CC BY
7
внутриклеточного цАМФ—одного из важнейших сигнальных мессенджеров нейронов, в то время как оверэкспрес-сия здоровой формы Gao ведет к снижению концентрации цАМФ относительно контроля. Методом визуализации внутриклеточного кальция мы выявили сниженный ответ на стимуляцию баклофеном нейрональной культуры, экспрессирующей мутантный белок. Полученные нами результаты подтверждают гипотезу о доминантно-негативном проявлении мутации c.607 G>A. Исходя из токсичного проявления Gao-G203R в нейронах, ранее нами был предложен генотерапевтический подход, направленный на аллель-селективное подавление транскрипта GNAO1 c.607 G>A с помощью РНК-интерференции. По результатам скрининга были выбраны перспективные эффекторы РНК-интерференции, демонстрирующие высокую аллель-специфичность и эффективность супрессии в отношении мутантной мРНК. Последовательности эффекторов использовали для создания искусственных микроРНК в составе экспрессионных ААВ-векторов. Преимущество микроРНК заключается в возможности тканеспецифической экспрессии и сниженных побочных эффектах в организме. Результаты Вестерн-блота и аллель-специфической кПЦР показали, что доставка кан-дидатных ААВ-микроРНК в клетки снижает экспрессию мутантного белка Gao-G203R, сохраняя продукцию Gao дикого типа на высоком уровне. Таким образом, генная терапия с использованием микроРНК является перспективным подходом для GNAOI-энцефалопатии с вариантом c.607 G>A, который характеризуется доминантно-негативным проявлением.
CD133 КАК МАРКЕР РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ
А.Ю. Лупатов1, А.М. Гисина1, Я.С. Ким1, С.Е. Новикова1, Д.М. Поташникова2, Л.К. Курбатов1, И.В. Холоденко1, А.В. Творогова2, К.Н. Ярыгин1
1 НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.
e-mail: alupatov@mail.ru
Ключевые слова: раковые стволовые клетки, колорек-тальная аденокарцинома, CD133, CEACAM5, TRIM28, протеомное профилирование, транскриптомный анализ, CRISPR-Cas9 нокаут.
Раковые стволовые клетки (РС) представляют собой наиболее злокачественную субпопуляцию опухолевых клеток, ответственную за метастазирование и рецидивы заболевания. В случае колоректального рака широко используемым маркером этой субпопуляции является CD133 (проминин-1). С целью выявления новых биомаркеров, ассоциированных с экспрессией CD133, мы провели сравнительное протеомное профилирование CD133+ и CD133- субпопуляций, выделенных с помощью FACS из опухолевого материала 5 пациентов. В результате LC-MS/MS анализа было идентифицировано 29 белков с повышенной не менее чем в 2,5 раза экспрессией в CD133+ клетках. Среди них CEACAM5 имел повышенную экспрессию во всех CD133+ образцах. Дополнительное исследование методом проточной
цитометрии опухолевых клеток от 22 пациентов показало четкую ассоциацию между CD133 и CEACAM5, экспрессия которого, была увеличена в 2-20 раз в субпопуляции РСК у всех пациентов. Чтобы выяснить является ли CD133 регулятором экспрессии CEACAM5 мы получили клоны линий колоректального рака Caco-2 and HT-29, нокаутированные по CD133. Однако нокаут этого гена не менял средний уровень экспрессии CEACAM5 хотя и достоверно увеличивал вариативность его присутствия на мембране клеток. Полученные результаты показывают, что CD133 вряд ли непосредственно регулирует экспрессию CEACAM5, но, возможно, оказывает влияние на его мембранное расположение.
