скоромец, Т. Н. Трофимова // Инсульт. - 2007. - Вып. 20. - C. 58-65.
5. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /
О.Ю. Реброва. - М., Медиасфера, 2002, 312 с.
6. Стефанов О. В. Докл^чш дослщження лкарських засобiв (методичн рекомендаций / О. В. Стефанов. - КиУв: «Авiацена»,
2002. - 527 с.
7. Чекман И. С. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов /
И.С. Чекман, Ю. И. Губский, И. Ф. Беленичев. - К.: ГФЦ МОЗ Украины, 2010. - 81 с.
8. Belenichev I. F. The Thiol-Disulfide Balance and the Nitric Oxide System in the Brain Tissue of Rats Subjected to Experimental
Acute Impairment of Cerebral Blood Flow: The Therapeutic Effects of Nootropic Drugs / I. F. Belenichev, S. V. Gorbacheva, N.V. Bukhtiyarova // Neurochemical Journal. - 2014. - Vol. 8, № 1. - P. 24-27.
9. McGrow C. P. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils / C. P. McGrow // Arch. Neurol. - 1977. -
Vol. 34, № 6. - P. 334-336.
Рис. 3. Сопряженность изменений уровней нитротирозина и восстановленного глутатиона с неврологическим дефицитом.
УДК: 616.831-091/.092.001.57
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ Д1АГНОСТИЧНОТ ЗНАЧУЩОСТ1 КОЕФ1Ц16НТА Н1ТРОТИ-РОЗИН/ГЛУТАТ1ОН В КЛ1Н1ЧН1Й Б1ОХ1ММ ДЛЯ ОЦ1НКИ СТУПЕНЯ ТЯЖКОСТ1 МОЗКОВОГО ШСУЛЬТУ Горбачова С. В., Белешчев I. Ф.
Резюме. Спряженють в системi «N0 - вщновлеш тюли» вщграе ютотну роль у мехашзмах нейродеструк-цп та ендогенноУ нейропротекцп, а ТУ стввщношення визначае долю нейрона в умовах церебрально)' шемп. Ключовим фактором рiвноваги в цм системi е пщтримка на певному рiвнi пулу вщновлених тiолiв ^ особливо глутатюну. Вщновлеш е^валенти глутатюну забезпечують не тшьки бюдоступнють N0, а й безпеку функ-цюнування системи N0 для нейрона, попереджаючи утворення його нейротоксичних дерива^в. Виявлена статистично достовiрна лшмна залежнють ступеня тяжкост невролопчного дефщиту вщ функцюнування системи «N0 - вщновлеш тюли». Отримаш результати е експериментальним обфунтуванням застосування в кшшчшй бiохiмiУ коефМента штротирозин/вщновлений глутатюн в якост дiагностичного критер^ ступеня тяжкост мозкового шсульту
Ключовi слова: штротирозин, глутатюн, оксид азоту, гостре порушення мозкового кровооб^у.
УДК: 616.831-091/.092.001.57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ КОЭФФИЦИЕНТА НИТРОТИРОЗИН/ГЛУТАТИОН В КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ МОЗГОВОГО ИНСУЛЬТА
Горбачева С. В., Беленичев И. Ф.
Резюме. Сопряженность в системе «NO - восстановленные тиолы» играет существенную роль в механизмах нейродеструкции и эндогенной нейропротекции, а ее соотношение определяет судьбу нейрона в условиях церебральной ишемии. Восстановленные эквиваленты глутатиона обеспечивают не только биодоступность NO, но и безопасность функционирования системы NO для нейрона, предупреждая образование его нейротоксических дериватов. Выявлена статистически достоверная линейная зависимость степени выраженности неврологического дефицита от функционирования сопряженной системы «NO - восстановленные тиолы». Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием применения в клинической биохимии коэффициента нитротирозин/восстановленный глутатион в качестве диагностического критерия степени тяжести мозгового инсульта
Ключевые слова: нитротирозин, глутатион, оксид азота, острое нарушение мозгового кровообращения.
UDC: 616.831-091/.092.001.57
EXPERIMENTAL JUSTIFICATION OF DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE OF NITROTYROSINE/GLUTATHIONE COEFFICIENT IN CLINICAL BIOCHEMISTRY IN ORDER TO GIVE AN ESTIMATION OF CEREBRAL STROKE SEVERITY
Gorbacheva S. V., Belenichev I. F.
Abstract. Essential disadvantages take place in laboratory diagnostics of estimation the severity of acute cerebral circulation impairments. Modern laboratory parameters and instrumental methods used nowadays reveal deeper and not very reversible cerebral tissue damages. Experimental investigations reflect a role of impairments of glutathione and NO system in pathogenesis of ischemic neurodestruction. Detection of glutathione and NO system regularities response in brain to acute cerebral ischemia is an important problem of modern clinical biochemistry. The decision of the given problem could promote a significant growth in rendering assistance to the patients due to purposeful improvement of the methods of pharmacological correction.
The purpose of the given investigation is to reveal correlation dependence on the base of experimental data between neurological impairments among the animals with acute cerebral circulation impairment of different degree of severity and nitrotyrosine/glutathione ratio in brain.
The conducted investigations showed that in cerebral tissues of animals with slight neurologic deficiency (average grade - 2,4) it was observed the drop of reduced glutathione form contents on 47,6% and accumulation of nitrotyrosine on 93,8%. That is the evidence of oxidative and nitrosative stresses development. Further worsening of neurologic impairments was accompanied by pathobiochemical reactions progress. Among the animals with severe neurologic impairments in cerebral tissues it was observed essential increase of nitrotyrosine level that is a marker of the most toxic product of nirtosative stress such as peroxynitrite. Intensified formation of peroxynitrite is specified by thiol-disulfide balance shift inside neurons. The decrease of reduced glutathione concentration was occurring simultaneously with the process of nitrotyrosine accumulation and neurologic deficiency formation.
Conjugation in the system "nitric oxide - reduced thiols" plays a significant role in mechanisms of neurodestruction and endogenous neuroprotection and its correlation defines neuron destiny in conditions of cerebral ischemia. Key factor of balance in this system is a maintenance at definite level the pool of reduced thiols in particular glutathione. Reduced equivalents of glutathione provide not only bioavailability of nitric oxide but also safety of NO system functioning for a neuron preventing a formation of its neurotoxic derivatives. A statistically significant linear dependence of neurologic deficiency manifestation degree from functioning of conjugated system "nitric oxide -reduced thiols" was established. The obtained results are considered to be an experimental justification of nitrotyro-sine/reduced glutathione coefficient application in clinical biochemistry as a diagnostic criterion of cerebral stroke severity.
Keywords: nitrotyrosine, glutathione, nitric oxide, acute cerebral circulation impairment.
Рецензент - проф. Литвиненко Н. В.
Стаття надшшла 30.01.2016 року
