CC BY
36
Для того, чтобы проверить, содержат ли мембраны лимфобластов 1-й тип кальциевых каналов, клетки помещали в среду, содержащую 118 мМ КС1 и 28 мМ ЫаС1. По своему составу она изото-нична физиологическому раствору, но повышенное содержание КС1 (118 мМ вместо 4 мМ) вызывает деполяризацию плазматической мембраны клеток [10]. Установлено, что в этих условиях уровень кальция в лимфобластах практически не изменяется, что может свидетельствовать об отсутствии в мембране лимфобластов потенциалзависимых кальциевых каналов.
Активность рецепторуправляемых Са^-каналов регулируется различными гормонами, митогенами и определяется присутствием на мембране клеток специфических рецепторов этих веществ [6 ].
Добавление к лимфобластам декстрансульфата (0,1 мг/мл), Соп А (25 мкг/мл) вызвало повышение содержания кальция, регистрируемое по увеличению флуоресценции РШ1А-2. Возрастание [Са^] начинается через 15 с и достигает максимума через 2—3 мин после внесения препаратов, затем флуоресценция медленно падает (в течение 20 мин наблюдения) до уровня, несколько повышенного по сравнению с исходным. Максимальная концентрация кальция при действии ДФ составляет 181±11нМ (п=4), Соп А — 230±15нМ (п=4), т.е. возрастает примерно в 1,5 — 2 раза соответственно.
Чтобы выяснить, зависит ли Са^-ответ лимфобластов на митогены от концентрации внеклеточно-
| |
го кальция, мы сопоставляли изменения [Са ]| лимфобластов, индуцированных митогеном в стандартной среде, содержащей 1 мМ СаСЬ, и в бес-кальциевом буфере. Установлено, что в бескаль-циевой среде максимальный подъем уровня кальция достоверно ниже.
Таким образом, повышение содержания внутриклеточного кальция под действием изученных соединений происходит как за счет увеличения входа кальция из внеклеточного пространства, так и вследствие мобилизации кальция из внутриклеточных депо (ЭПР, митохондрии).
Полученные результаты согласуются с данными других авторов, показавших способность В- (де-кстрансульфат) и Т-митогенов (Соп А) вызывать пролиферацию лимфобластов [2 ].
Определение Са^-ответа лимфобластов может использоваться для экспресс-оценки их чувствительности к действию митогенов и различных лекарственных препаратов (циклоспорин А, кортикостероиды) , реализующих свое действие через систему вторичных мессенджеров.
ЛИГЕРЛТУРЛ
1. Гуковская А.С., Зинченко П.П. II Биол. мембраны — 1989.
— Т. 3, № 9. — С. 920—930.
2. Иммунология / Под ред. У. Пола — М.: Медицина —
1987. — Т. 1 — С. 413—460.
3. Лимфоциты. Методы // Под ред. Дж. Клаусса — М.: Мир. — 1990.
4. Молотковская И.М., Разинков В.И., Молотковский Ю.Г., Бергельсон Л.Д. II Биол. мембраны — 1992. — № 1. — С. 32—39.
5. Орлов С.П., Лабас Ю.Л. II Биол. мембраны. ■— 1989. — Т. 6. — № 9. — С. 901—938.
6. Сергеев П.П., Духанин А.С. II Фармакол. токсикол. —
1988. — № 4. — С. 4—21.
7. Сергеев П.В., Шимановский П.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. — М.: Медицина. — 1987.
8. Crynkiewicz Gr., Poenie М., Tsien R.Y. II J. Biol. Chem. — 1985. — Vol. 260, — № 6. — P. 3440—3450.
9. Malgaroli F., Milani D., Meldolesi J. II J.Cell Biol. — 1987.
— Vol. 105. — P. 2145—55.
10. Sumimoto K., Kuriyanw H. II Pflugers Arch. — 1986. — Vol. 406. — P. 173—180.
Поступила 30.01.93.
УДК 616-006.04-059-092.9 И.Ю. Кубасова, З.П. Софьина
ГОРМОНАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА КАК СТИМУЛЯТОРЫ ИЛИ ИНГИБИТОРЫ РОСТА ОПУХОЛЕЙ В КОМБИНАЦИИ С ЦИТОСТАТИКАМИ
ПИИ экспериментальной диагностики и терапии опухоли
Известное положение о большей чувствительности к цитостатикам опухолей с высоким уровнем пролиферации предполагает, что предварительная стимуляция пролиферации должна повысить цито-токсический эффект противоопухолевых препаратов. Это положение использовано рядом исследователей для разработки схемы лечения гормонозависимых опухолей, состоящей из стимулирующего пролиферацию воздействия физиологических доз гормонов с последующим введением цитостатиков [9 ]. В большинстве случаев исследование проводили на раке молочной железы, где в качестве стимулятора использовали эстрогены. Однако при этом были получены неоднозначные результаты. Наряду с сообщениями об успехе такого комбинированного воздействия в большинстве случаев не удалось достичь желаемого эффекта [1, 7]. Причины разноречивости результатов оставались неясными. В связи с этим в настоящем исследовании было подробно экспериментально изучено комбинированное воздействие на опухоль стимуляторов клеточного деления и цитостатиков.
