CC BY
25
УДК 577.181, 579.61
Генетическое программирование дрожжей для создания рекомбинантных агентов биоконтроля
С. О. Пипия1*, Н. З. Мирзоева1, М. Н. Баранова1, И. Е. Елисеев1, Ю. А. Мокрушина12, О. В. Шамова3, А. Г. Габибов12, И. В. Смирнов1,4, С. С. Терехов1,2
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119234 Россия 3Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, 197022 Россия Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 115478 Россия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 14.12.2022 Принята к печати 21.02.2023 DOI: 10.32607/actanaturae.11878 РЕФЕРАТ Бактериальные инфекции, возбудители которых обладают множественной лекарственной устойчивостью, представляют серьезную проблему современной медицины, поэтому поиск и создание новых антибиотиков считаются одной из важнейших задач здравоохранения. Особый интерес вызывают антибиотики на основе антимикробных пептидов (АМП) ввиду своей генетически-кодируемой природы. Отдельным преимуществом большинства АМП является прямой механизм их действия, обусловленный мембранолитическими свойствами. Низкая скорость формирования антибиотикорезистент-ности, связанная с механизмом действия АМП, делает перспективными разработки в данной области. Рекомбинантные технологии позволяют получать генетически программируемые продуценты АМП для масштабной наработки рекомбинантных АМП (рАМП), а также направленного создания агентов биоконтроля. В данной работе метилотрофные дрожжи Pichia pastoris были генетически модифицированы для секретируемой продукции рАМП. Показано, что конститутивная экспрессия нуклеотид-ной последовательности, кодирующей зрелый АМП протегрин-1, позволяет получить штамм дрожжей, эффективно ингибирующий рост грамположительных и грамотрицательных бактерий-мишеней. Антимикробный эффект наблюдался также на уровне микрокультуры при коинкапсуляции дрожжевого продуцента и репортерной бактерии в каплях микрофлюидной двойной эмульсии. Полученные результаты показывают перспективность использования разработанной системы гетерологической продукции АМП для создания эффективных агентов биоконтроля, а также скрининга антимикробной активности с применением ультравысокопроизводительных технологий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антимикробные пептиды (АМП), дрожжи Pichia pastoris, гетерологическая экспрессия, протегрин-1 (PG-1), микрофлюидная компартментализация, эмульсионное микрокультивирование. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМП - антимикробные пептиды; рАМП - рекомбинантные антимикробные пептиды; АР - антибиотикорезистентность; ESKAPE - группа патогенов, в которую входят Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и виды рода Enterobacter; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; PG-1 - протегрин-1; rPG-1 - рекомбинантный протегрин-1; GAP - глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; sfGFP - зеленый флуоресцентный белок суперфолдер; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость; AOX1 -алкогольоксидаза-1.
ВВЕДЕНИЕ и число штаммов, приобретающих резистентность
Антибиотикорезистентность (АР) является се- к антибиотикам, в том числе последней линии за-рьезным вызовом для мирового здравоохранения. щиты. Однако количество одобренных к примене-По некоторым оценкам в 2019 году инфекции, нию в клинике новых антибиотиков с каждым го-вызванные резистентными штаммами бактерий, дом уменьшается, что не соответствует скорости унесли жизни 4.95 миллиона человек [1]. Растет распространения АР [2], и делает необходимым по-
иск альтернативных подходов к борьбе с инфекционными заболеваниями.
Мировым сообществом выделены и объединены в акроним ESKAPE наиболее приоритетные патогены, новые подходы к борьбе с которыми необходимо разрабатывать в первую очередь [3]. К ним относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и виды рода Enterobacter. Антимикробные пептиды (АМП) способны особенно эффективно бороться с бактериальными инфекциями, вызванными антибиотикорезистентны-ми представителями данной группы бактерий [4]. АМП вырабатываются широким спектром организмов и обладают антибактериальной, антифун-гальной и иммуномодулирующей активностями [5]. Механизмы действия и молекулярные мишени АМП отличаются от мишеней низкомолекулярных антибиотиков. АМП зачастую нацелены на мембрану, они формируют поры в липидном бислое или влияют на процессы формирования клеточной стенки, так или иначе нарушая целостность бактериальных клеток, что приводит к гибели патогена [6]. Этот механизм действия определяет более низкий уровень возникновения резистентности к АМП [7, 8].
