CC BY
6
138
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
внутриклеточного цАМФ—одного из важнейших сигнальных мессенджеров нейронов, в то время как оверэкспрес-сия здоровой формы Gao ведет к снижению концентрации цАМФ относительно контроля. Методом визуализации внутриклеточного кальция мы выявили сниженный ответ на стимуляцию баклофеном нейрональной культуры, экспрессирующей мутантный белок. Полученные нами результаты подтверждают гипотезу о доминантно-негативном проявлении мутации c.607 G>A. Исходя из токсичного проявления Gao-G203R в нейронах, ранее нами был предложен генотерапевтический подход, направленный на аллель-селективное подавление транскрипта GNAO1 c.607 G>A с помощью РНК-интерференции. По результатам скрининга были выбраны перспективные эффекторы РНК-интерференции, демонстрирующие высокую аллель-специфичность и эффективность супрессии в отношении мутантной мРНК. Последовательности эффекторов использовали для создания искусственных микроРНК в составе экспрессионных ААВ-векторов. Преимущество микроРНК заключается в возможности тканеспецифической экспрессии и сниженных побочных эффектах в организме. Результаты Вестерн-блота и аллель-специфической кПЦР показали, что доставка кан-дидатных ААВ-микроРНК в клетки снижает экспрессию мутантного белка Gao-G203R, сохраняя продукцию Gao дикого типа на высоком уровне. Таким образом, генная терапия с использованием микроРНК является перспективным подходом для GNAOI-энцефалопатии с вариантом c.607 G>A, который характеризуется доминантно-негативным проявлением.
CD133 КАК МАРКЕР РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ
А.Ю. Лупатов1, А.М. Гисина1, Я.С. Ким1, С.Е. Новикова1, Д.М. Поташникова2, Л.К. Курбатов1, И.В. Холоденко1, А.В. Творогова2, К.Н. Ярыгин1
1 НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: раковые стволовые клетки, колорек-тальная аденокарцинома, CD133, CEACAM5, TRIM28, протеомное профилирование, транскриптомный анализ, CRISPR-Cas9 нокаут.
Раковые стволовые клетки (РС) представляют собой наиболее злокачественную субпопуляцию опухолевых клеток, ответственную за метастазирование и рецидивы заболевания. В случае колоректального рака широко используемым маркером этой субпопуляции является CD133 (проминин-1). С целью выявления новых биомаркеров, ассоциированных с экспрессией CD133, мы провели сравнительное протеомное профилирование CD133+ и CD133- субпопуляций, выделенных с помощью FACS из опухолевого материала 5 пациентов. В результате LC-MS/MS анализа было идентифицировано 29 белков с повышенной не менее чем в 2,5 раза экспрессией в CD133+ клетках. Среди них CEACAM5 имел повышенную экспрессию во всех CD133+ образцах. Дополнительное исследование методом проточной
цитометрии опухолевых клеток от 22 пациентов показало четкую ассоциацию между CD133 и CEACAM5, экспрессия которого, была увеличена в 2-20 раз в субпопуляции РСК у всех пациентов. Чтобы выяснить является ли CD133 регулятором экспрессии CEACAM5 мы получили клоны линий колоректального рака Caco-2 and HT-29, нокаутированные по CD133. Однако нокаут этого гена не менял средний уровень экспрессии CEACAM5 хотя и достоверно увеличивал вариативность его присутствия на мембране клеток. Полученные результаты показывают, что CD133 вряд ли непосредственно регулирует экспрессию CEACAM5, но, возможно, оказывает влияние на его мембранное расположение.
С целью выявления молекулярных регуляторов экспрессии CD133 был проведен сравнительный протеом-ный и транскриптомный анализ CD133+ и CD133- клеток Caco-2, HT-29, а также гепатоцелюлярной карциномы HUH7. Число дифференциально экспрессирующихся белков (отличающихся минимум в 2 раза) было 35 для HT-29, 39 для Caco-2; и 75 для HUH7. Транскриптомный анализ выявил 10 дифференциальных транскриптов для линии HT-29, 71 для линии Caco-2, 66 для линии HUH7. CD1 33 был единственным транскриптом, дифференциально экспрессирующимся во всех 3 линиях. Полученные данные были объединены и проанализированы с использованием платформы «GeneXplain» для поиска молекулярных ключевых регуляторов CD133. В результате in silico анализа был сформирован список из 16 потенциальных ключевых регуляторов (транскрипционных факторов), предположительно участвующих в регуляции экспрессии CD133, среди которых, TRIM28 получил максимальный рейтинг. Нокаут TRIM28 методом геномного редактирования с использованием CRISPR-Cas9 практически полностью подавлял экспрессию CD133 в клетках CaCo-2. Таким образом, подтверждена роль TRIM28 в качестве молекулярного регулятора экспрессии CD133. Эта молекула может стать потенциальной мишенью для терапии опухолей, направленной против РСК. Работа выполнена в рамах Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122022800499-5).
ЭРИТРОПОЭТИН КАК АКТИВАТОР
АУТОФАГИИ В МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТКАХ
А.П. Лыков1, 2, М.А. Суровцева1, Н.А. Бондаренко1,
И.И. Ким1, Ю.С. Гаврилова1, О.В. Повещенко1
1 НИИКЭЛ-филиал ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НИИТ Минздрава России, Новосибирск, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: эритропоэтин, мезенхимные стволовые
клетки, аутофагия.
Тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма, включая мезенхимные стволовые/стромаль-ные клетки (МСК), вовлечены в процесс регенерации повреждений органов и тканей. МСК рассматриваются как альтернативный способ лечения при различных дегенеративных процессах в органах и тканях [1]. К недостаткам лечения дегенеративных процессов с использованием МСК можно отнести кратковременность терапевтического потенциала стволовых клеток, как следствие гибели в условиях неблагоприятного микроокружения [2].
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
