CC BY
13
В качестве архитектуры тканеинженерного каркаса выбран высокопористый губчатый матрикс на основе ацетата целлюлозы, полученный методом лиофилиза-ции. В качестве растворителя использован диоксан. Введение электропроводящей компоненты осуществлено повторной лиофилизацией полимерной основы после импрегнации филлера в водном растворе PEEDOT:PSS. Полученные полимерные материалы подвергнуты модификации в парах сшивателя.
Разработанные материалы охарактеризованы методами электронной микроскопии с контролем процесса деформации и БЭТ; исследованы физико-механические и электропроводящие характеристики. Установлено, что прочность и электропроводность материалов соответствует диапазону значений, требуемых для эффективной пролификации клеточных структур. Работа выполнена при поддержке Гранта РНФ № 21-13-00321.
Литература:
1. Shaabani A., Sedghi R. Polymer. 2021. V. 223. P. 123694.
масштабная экспансия функционально активной популяции nk-клеток для иммунотерапии онкологических заболеваний
М.И. Лукашина, П.Н. Вихрева, М.Д. Моллаев, А.В. Посвятенко, А.В. Кибардин, М.А. Масчан, С.С. Ларин
ФГБУ НМИЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия.
e-mail: mlukashina@mail.ru
Ключевые слова: NK-клетки, получение, культивирование, функциональная активность.
Иммунотерапия, наряду с хирургией, химио- и радиотерапией, подтвердила свою эффективность в лечении злокачественных опухолей. Иммунотерапия использует различные средства, прямого и опосредованного действия, для стимуляции иммунного ответа против патологических клеток. Одним из направлений иммунотерапии является адоптивный перенос иммунокомпетентных клеток в организм пациента. Для этой цели чаще всего используют Т- и NK- клетки. У NK-клеток имеется ряд преимуществ, важнейшим из которых является отсутствие необходимости предварительной стимуляции для элиминации клеток-мишеней. Иммунотерапия NK-клетками предполагает введение пациенту значительных количеств клеток. До недавнего времени это было ключевым ограничением. Сейчас для получения необходимого количества клеток используют два основных подхода: с использованием и без использования фидерных клеток.
Источниками для масштабного производства NK-клеток являются: периферическая кровь, пуповинная кровь, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и клеточные линии. Самый распространенный источник для культивирования NK-клеток — это периферическая кровь, которую использовали для дальнейшей работы. Выделение мононуклеарной фракции клеток проводили в градиенте плотности фиколла, а также применяли магнитную сепарацию. Полученную клеточную фракцию культивировали в присутствии фидерной линии K562-mIL15-mIL21 -4-1BBL в течении 3 недель. В результате культивирования были получены значительные
количества ЫКклеток: увеличение от исходного количества от 50000 до 100000 раз, содержание ЫКклеток в конечной популяции составляло от 80 до 98%.
Оценку функциональной активности полученных клеток проводили в прямом цитотоксическом тесте с флуоресцентной визуализацией против опухолевых клеточных линий: К562, меланомы, нейробластомы. В цитотоксическом тесте наблюдали 100% гибель мишеней через 48-72 часа кокультивирования. Кроме того, с помощью проточного цитометрического анализа проводили оценку маркера дегрануляции (00107а) против клеточной линии К562. При кокультивировании 1\1К-клеток и клеток К562, маркер дегрануляции увеличивался в среднем в 4 раза по сравнению с интактными клетками.
Для оценки возможности хранения полученных функциональных ЫК-клеток, их криоконсервировали. Функциональную активность, после размораживания, проверяли в тестах аналогичных свежеприготовленным клеткам. Все характеристики сохранялись.
Таким образом разработан и апробирован протокол экспансии и масштабнойнаработки ЫК-клеток, пригодных для клинического применения.