В настоящее время количество АМП, доступных для терапевтического применения, ограничено, однако, количество АМП, проходящих стадии доклинических и клинических испытаний, растет, что подтверждает перспективность развития данного направления [9, 10]. Стоимость производства АМП с помощью твердофазного синтеза может составлять 50-400 $ за грамм продукта, что является экономически выгодным в основном для коротких пептидов [11]. Также технологии химического синтеза не позволяют проводить широкомасштабный скрининг антимикробной активности с использованием принципов комбинаторной химии и биологии [12]. Альтернативным подходом является использование гетерологических систем рекомбинантной продукции АМП. Гетерологические системы продукции на основе метилотрофных дрожжей Pichia pastoris позволяют легко масштабировать производство рекомбинантных биопрепаратов, минимизируя издержки на их производство [13, 14].
Агенты биоконтроля - это живые организмы (природные или модифицированные), которые способны ингибировать распространение патогенов и вредоносных организмов [15]. Чаще всего этот термин используется в контексте создания биологических пестицидов. Поскольку дрожжевые клетки не являются мишенями большинства АМП, их можно использовать для создания агентов биоконтроля, секретирующих во внеклеточную среду
Культура бактерий
Агент биоконтроля
P. pastoris рАМП
* * * * * *
Гибель бактерий
Р. pastoris 'Т ^115)
Рис. 1. Схематическое представление генетического программирования штаммов дрожжей Р. pastoris и создания рекомбинантного агента биоконтроля. Клетки дрожжей дикого типа (Р. pastoris 'Т GS115) трансфицируют генетической конструкцией для продукции секретируемой АМП; кокультивирование полученного агента биоконтроля (Р. pastoris рАМП) с бактерией-мишенью приводит к гибели этой бактерии
активные АМП для подавления роста патогенных бактерий (рис. 1) [16] или фитопатогенных грибов [17]. Применение подобного подхода в борьбе с патогенами, в том числе из группы ESKAPE, может стать перспективным для ограничения распространения антибиотикорезистентности.
Данная работа посвящена генетическому программированию метилотрофных дрожжей Р. pastoris с целью получения рекомбинантных агентов биоконтроля, в качестве активных компонентов в которых выступает антимикробный пептид. Получена генетическая конструкция, обеспечивающая конститутивную продукцию зрелого АМП, секретиру-емого в культуральную среду. Дрожжи Р pastoris, трансфицированные данной конструкцией, проявляли антимикробную активность в отношении и гра-мотрицательных, и грамположительных бактерий-мишеней. Выраженный антимикробный эффект наблюдали также в эмульсионной микрокультуре, имитирующей природные микрокомпартменты. Коинкапсуляция клеток бактерии-мишени и дрожжей-продуцентов АМП в каплях микрофлюидной двойной эмульсии приводила к эффективному подавлению роста бактерий, опосредованному гетероло-гической продукцией рАМП - протегрина-1 (rPG-1). Разработанный подход к созданию рекомбинантных агентов биоконтроля представляет перспективную основу для дальнейшего развития альтернативных стратегий борьбы с антибиотикорезистентностью.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные и дрожжевые штаммы
В качестве гетерологического продуцента АМП использовали штамм Р pastoris GS115 (Invitrogen,
США). Антимикробную активность проверяли на штаммах бактерий Escherichia coli AlptD (любезно предоставлены И.А. Остерманом) и Bacillus megaterium B-512 (любезно предоставлены С.А. Дубилей). Для получения репортерного штамма E. coli AlptD sfGFP клетки E. coli AlptD трансформировали плазмидой, конститутивно экспрессирую-щей зеленый флуоресцентный белок sfGFP [18].
Конструирование плазмиды и трансфекция клеток дрожжей
Оптимизацию кодонов последовательности, кодирующей зрелый протегрин-1 (rPG-1), проводили с использованием программного обеспечения GeneArt GeneOptimizer (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Оптимизированную последовательность гена rPG-1 клонировали в экспрессионный вектор pGAPZalpha A (Thermo Fisher Scientific Inc.) с помощью гомологичной рекомбинации. Полученную плазмиду pGAP-PG-1 линеаризировали по сайту рестрикции AvrII и трансфицировали в клетки дрожжей с помощью электропорации [19]. Трансфицированные клоны отбирали на селективной агаризованной среде YPDS (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы, 1 М сорбитол, 2% агар-агара) с добавлением антибиотика зеоцина до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Определение зон ингибирования роста бактерии-мишени
Для определения размера зон ингибирования роста клоны P. pastoris выращивали на чашках с YPD-агаром (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 100 мМ фосфат калия pH 6.0, 1.8% агара) в течение 2 дней при 30°С. Мягкий агар (8 г/л трип-тона, 2.5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5% агара) расплавляли, охлаждали до 42°С и инокули-ровали клетки E. coli AlptD или B. megaterium B-512 до конечной концентрации примерно 106 КОЕ/мл. Затем колонии P. pastoris покрывали инокулирован-ным мягким агаром и инкубировали при 37° в течение ночи. Наличие антимикробной активности анализировали по размеру зон ингибирования роста репортерной бактерии.