Рис. 1. Содержание РЭ в опухолях Са-755 и РШМ-5 в зависимости от фазы астрального цикла.
По оси абсцисс — фазы астрального цикла; по оси ординат — уровень РЭ в фмоль/мг цитозольного белка.
В качестве моделей были использованы гормоночувствительные перевиваемые опухоли мышей — аденокарцинома молочной железы Са-755 и рак шейки матки РШМ-5.
Установлено, что в 44% случаев Са-755 содержат рецепторы эстрогенов (РЭ+), 45% — рецепторы глюкокортикоидов (РГ+). Значительно более низким в Са-755 является содержание рецепторов андрогенов (РА) и практически отсутствуют рецепторы прогестинов (РП).
РЭ содержатся в 45% случаев РШМ-5, РГ найдены в 34% опухолей; 19% опухолей являются РА+; РП практически отсутствуют во всех опухолях.
В качестве стимуляторов пролиферации использовали синэстрол и оксикобаламин (ОНсЫ). Предполагалось, что синэстрол будет стимулировать размножение эстрогенчувствительных клеток, а ОНсЫ — гормононечувствительных.
Содержание рецепторов определяли общепринятым методом с использованием угля, покрытого де-кстраном. Границей рецепторположительности считали 10 фмоль/мг цитозольного белка. О пролиферативной активности судили по уровню включения 3Н-тимидина в ДНК клеток при краткосрочном культивировании фрагментов опухолей.
К сожалению, в подавляющем большинстве опытов нам не удалось усилить противоопухолевое действие цитостатиков (циклофосфана — СХТ и комбинации СМБ — циклофосфана, метотрексата и 5-фторурацила) предварительным введением указанных стимуляторов пролиферации. Лишь в одном опыте наблюдалось существенное усиление противоопухолевого действия циклофосфана на РШМ-5 после предварительного введения синэст-
рола. Ингибирующий эффект комбинации в разные сроки опыта превышал действие одного циклофосфана на 15—58%. Однако увеличения продолжительности жизни животных в этом случае не наблюдалось. В другом опыте на РШМ-5 введение ОНсЫ до СМР привело к заметному увеличению продолжительности жизни мышей (с 32% до 47%).
Изучая содержание рецепторов стероидных гормонов в опухолях, мы обнаружили как значительные колебания его у мышей, находящихся в разных фазах эстрального цикла, так и существенные околосуточные колебания (рис. 1 и 2). При этом оказалось, что содержание рецепторов находится в обратной зависимости от пролиферативной активности опухолей (см. рис. 2), которая также в течение суток претерпевает значительные колебания. Подобные же взаимоотношения между содержанием рецепторов стероидных гормонов и уровнем синтеза ДНК наблюдали и другие авторы [5, 8, 10, 11 |.
Синтез ДНК под влиянием соответствующих доз синэстрола и ОНсЫ, действительно, стимулировался в большей или меньшей степени. Однако кривая синтеза ДНК очень сильно зависела от того, на какую исходную фазу этих колебаний приходилось воздействие стимулятора. Естественно, что на силу стимулирующего действия гормона также влияло содержание рецепторов эстрогена, противоположного синтезу ДНК. Например, мы вводили ОНсЫ в разное время суток (9 ч, 12 ч, 15 ч) мышам с Са-755. При этом во всех случаях в течение последующих суток, когда в наибольшей степени выражен эффект, мы наблюдали дополни-
Рис. 2. Изменение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток Са-755 и уровня РЭ в них в течение суток.
По оси абсцисс — часы суток; по оси ординат уровень РЭ в фмоль/мг цитозольного белка и включение Н-тимидина в ДРМ в мин/мкг нуклеиновых кислот /мл.
Рис. 3. Изменение включения Н-тимидина в ДНК клеток Са-755 после введения оксикобаламина (0,01 мг/мышь ежедневно 3 раза).
По оси абсцисс — часы суток; по оси ординат — уровень включения Н-тимидина в ДРМ в мин/мкг нуклеиновых кислот /мл. К — контроль.