генная терапия наоснове микрорнк для gna01-энцефал0патии с доминантно-негативным вариантом c.607 g>a
Е.А. Лунев1' 2' 3, Н.В. Клементьева1, 2,
И.М. Савченко2, А.А. Карань2, М.А. Дженкова1' 2,
Т.В. Егорова1' 2, М.В. Бардина1' 2' 3
1 Лаборатория моделирования и терапии наследственных заболеваний, Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
2 ООО «Марлин Биотех», Сочи, Россия
3 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
e-mail: e.lunev.marlin@gmail.com
Ключевые слова: орфанные заболевания, GNAO1-энцефалопатия, генная терапия, доминантно-негативные мутации, микроРНК.
GNAO1-энцефалопатия — орфанное неврологическое заболевание, вызванное мутациями в гене GNAO1. GNAO1 кодирует альфа-субъединицу G-белка (Gao), важную для функционирования центральной нервной системы. Заболевание проявляется у детей младенческого возраста в виде эпилепсии и/или двигательной дисфункции с задержкой развития. Фенотипическая гетерогенность указывает на необходимость применения подходов персонализированной медицины. Один из наиболее частых и тяжело протекающих вариантов GNAO1 -энцефалопатии вызван мутацией GNAO1 c.607 G>A (G203R). Предположительно, мутация имеет доминантно-негативное проявление, хотя механизм нарушения функции белка Gao в нейронах мало изучен. В настоящей работе мы уточнили фенотипическое эффект мутантного белка Gao-G203R в клеточной культуре и разработали подход персонализированной генной терапии в отношении данного патогенного варианта. Для этого в первичную культуру нейронов мыши доставляли с помощью аденоассоциированных вирусов (ААВ) би-цистронные векторы, экспрессирующие Gao с мутацией или дикого типа и репортерный белок. Мы обнаружили, что Gao-G203R приводит к повышению общего уровня
внутриклеточного цАМФ—одного из важнейших сигнальных мессенджеров нейронов, в то время как оверэкспрес-сия здоровой формы Gao ведет к снижению концентрации цАМФ относительно контроля. Методом визуализации внутриклеточного кальция мы выявили сниженный ответ на стимуляцию баклофеном нейрональной культуры, экспрессирующей мутантный белок. Полученные нами результаты подтверждают гипотезу о доминантно-негативном проявлении мутации c.607 G>A. Исходя из токсичного проявления Gao-G203R в нейронах, ранее нами был предложен генотерапевтический подход, направленный на аллель-селективное подавление транскрипта GNAO1 c.607 G>A с помощью РНК-интерференции. По результатам скрининга были выбраны перспективные эффекторы РНК-интерференции, демонстрирующие высокую аллель-специфичность и эффективность супрессии в отношении мутантной мРНК. Последовательности эффекторов использовали для создания искусственных микроРНК в составе экспрессионных ААВ-векторов. Преимущество микроРНК заключается в возможности тканеспецифической экспрессии и сниженных побочных эффектах в организме. Результаты Вестерн-блота и аллель-специфической кПЦР показали, что доставка кан-дидатных ААВ-микроРНК в клетки снижает экспрессию мутантного белка Gao-G203R, сохраняя продукцию Gao дикого типа на высоком уровне. Таким образом, генная терапия с использованием микроРНК является перспективным подходом для GNAOI-энцефалопатии с вариантом c.607 G>A, который характеризуется доминантно-негативным проявлением.
cd133 как маркер раковых стволовых клеток колоректальной аденокарциномы: молекулярные особенности и регуляция экспрессии
А.Ю. Лупатов1, А.М. Гисина1, Я.С. Ким1, С.Е. Новикова1, Д.М. Поташникова2, Л.К. Курбатов1, И.В. Холоденко1, А.В. Творогова2, К.Н. Ярыгин1
1 НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.
e-mail: alupatov@mail.ru
Ключевые слова: раковые стволовые клетки, колорек-тальная аденокарцинома, CD133, CEACAM5, TRIM28, протеомное профилирование, транскриптомный анализ, CRISPR-Cas9 нокаут.
