CC BY
23
УДК 616-006.446-036.11-07:612.015.3
A.C. Духанин, H.H. Булаева, H.Е. Кушлинский,
Т.Л. Ерина
ИССЛЕДОВАНИЕ Са^-ОТВЕТА ЛИМФОБЛАСТОВ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ОСТРОМ ЛЕЙКОЗЕ
НИИ клинической онкологии и Российский государственный медицинский университет
В работах последних лет показана важная роль ионов кальция в регуляции различных форм клеточной активности. Выступая в качестве вторичных мессенджеров, ионы кальция опосредуют действие многих биологически активных веществ, в том числе митогенов, факторов роста, некоторых гормонов [7 ]. Экспериментально доказано, что подъем внутриклеточного уровня кальция является необходимым ранним этапом в активации, процессах пролиферации и дифференцировке лимфоидных клеток [2 ].
Кальциевый ответ служит критерием функциональной активности лимфоцитов и может быть использован для оценки их чувствительности к воздействию различных лекарственных препаратов [4 ]. В то же время кальциевый обмен в лимфобластах практически не изучен.
Детальное изучение закономерностей кальциевого обмена стало возможным после создания нового поколения флуоресцентных индикаторов, которые позволяют регистрировать изменения концентрации свободного кальция в цитоплазме малых клеток. Ацетоксиметильный эфир флуоресцентного зонда FURA-2 (FURA-2/AM) — гидрофобное соединение, легко проникающее внутрь клетки через плазматическую мембрану. В цитоплазме под действием эстераз эфирные связи легко разрываются и образуется FURA-2, который обладает высоким сродством к кальцию и уже не может выйти из клетки или проникнуть внутрь субклеточных мембранных структур. При связывании с кальцием интенсивность флуоресценции FURA-2 увеличивается в несколько раз [8 ].
Целью данной работы явились разработка метода и определение уровня ионов кальция в лимфобластах костного мозга с помощью зонда FURA-2/AM ("Calbiochem").
Материалы и методы. Для получения суспензии лимфобластов использовали пунктат костного мозга детей, больных острым лимфобластным лейкозом. Пунктат объемом
0,5—1,5 мл помещали в пробирку с 0,2 мл раствора следующего состава: 0,9% NaCI, 10—20 мМ фосфатного буфера, 5% ЭД-ТА, pH 7,2—7,4 и ресуспендировали. Полученную суспензию переводили в IIEPES-буфер (140 мМ NaCI, 5 мМ KCl, 1 мМ
MgS04, 5 мМ Glu, 1 мМ Na2HP04, 1 мМ СаС12, 10 мМ 1IEPES, рП среды 7,35, буфер приготовлен при комнатной температуре) и дважды отмывали, центрифугируя при 1500 g в течение 15 мин при комнатной температуре [3]. Затем определяли количество клеток с помощью камеры Горяева. Концентрацию клеток доводили до 15 млн/мл, разводя суспензию IIEPES-буфером.
Включение в клетки флуоресцентного зонда FURA-2/ДМ проводили по следующему методу [1]. После 20-минутной инкубации клеток при 37°С с раствором зонда в конечной концентрации 3 мкМ клетки отмывали и ресуспендировали в IIEPES-буфере. После этого 2 мл клеточной суспензии (3 млн/мл) помещали в ячейку спектрофлуориметра "Hitachi МРЕ-3", термо-статируемую при 37°С. Длина оптического пути составляет 1 см, ширина щели 8нм 8нм. Длина волн возбуждения 340 и 385 нм, регистрации — 500 нм. Спектры возбуждения снимались через 2—3 мин после добавления исследуемых веществ — время, за которое флуоресценция при длине волны 500 нм выходит на плато, т.е. процесс становится стационарным.
Внутриклеточное содержание ионов кальция рассчитывали по формуле:
(Ca++)i=K;((R-R0)/(k1-R).
где R — соотношение F340/F385 для исследуемого образца (F340 и F.385 — интенсивность флуоресценции при длинах волн возбуждения 340 и 385 нм соответственно); Ro — соотношение F340/F385, определяемое после добавления 5 мм MnCh, когда концентрация кальция минимальна; Ri — отношение F340/F385 при насыщении зонда кальцием, которое определяли после разрушения клеток дигитонином ("Sigma", 40 мкМ); Кд — равновесная константа диссоциации комплекса FURA-2 с ионами кальция, равная 225 нм при 37°С [9].
Поскольку концентрация кальция пропорциональна отношению концентраций свободной и связанной форм зонда, изменения мутности среды, общая концентрация зонда в рабочем объеме, интенсивность возбуждающего света и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение составляющих спектра, не влияют на конечный результат [5].
Результаты. Базальный уровень кальция в лимфобластах составил 120±8 нМ (п=6). Добавление к суспензии клеток соединения А23187 вызывает резкое увеличение входа кальция, концентрация которого достигает 300—350 нМ. Действие кальциевого ионофора А23187 основано на том, что, включаясь в состав плазматической мембраны и становясь интегральным белком, он образует в мембране различных типов клеток кальциевые каналы. А23187 используется в сочетании с митоге-нами для повышения эффективности стимуляции. Определение Са^-ответа клеток на добавление ионофора А23187 служит контролем для оценки барьерной функции плазматических мембран и активности выделенных клеток.