тельные пики включения Н-тимидина, т.е. пики пролиферативной активности, либо более быстрое их появление по сравнению с контролем. Однако и число пиков и время их наступления по отношению ко времени введения ОНсЫ были разными. Единственный пик включения 3Н-тимидина, как и в контроле, но наступивший раньше контрольного (через 21 ч), отмечен после введения стимулятора в 9 ч утра (рис. 3,а). Два дополнительных пи-
Часы суток
Рис. 4. Изменение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток PLUM-5 после введения синэстрола (10 мг/мышь ежедневно 2 раза).
По оси абсцисс — часы суток; по оси ординат — уровень включения Н-тимидина в ДРМ в мин/мкг нуклеиновых кислот /мл. К — контроль
ка в течение суток получены после введения ОНсЫ в 12 ч дня (через 6 ч и 15 ч) (рис. 3,6). Один дополнительный пик наблюдали при введении стимулятора в 15 ч дня (через 12 ч после его введения) (рис. 3,в).
На следующем рисунке (рис. 4) дана кривая синтеза ДНК после введения синэстрола. Видно, что существенный прирост эффекта можно ожидать при применении цитостатика только через 12 ч после синэстрола, если последний введен в 9 ч утра. Введение цитостатика в другие сроки может сопровождаться даже снижением эффекта, что мы и наблюдали в некоторых своих опытах.
Как было показано ранее, многое зависит также от фазы эстрального цикла, в которую вводятся стимуляторы и цитостатики, т.е. схема комбинации стимуляторов пролиферативной активности с цитостатиками должна быть строго индивидуализирована, что практически почти нереально осуществить. Этим, по-видимому, и объясняются неудачи применения этого метода стимуляции роста опухолей перед цитостатической терапией в клинике и в опытах in vivo на развившихся опухолях, состоящих из гетерогенной клеточной популяции. Четкие результаты получаются лишь при изучении этих вопросов in vitro на синхронно делящихся культурах [6, 12]. Данные литературы о клиническом применении эстрогенов и андрогенов в качестве стимуляторов пролиферации соответствующих гормонозависимых опухолей (рака молочной железы, рака простаты) противоречивы. Закономерного усиления противоопухолевого эффекта цитостатиков после предварительного стимулирующего воздействия гормонов не удалось получить.
В некоторых случаях наблюдалось усиление токсичности [ 1 , 7 ].
Исходя из собственных экспериментальных данных и анализа литературы, нам представляетя нецелесообразным использование подобного метода лечения опухолей без дополнительной синхронизации пролиферативных процессов. С этой целью в настоящее время пытаются использовать препараты ЬН—1?Н-группы.
Если не применять дополнительное синхронизирующее воздействие, то более обоснованной нам кажется схема, при которой гормональное лечение не физиологическими, а терапевтическими дозами гормонов следует за цитостатической терапией. В этом случае цитостатики "выбивают" из общей популяции опухолевых клеток наиболее активно пролиферирующие. Эти же клетки оказываются наименее чувствительными к гормонотерапии, так как в них содержится наименьшее количество рецепторов. Кроме того, цитостатики снижают пролиферативный потенциал и тех клеток, которые они не убивают. В этих клетках в связи со снижением синтеза ДНК должны появляться рецепторы гормонов, и эти клетки, по нашему мнению, будут становиться гормоночувствительными.
Подтверждение нашего предположения получено нами в эксперименте, а также в клинике в ра-
Противоопухолсвый эффект комбинации циклофосфама и та-моксифспа при лечении РШМ-5
Препарат Доза [мг/кг/интер-вал (час)], чис- ТРО, % УПЖ, %
Дни после лечения
ло введений 2-й 7-й 11-й
СТХ 200, 1 86 75 59 56
Тамоксифен 50/24, 6 +29 +61 +49 25
Тамоксифен 100/24, 6 +19 +47 +57 21
СТХ 6 дк. Тамоксифен 200+50 87 75 51 91
СТХ Тамоксифен 200+100 85 75 68 88
П р и м е ч а п и е: (+) — стимуляция роста опухолей; Т1’0 — торможение роста опухолей.
боте Т.Л. Колосовой [2, 3, 4 ], показавшей, что после цитотоксической терапии рака молочной железы в опухолях увеличивается содержание гормональных рецепторов.
Нами проведены ориентировочные опыты по проверке высказанной гипотезы. Учитывая, что основным гормональным регулятором пролиферативной активности в матке являются эстрогены, мы применили комбинацию цитостатика [цикло-
СО
2
2
О
X
>»
2
®
А
Ю
О
20000 -
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
900
800
700
600
500
400
300
СТХ+син.__
І! / 2,5 мг/кг/24х~Ю ^ І/'іО мг/кг/24х10 /
■*Н--------Т-^
Сину
Прог.
26 28 30
33 35
Рис. 5. Изменение объема опухолей (РШМ-5) под влиянием разных схем комбинированной химиогормонотерапии.
По оси абсцисс — дни после перевивки опухоли; по оси ординат — объем опухолей (мм3).