С целью выявления молекулярных регуляторов экспрессии CD133 был проведен сравнительный протеом-ный и транскриптомный анализ CD133+ и CD133- клеток Caco-2, HT-29, а также гепатоцелюлярной карциномы HUH7. Число дифференциально экспрессирующихся белков (отличающихся минимум в 2 раза) было 35 для HT-29, 39 для Caco-2; и 75 для HUH7. Транскриптомный анализ выявил 10 дифференциальных транскриптов для линии HT-29, 71 для линии Caco-2, 66 для линии HUH7. CD1 33 был единственным транскриптом, дифференциально экспрессирующимся во всех 3 линиях. Полученные данные были объединены и проанализированы с использованием платформы «GeneXplain» для поиска молекулярных ключевых регуляторов CD133. В результате in silico анализа был сформирован список из 16 потенциальных ключевых регуляторов (транскрипционных факторов), предположительно участвующих в регуляции экспрессии CD133, среди которых, TRIM28 получил максимальный рейтинг. Нокаут TRIM28 методом геномного редактирования с использованием CRISPR-Cas9 практически полностью подавлял экспрессию CD133 в клетках CaCo-2. Таким образом, подтверждена роль TRIM28 в качестве молекулярного регулятора экспрессии CD133. Эта молекула может стать потенциальной мишенью для терапии опухолей, направленной против РСК. Работа выполнена в рамах Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122022800499-5).
ЭРИТРОПОЭТИН КАК АКТИВАТОР
АУТОФАГИИ В МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТКАХ
А.П. Лыков1, 2, М.А. Суровцева1, Н.А. Бондаренко1,
И.И. Ким1, Ю.С. Гаврилова1, О.В. Повещенко1
1 НИИКЭЛ-филиал ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НИИТ Минздрава России, Новосибирск, Россия
e-mail: aplykov2@mail.ru
Ключевые слова: эритропоэтин, мезенхимные стволовые
клетки, аутофагия.
Тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма, включая мезенхимные стволовые/стромаль-ные клетки (МСК), вовлечены в процесс регенерации повреждений органов и тканей. МСК рассматриваются как альтернативный способ лечения при различных дегенеративных процессах в органах и тканях [1]. К недостаткам лечения дегенеративных процессов с использованием МСК можно отнести кратковременность терапевтического потенциала стволовых клеток, как следствие гибели в условиях неблагоприятного микроокружения [2].
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
Эритропоэтин (ЭПО) способен усиливать терапевтический потенциал МСК [3]. Однако механизмы, ведущие к увеличению терапевтического потенциала МСК, предо-бработанных ЭПО исследованы недостаточно. Целью работы — оценка влияния ЭПО на аутофагию в МСК.
МСК получены из костного мозга больных ишемиче-ской болезнью сердца. Принадлежность к «истинным» МСК верифицирована фенотипированием, дифферен-цировкой в соединительнотканном направление. МСК 4-го пассажа культивировали в питательной среде ДМЕМ, с добавлением 2 мМ L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 10% ЭТС, антибиотика и 33,4 МЕ/мл ЭПО (Рекормон, Швейцария) до 3-го пассажа. Аутофагию оценивали иммуноцитохимическим способом с использованием моноклональных антител к LC3B (Abcam, США) и DAPI (BD, США), флуоресценцию анализировали на микроскопе Axio Observer Z1.
Показано, что культивирование МСК с ЭПО способствует увеличению аутофагии в 2,7 раза по сравнению с контролем на том же сроке культивирования.
Таким образом, одним из механизмов усиления терапевтического потенциала МСК ЭПО является активация аутофагии, что наделяет клетки способностью противостоять неблагоприятным факторам микроокружения.
Литература:
1. Александрушкина Н.А., Данилова Н.В., Григорьева О.А и др.
Клеточные технологии в биологии и медицине. 2019. № 1.
С. 42-47.
2. Lu D., Jiang Y., Deng W. et al. Cell Transplant. 2019. V. 28. N 4.
P. 645-652.
3. Lin H., Ling Y., Pan J, Gong H. Biochem. Biophys. Res. Commun.
2019. V. 517. N 4. P. 575-580.
ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК IN VITRO
А.П. Лыков1, 2, М.А. Суровцева1,
Н.А. Бондаренко1, И.И. Ким1, Ю.С. Гаврилова1,
Н.П. Бгатова1, О.В. Повещенко1
1 НИИКЭЛ-филиал ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НИИТ Минздрава России, Новосибирск, Россия
e-mail: aplvkov2@mail.ru
Ключевые слова: эритропоэтин, мезенхимные стволовые клетки, фенотип, клеточный цикл, пролиферация, миграция.
Мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК) способны стимулировать репаративные/регенератив-ные процессы, как в норме, так и при патологических процессах. Терапевтический потенциал МСК в отдельности и при сочетании их с другими биологически активными молекулами, в том числе и эритропоэтин (ЭПО), показан как на экспериментальных моделях у животных, так и клинических исследованиях на человеке [1-3]. Однако возраст, хронические воспалительные процессы в организме существенно влияют на функциональные свойства клеток, что диктует необходимость «лечения» стволовых клеток перед их использованием как терапевтического агента. ЭПО проявляет цитопротективное действие на различные клетки организма. Цель исследования — оценка влияния различных сроков экспозиции МСК с ЭПО in vitro на функциональный потенциал клеток.
M^ выделены из костного мозга больных ишемиче-ской болезнью сердца. M^ 4-го пассажа инкубировали с ЭПО (33,4 ME/мл, Рекормон, Швейцария) в течение 1, 72 часов, 1 и 4 недель. Оценивали экспрессию молекул адгезии, рецепторов к ЭПО (ЭПОР), ко-экспрессию ЭПОР с общей бета-цепью цитокинов, апоптоз/некроз, клеточный цикл, пролиферацию, миграцию.
Характер изменения экспрессии молекул адгезии на клеточной мембране M^ зависел от времени экспозиции с ЭПО и количества пассажей. ^атковременная экспозиция MQK с ЭПО (1 или 72 часа) существенно не влияла на пролиферацию клеток. При длительном культивировании M^ с ЭПО отмечено снижение апоптоза/ некроза, уменьшения доли клеток в G0G1 фазе клеточного цикла, увеличению пролиферативного и миграционного потенциала и продукции ЭПО. Предобработка MQK ЭПО способствовала возрастанию устойчивости клеток к окислительному стрессу, гипергликемии и их сочетанию. По данным электронной микроскопии предобработка M^ ЭПО способствовала увеличению объемной плотности мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума на 47%.
Таким образом, предобработка M^ эритропоэтином стимулирует изменения функциональной активности клеток.
Литература:
1. Borow K.M., Yaroshinsky A., Greenberg B., Perin E.C. Cir. Res.
2019. V. 125. N 3. P. 265-281.
2. Kot M., Musial-Wysocka A., Lasota M. et al. Acta Biochim. Pol.
2019. V. 66. N 4. P. 499-507.
3. Li J.P., Wang D.W., Song Q.H. Genet. Mol. Res. 2015. V. 14.
N 4. P. 19005-19015.
ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КАК ИСТОЧНИК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ЧЕЛОВЕКА
И.В. Лядова1, Т.А. Ненашева1, О.Н. Шевелева1, Е.В. Григорьева2, С.П. Медведев2
1 ФГБНУ Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
2 ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
e-mail: ivlyadova@mail.ru
Ключевые слова: Макрофаги, индуцированные плюрипо-тентные стволовые клетки, дифференцировка клеток, генетическая модификация клеток.
Одним из актуальных направлений регенеративной медицины является регенеративная медицина иммунной системы, направленная на восстановление функционирования иммунных клеток. Среди других клеток иммунной системы, интерес представляют клетки врожденного иммунитета, в частности — макрофаги (МФ). МФ играют важную роль в поддержании гомеостаза организма, в формировании защитного иммунитета, а их дисфункция является существенным фактором патогенеза многих заболеваний, в связи с чем МФ рассматриваются как перспективная мишень и потенциальный источник клеточной терапии. В последние годы большой интерес вызывают МФ (иМФ), дифференцированные из индуцированных плюрипотент-ных стволовых клеток человека (иПСК). Генерация иМФ из иПСК: а) моделирует дифференцировку тканевых резидентных МФ в эмбриогенезе; б) позволяет получать генетически модифицированные МФ; в) позволяет получать
Гены & ^етки XVII, №3, 2022