В настоящее время в плазматической мембране клеток обнаружены два типа кальциевых каналов: первый тип — потенциалзависимые, "быстрые" каналы, открытие которых сопряжено с изменением мембранного потенциала; второй тип — хемочув-ствительные, рецепторуправляемые, "медленные" Са^-каналы, сопряженные с ГТФ-связывающими белками плазматической мембраны.
Для того, чтобы проверить, содержат ли мембраны лимфобластов 1-й тип кальциевых каналов, клетки помещали в среду, содержащую 118 мМ КС1 и 28 мМ ЫаС1. По своему составу она изото-нична физиологическому раствору, но повышенное содержание КС1 (118 мМ вместо 4 мМ) вызывает деполяризацию плазматической мембраны клеток [10]. Установлено, что в этих условиях уровень кальция в лимфобластах практически не изменяется, что может свидетельствовать об отсутствии в мембране лимфобластов потенциалзависимых кальциевых каналов.
Активность рецепторуправляемых Са^-каналов регулируется различными гормонами, митогенами и определяется присутствием на мембране клеток специфических рецепторов этих веществ [6 ].
Добавление к лимфобластам декстрансульфата (0,1 мг/мл), Соп А (25 мкг/мл) вызвало повышение содержания кальция, регистрируемое по увеличению флуоресценции РШ1А-2. Возрастание [Са^] начинается через 15 с и достигает максимума через 2—3 мин после внесения препаратов, затем флуоресценция медленно падает (в течение 20 мин наблюдения) до уровня, несколько повышенного по сравнению с исходным. Максимальная концентрация кальция при действии ДФ составляет 181±11нМ (п=4), Соп А — 230±15нМ (п=4), т.е. возрастает примерно в 1,5 — 2 раза соответственно.
Чтобы выяснить, зависит ли Са^-ответ лимфобластов на митогены от концентрации внеклеточно-
| |
го кальция, мы сопоставляли изменения [Са ]| лимфобластов, индуцированных митогеном в стандартной среде, содержащей 1 мМ СаСЬ, и в бес-кальциевом буфере. Установлено, что в бескаль-циевой среде максимальный подъем уровня кальция достоверно ниже.
Таким образом, повышение содержания внутриклеточного кальция под действием изученных соединений происходит как за счет увеличения входа кальция из внеклеточного пространства, так и вследствие мобилизации кальция из внутриклеточных депо (ЭПР, митохондрии).
Полученные результаты согласуются с данными других авторов, показавших способность В- (де-кстрансульфат) и Т-митогенов (Соп А) вызывать пролиферацию лимфобластов [2 ].
Определение Са^-ответа лимфобластов может использоваться для экспресс-оценки их чувствительности к действию митогенов и различных лекарственных препаратов (циклоспорин А, кортикостероиды) , реализующих свое действие через систему вторичных мессенджеров.
ЛИГЕРЛТУРЛ
1. Гуковская А.С., Зинченко П.П. II Биол. мембраны — 1989.
— Т. 3, № 9. — С. 920—930.
2. Иммунология / Под ред. У. Пола — М.: Медицина —
1987. — Т. 1 — С. 413—460.
3. Лимфоциты. Методы // Под ред. Дж. Клаусса — М.: Мир. — 1990.
4. Молотковская И.М., Разинков В.И., Молотковский Ю.Г., Бергельсон Л.Д. II Биол. мембраны — 1992. — № 1. — С. 32—39.
5. Орлов С.П., Лабас Ю.Л. II Биол. мембраны. ■— 1989. — Т. 6. — № 9. — С. 901—938.
6. Сергеев П.П., Духанин А.С. II Фармакол. токсикол. —
1988. — № 4. — С. 4—21.
7. Сергеев П.В., Шимановский П.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. — М.: Медицина. — 1987.
8. Crynkiewicz Gr., Poenie М., Tsien R.Y. II J. Biol. Chem. — 1985. — Vol. 260, — № 6. — P. 3440—3450.
9. Malgaroli F., Milani D., Meldolesi J. II J.Cell Biol. — 1987.
— Vol. 105. — P. 2145—55.
10. Sumimoto K., Kuriyanw H. II Pflugers Arch. — 1986. — Vol. 406. — P. 173—180.
Поступила 30.01.93.
УДК 616-006.04-059-092.9 И.Ю. Кубасова, З.П. Софьина
ГОРМОНАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА КАК СТИМУЛЯТОРЫ ИЛИ ИНГИБИТОРЫ РОСТА ОПУХОЛЕЙ В КОМБИНАЦИИ С ЦИТОСТАТИКАМИ
ПИИ экспериментальной диагностики и терапии опухоли
Известное положение о большей чувствительности к цитостатикам опухолей с высоким уровнем пролиферации предполагает, что предварительная стимуляция пролиферации должна повысить цито-токсический эффект противоопухолевых препаратов. Это положение использовано рядом исследователей для разработки схемы лечения гормонозависимых опухолей, состоящей из стимулирующего пролиферацию воздействия физиологических доз гормонов с последующим введением цитостатиков [9 ]. В большинстве случаев исследование проводили на раке молочной железы, где в качестве стимулятора использовали эстрогены. Однако при этом были получены неоднозначные результаты. Наряду с сообщениями об успехе такого комбинированного воздействия в большинстве случаев не удалось достичь желаемого эффекта [1, 7]. Причины разноречивости результатов оставались неясными. В связи с этим в настоящем исследовании было подробно экспериментально изучено комбинированное воздействие на опухоль стимуляторов клеточного деления и цитостатиков.
