CC BY
5
остеобластов человека в ходе остеогенной дифференци-ровки in vitro.
Протеомный анализ проводили при помощи тан-демной масс-спектрометрии с ионной подвижностью. В литературе все еще нет примеров сравнения разных подходов протеомики-дробовика, которые можно реализовать на этой платформе, поэтому в рамках поставленной биологической задачи мы провели сравнение data dependent (DDA) и data independent acquisition (DIA) подходов протеомного анализа.
Методы DIA-протеомики оказались на порядок более эффективными по сравнению с классическим DDA-подходом. Однако все подходы позволили выделить три четких кластера — ИКК в контроле, ИКК в дифференци-ровке и остеобласты.
Патологическая остеогенная дифференцировка ИКК значительно отличается от нормальной остео-генной дифференцировки при формировании костной ткани. Описанные нами различия представляются перспективными для поиска подходов для терапии КАС. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ номер 18-14-00152.
иммунофизиологические механизмы регенерации ран в условиях применения супернатанта пробиотических бактерий bifidobacterium bifidum
П.Б. Лозовая, Е.Д. Полянских, Е.Г. Костоломова
ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет, Тюмень, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ранозаживляющее средство «Cellgel», ре-паративная регенерация, апоптоз.
На 20 половозрелых кроликах — самцах проведен эксперимент, целью которого является изучение методом иммуногистохимии индекса пролиферации (Ki-67-позитивные клетки) и готовности к апоптозу (С095-позитивные клетки) клеток эпидермиса и дермы в условиях применения супернатанта пробиотических бактерий Bifidobacterium bifidum. Понимание роли апоптоза в образовании рубцовой ткани может способствовать поиску новых подходов к терапии, связанной с воздействием на иммунные механизмы регуляции гибели клеток.
Животные были разделены на контрольную и экспериментальную группы. Под общим обезболиванием на спине животного по паравертебральной линии формировали инфицированные раны мягких тканей, через 3-5 суток начинали лечение. В группе контроля лечение проводили традиционным методом. В экспериментальной группе применяли супернатант Bifidobacterium bifidum. С 1 по 25 сутки под местной анестезией выполняли биопсию раны. Иммуногистохимические реакции проводили в парафиновых срезах с использованием первичных антител Ki 67, CD95 / Apo 1, (DAKO) и системы визуализации En vision. Ядра докрашивали гематоксилином. У контрольной группы закрытие раневого дефекта происходило к 20 суткам с формированием грубого соединительнотканного рубца и сохранением дистрофически — дегенеративных изменений подкожной клетчатки и мышц, дегенеративных изменений нервных стволиков. В экспериментальной группе на 10 сутки эксперимента наблюдается полная эпителизация раневого дефекта с его оволосением, гистологическая картина
эпителизации с сохранением всех функционирующих структур, что характеризует потенцирование суперна-тантом Bifidobacterium bifidum механизмов физиологической репаративной регенерации. При иммуногистохи-мическом исследовании до начала лечения количество клеток экспрессирующих маркер CD95+ и Ki67+ одинаково во всех группах. В экспериментальной группе на 1-3 сутки наблюдается рост носителей CD95+ с последующим его снижением, начиная с 3-5 суток. С 1 суток, наблюдается рост носителей маркера Ki67+и продолжается до 15 суток. На 3-5 сутки наблюдаем «перекрест маркеров», что, на наш взгляд, характеризует переход первой фазы раневого процесса во вторую. В группе контроля наблюдается снижение CD95+. На 5 сутки наблюдается некоторый всплеск уровня Ki67+ с дальнейшим его уменьшением практически до нуля. В эпидермисе молодых рубцов обнаруживаются активные процессы пролиферации. Метка локализуется в ядрах клеток ба-зального и шиповатого слоя и округлых клетках, которые имеются в сосудах и между коллагеновыми волокнами зоны роста. В контрольной группы закрытие раневого дефекта происходит к 20 суткам, в дерме метки нет.
Супернатант пробиотических бактерий Bifidobacterium bifidum является индуктором апоптоза в первую фазу раневого процесса. Во вторую и третью фазы данное вещество индуцирует механизмы физиологической репара-тивной регенерации.
перспективный электропроводящий материал для остеоиндукции на основе ацетат целлюлозы с peedot:pss
К.И. Луканина, Н.А. Шарикова, П.М. Готовцев, Т.Е. Григорьев
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: тканевая инженерия, аналог ЭЦМ на основе природных полимеров, электропроводящие материалы, PEEDOT:PSS, ацетат целлюлозы.
Как известно для эффективной пролиферации и адгезии остеобластов предпочтительнее использовать нетканый высокопористый материал, обладающей свойством электропроводности [1]. Архитектура полимерной основы может варьироваться в зависимости от типа и локализации замещаемой нативной ткани. В данной работе в качестве полимерной основы выбран диацетат целлюлозы, природный полимер, обладающий требуемыми прочностными характеристиками и биосовместимостью. В качестве электропроводящего наполнителя выбран PEEDOT:PSS, представляющий собой полимерную смесь двух иономеров. Один компонент в этой смеси состоит из полистиролсульфоната натрия, который представляет собой сульфированный полистирол. Часть сульфониль-ных групп депротонирована и несет отрицательный заряд. Другой компонент — PEDOT, несет положительные заряды и основан на политиофене. Получение материалов на основе полистиролсульфоната ограничено избирательной растворимостью в органических растворителях и технологическими ограничениями в переработке данного полимера. Отдельной задачей является сшивка PEEDOT:PSS, так полимер достаточно быстро растворяется в водных растворах. Однако в работе предложен метод введения данного электропроводящего компонента в полимерную базу.