фосфан ] с антиэстрогеном для лечения рака шейки матки РШМ-5.
При введении тамоксифена в терапевтической для мышей дозе 50—100 мг/кг ежедневно в течение 6—10 дней через 6—7 дней после применения терапевтической дозы циклофосфана [200 мг/кг однократно или 100 мг/кг 2 раза через 96 ч] мы получили существенное увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных (см. таблицу). Происходило значительное усиление противоопухолевого эффекта циклофосфана, хотя применение одного тамоксифена не вызывало статистически значимого увеличения продолжительности жизни животных, а в начале курса лечения, как это характерно для препарата, даже несколько усиливало рост опухолей по сравнению с контролем (феномен "вспыхивания").
Следует отметить, что при введении тамоксифена через сутки после циклофосфана увеличения противоопухолевого эффекта не происходило. По-видимому, промежуток времени был недостаточен для того, чтобы произошли те процессы, которые ведут к увеличению гормоночувствительности.
Можно предположить, что еще более выраженный противоопухолевый эффект можно получить при лечении опухолей матки комбинацией цитостатика не только с антиэстрогеном, но и с проге-стинами, так как известно, что прогестинами лечат рак тела матки и они вызывают дифференци-ровку эпителия матки. В ориентировочном исследовании нами показано, что применение прогестерона даже после введения синэстрола, ухудшавшего действие одного циклофосфана, приводит к длительной стабилизации роста рака шейки матки РШМ-5 (рис. 5). Антиэстроген, примененный в этой комбинации вместо эстрогена, должен усиливать противоопухолевый эффект.
Еще более выраженного противоопухолевого действия при раке матки можно достичь, включая в указанную выше схему кортикостероид, угнетающий продукцию эстрогенов в надпочечниках. Введение кортикостероида в эту комбинацию можно считать тем более обоснованным, что мы обнаружили в опухоли увеличение в 3—4 раза содержания РГ после действия цитостатика.
Для лечения рака молочной железы, кроме указанной схемы (цитостатик с последующим применением терапевтических доз антиэстрогена, прогестерона и кортикостероида), можно предложить и другие, учитывая, что пролиферативные процессы в молочной железе регулируются не одними эстрогенами, а и ФСГ гипофиза. В этом случае желательно затормозить продукцию одного из этих гормонов либо обоих вместе. В частности, затормозить продукцию ФСГ, кроме тамоксифена, можно большими дозами эстрогенов или андрогенов.
Таким образом, мы считаем теоретически и экспериментально обоснованными схемы комбинированного лечения гормоночувствительных опухолей цитостатиками с последующим применением антигормонов или больших доз (терапевтических) гормонов, используемых для лечения этих форм опухолей. Конкретные схемы терапии рака молочной железы и рака матки в настоящее время нами разрабатываются.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гарин Л.М., Дмитриева II.П., Вышинская Г.П., Личини-цер М.P. II Вопр. онкол., 1987. — Т. 33. — № 11. — С. 13—17.
2. Ермилова В.Д., Копосова Т.Л. // Вопр. онкол., 1985. — Т. 31. — № 12. — С. 69—73.
3. Копосова Т.Л.: Автореф. дисс. канд. — М., 1984. — С. 27.
4. Копосова Т.Л., Муравьева П.И., Смирнова К.Д. и др. — Вопр. онкол. — № 11. — Т. 30. — № 1. — С. 37—41.
5. Jakesz R., Smith С.A., Aitken S. et al. // Cancer Research, 1984. — Vol. 44. — № 2. — P. 619—625.
6. Leung B. S. 11 Anticancer Research, 1987 — Vol. 7. — № 2.
— P. 219—226.
7. Manni A., Santen R.J., Boucher A.E. et al. — In: Hormonal Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors, and New (Anti) Steroidal Agents. Ed. J.G.M. Klijn et al. // Raven Press, 1987. — P. 517—522.
8. Meyer J.S., Rao B.R., Stevens S.C., White W.L. II Cancer, 1977. — Vol. 40. — N9 5. — P. 2290—2295.
9. Osborne C.K. In: Hormonal Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors, and New (Anti) Steroidal Agents. Ed. J.G.M. Klijn et al. // Raven Press, 1987. — P. 469—476.
10. Silvestrini R., Daidone M.G., DiFrozo G. — Cancer, 1979, — Vol. 44, — № 2. — P. 665—670.
11. Straus M.J., Moran R., Muller R.E., Wotiz II.II. II Oncology, 1982. — Vol. 39. — № 4. — P. 197—200.
12. VIgnon F., Chalbos D., Derocq D., Rochefort H. II 64th Annual Meeting of Endocrine Society, 1982, № 719.
Поступила 11.02.92.