Раковые стволовые клетки (РС) представляют собой наиболее злокачественную субпопуляцию опухолевых клеток, ответственную за метастазирование и рецидивы заболевания. В случае колоректального рака широко используемым маркером этой субпопуляции является CD133 (проминин-1). С целью выявления новых биомаркеров, ассоциированных с экспрессией CD133, мы провели сравнительное протеомное профилирование CD133+ и CD133- субпопуляций, выделенных с помощью FACS из опухолевого материала 5 пациентов. В результате LC-MS/MS анализа было идентифицировано 29 белков с повышенной не менее чем в 2,5 раза экспрессией в CD133+ клетках. Среди них CEACAM5 имел повышенную экспрессию во всех CD133+ образцах. Дополнительное исследование методом проточной
цитометрии опухолевых клеток от 22 пациентов показало четкую ассоциацию между CD133 и CEACAM5, экспрессия которого, была увеличена в 2-20 раз в субпопуляции РСК у всех пациентов. Чтобы выяснить является ли CD133 регулятором экспрессии CEACAM5 мы получили клоны линий колоректального рака Caco-2 and HT-29, нокаутированные по CD133. Однако нокаут этого гена не менял средний уровень экспрессии CEACAM5 хотя и достоверно увеличивал вариативность его присутствия на мембране клеток. Полученные результаты показывают, что CD133 вряд ли непосредственно регулирует экспрессию CEACAM5, но, возможно, оказывает влияние на его мембранное расположение.
С целью выявления молекулярных регуляторов экспрессии CD133 был проведен сравнительный протеом-ный и транскриптомный анализ CD133+ и CD133- клеток Caco-2, HT-29, а также гепатоцелюлярной карциномы HUH7. Число дифференциально экспрессирующихся белков (отличающихся минимум в 2 раза) было 35 для HT-29, 39 для Caco-2; и 75 для HUH7. Транскриптомный анализ выявил 10 дифференциальных транскриптов для линии HT-29, 71 для линии Caco-2, 66 для линии HUH7. CD1 33 был единственным транскриптом, дифференциально экспрессирующимся во всех 3 линиях. Полученные данные были объединены и проанализированы с использованием платформы «GeneXplain» для поиска молекулярных ключевых регуляторов CD133. В результате in silico анализа был сформирован список из 16 потенциальных ключевых регуляторов (транскрипционных факторов), предположительно участвующих в регуляции экспрессии CD133, среди которых, TRIM28 получил максимальный рейтинг. Нокаут TRIM28 методом геномного редактирования с использованием CRISPR-Cas9 практически полностью подавлял экспрессию CD133 в клетках CaCo-2. Таким образом, подтверждена роль TRIM28 в качестве молекулярного регулятора экспрессии CD133. Эта молекула может стать потенциальной мишенью для терапии опухолей, направленной против РСК. Работа выполнена в рамах Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122022800499-5).
эритропоэтин как активатор
аутофагии в мезенхимных стволовых
клетках
А.П. Лыков1, 2, М.А. Суровцева1, Н.А. Бондаренко1,
И.И. Ким1, Ю.С. Гаврилова1, О.В. Повещенко1
1 НИИКЭЛ-филиал ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НИИТ Минздрава России, Новосибирск, Россия
e-mail: aplykov2@mail.ru
Ключевые слова: эритропоэтин, мезенхимные стволовые
клетки, аутофагия.
Тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма, включая мезенхимные стволовые/стромаль-ные клетки (МСК), вовлечены в процесс регенерации повреждений органов и тканей. МСК рассматриваются как альтернативный способ лечения при различных дегенеративных процессах в органах и тканях [1]. К недостаткам лечения дегенеративных процессов с использованием МСК можно отнести кратковременность терапевтического потенциала стволовых клеток, как следствие гибели в условиях неблагоприятного микроокружения [2].