В качестве архитектуры тканеинженерного каркаса выбран высокопористый губчатый матрикс на основе ацетата целлюлозы, полученный методом лиофилиза-ции. В качестве растворителя использован диоксан. Введение электропроводящей компоненты осуществлено повторной лиофилизацией полимерной основы после импрегнации филлера в водном растворе PEEDOT:PSS. Полученные полимерные материалы подвергнуты модификации в парах сшивателя.
Разработанные материалы охарактеризованы методами электронной микроскопии с контролем процесса деформации и БЭТ; исследованы физико-механические и электропроводящие характеристики. Установлено, что прочность и электропроводность материалов соответствует диапазону значений, требуемых для эффективной пролификации клеточных структур. Работа выполнена при поддержке Гранта РНФ № 21-13-00321.
Литература:
1. Shaabani A., Sedghi R. Polymer. 2021. V. 223. P. 123694.
масштабная экспансия функционально активной популяции nk-клеток для иммунотерапии онкологических заболеваний
М.И. Лукашина, П.Н. Вихрева, М.Д. Моллаев, А.В. Посвятенко, А.В. Кибардин, М.А. Масчан, С.С. Ларин
ФГБУ НМИЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия.
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: NK-клетки, получение, культивирование, функциональная активность.
Иммунотерапия, наряду с хирургией, химио- и радиотерапией, подтвердила свою эффективность в лечении злокачественных опухолей. Иммунотерапия использует различные средства, прямого и опосредованного действия, для стимуляции иммунного ответа против патологических клеток. Одним из направлений иммунотерапии является адоптивный перенос иммунокомпетентных клеток в организм пациента. Для этой цели чаще всего используют Т- и NK- клетки. У NK-клеток имеется ряд преимуществ, важнейшим из которых является отсутствие необходимости предварительной стимуляции для элиминации клеток-мишеней. Иммунотерапия NK-клетками предполагает введение пациенту значительных количеств клеток. До недавнего времени это было ключевым ограничением. Сейчас для получения необходимого количества клеток используют два основных подхода: с использованием и без использования фидерных клеток.
Источниками для масштабного производства NK-клеток являются: периферическая кровь, пуповинная кровь, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и клеточные линии. Самый распространенный источник для культивирования NK-клеток — это периферическая кровь, которую использовали для дальнейшей работы. Выделение мононуклеарной фракции клеток проводили в градиенте плотности фиколла, а также применяли магнитную сепарацию. Полученную клеточную фракцию культивировали в присутствии фидерной линии K562-mIL15-mIL21 -4-1BBL в течении 3 недель. В результате культивирования были получены значительные
количества ЫКклеток: увеличение от исходного количества от 50000 до 100000 раз, содержание ЫКклеток в конечной популяции составляло от 80 до 98%.
Оценку функциональной активности полученных клеток проводили в прямом цитотоксическом тесте с флуоресцентной визуализацией против опухолевых клеточных линий: К562, меланомы, нейробластомы. В цитотоксическом тесте наблюдали 100% гибель мишеней через 48-72 часа кокультивирования. Кроме того, с помощью проточного цитометрического анализа проводили оценку маркера дегрануляции (00107а) против клеточной линии К562. При кокультивировании 1\1К-клеток и клеток К562, маркер дегрануляции увеличивался в среднем в 4 раза по сравнению с интактными клетками.
Для оценки возможности хранения полученных функциональных ЫК-клеток, их криоконсервировали. Функциональную активность, после размораживания, проверяли в тестах аналогичных свежеприготовленным клеткам. Все характеристики сохранялись.
Таким образом разработан и апробирован протокол экспансии и масштабнойнаработки ЫК-клеток, пригодных для клинического применения.
генная терапия наоснове микрорнк для gna01-энцефал0патии с доминантно-негативным вариантом c.607 g>a
Е.А. Лунев1' 2' 3, Н.В. Клементьева1, 2,
И.М. Савченко2, А.А. Карань2, М.А. Дженкова1' 2,
Т.В. Егорова1' 2, М.В. Бардина1' 2' 3
1 Лаборатория моделирования и терапии наследственных заболеваний, Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
2 ООО «Марлин Биотех», Сочи, Россия
3 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: орфанные заболевания, GNAO1-энцефалопатия, генная терапия, доминантно-негативные мутации, микроРНК.
GNAO1-энцефалопатия — орфанное неврологическое заболевание, вызванное мутациями в гене GNAO1. GNAO1 кодирует альфа-субъединицу G-белка (Gao), важную для функционирования центральной нервной системы. Заболевание проявляется у детей младенческого возраста в виде эпилепсии и/или двигательной дисфункции с задержкой развития. Фенотипическая гетерогенность указывает на необходимость применения подходов персонализированной медицины. Один из наиболее частых и тяжело протекающих вариантов GNAO1 -энцефалопатии вызван мутацией GNAO1 c.607 G>A (G203R). Предположительно, мутация имеет доминантно-негативное проявление, хотя механизм нарушения функции белка Gao в нейронах мало изучен. В настоящей работе мы уточнили фенотипическое эффект мутантного белка Gao-G203R в клеточной культуре и разработали подход персонализированной генной терапии в отношении данного патогенного варианта. Для этого в первичную культуру нейронов мыши доставляли с помощью аденоассоциированных вирусов (ААВ) би-цистронные векторы, экспрессирующие Gao с мутацией или дикого типа и репортерный белок. Мы обнаружили, что Gao-G203R приводит к повышению общего уровня