Оценка содержания рекомбинантного протегрина-1 в среде культивирования
Дрожжевой штамм-продуцент rPG-1 культивировали в среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 100 мМ фосфат калия pH 6.0) в колбах-качалках при 37°C и 250 об/мин в течение 3 суток. Среду культивирования использовали для анализа антимикробной активности против бактерии-мишени E. coli AlptD методом двукратных серийных разведений. В качестве стандарта
для определения концентрации пептида использовали синтетический аналог протегрина-1, полученный с помощью твердофазного синтеза.
Инкапсуляция штаммов дрожжей и бактерии-мишени в капли микрофлюидной двойной эмульсии и проточная цитофлуориметрия
Репортерный штамм E. coli AlptD sfGFP, продуцирующий sfGFP под контролем промотора pJ23119, культивировали в среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 100 мМ фосфат калия pH 6.0) в колбах-качалках при 37°C и 250 об/мин до начала фазы логарифмического роста. P. pastoris GS115 и rPG-1 культивировали в среде YPD в колбах-качалках при 30°C и 180 об/мин в течение 16 ч. Затем клеточные культуры фильтровали с использованием 40 мкм клеточных фильтров (Greiner Bio-One, Германия) и разбавляли до достижения оптической плотности OD600 = 0.45 (заселенность ~ 5 клеток на каплю) для E. coli AlptD и OD600 = 1.5 (заселенность ~ 1 клетка на каплю) для штаммов дрожжей. Затем клетки инкапсулировали в капли микрофлюидной двойной эмульсии (МДЭ) с использованием 20 мкм микрофлюидных чипов, полученных методом мягкой литографии, как описано ранее [20]. Заполненные капли МДЭ культивировали при 30°С в инкубаторе, насыщенном водяным паром. После инкубации в течение 24 ч сигнал флуоресценции от капель МДЭ анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Novocyte Flow Cytometer (ACEA Biosciences Inc., США). Капли визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Eclipse Ti (Nikon, Япония) со стандартным фильтром FITC. Эксперимент по ко-культивированию дрожжей и бактерий в 96-луноч-ном планшете проводили в среде YPD со стартовой оптической плотностью OD600 = 0.25 для дрожжей и OD600 = 0.0 0 5 для E. coli AlptD sfGFP. Планшет инкубировали при 30°С и постоянном перемешивании. Рост таргетной бактерии оценивали путем подсчета колоний после высева на агаризованную среду серийных десятикратных разведений кокультуры. Измерения проводили в трех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Антимикробные пептиды как эффективные антимикробные агенты
Антимикробные пептиды могут сочетать в себе высокую антимикробную эффективность с широким спектром антимикробной активности. В табл. 1 приведены результаты анализа опубликованных данных об антимикробной активности ряда высокоактивных АМП.
Таблица 1. Антибиотическая активность панели репрезентативных высокоэффективных АМП
Чувствительные бактерии МИК, мкг/мл
протегрин-1 ареницин-1 темпорин L плевроцидин мелиттин
Klebsiella pneumoniae 0.5-4 нд 16 4-8 4-64
Acinetobacter baumannii 0.25 4 4 1-2 0.25-0.5
Pseudomonas aeruginosa 4 2-4 16 16-32 2-8
Staphylococcus aureus 4 2-4 2-4 4-16 1-4
Candida albicans 2 24 8 нд 25
*нд - нет данных; данные МИК протегрина-1 адаптированы из [21], ареницина-1 - из [22, 23], темпорина L - [24], плевроцидина - [25], мелиттина - [26-29].
Высокоэффективные АМП можно найти среди представителей различных структурных классов. Протегрин-1 и ареницин-1 относятся к бета-шпилечным АМП, тогда как темпорин L, плевроцидин и мелиттин обладают альфа-спиральной структурой. Несмотря на отличия во вторичной структуре, они проявляют широкий спектр антимикробной активности, эффективно воздействуя в том числе и на патогены, относящиеся к группе ESKAPE, а также на оппортунистические патогенные грибы, такие, как Candida albicans.
Среди представленных пептидов протегрин-1 (PG-1) характеризуется низкой минимальной инги-бирующей концентрацией (МИК), а также обладает широким спектром активности, в том числе и в отношении патогенов группы ESKAPE. Таким образом, принимая во внимание высокую антимикробную активность PG-1, было решено использовать его аминокислотную последовательность для создания агента биоконтроля на основе метилотрофных дрожжей P. pastoris.
Генетическое программирование дрожжей
Протегрин-1 состоит из 18 аминокислотных остатков и содержит две внутримолекулярные дисуль-фидные связи, поддерживающие бета-шпилечную структуру (рис. 2А). В отличие от рекомбинантного протегрина, природный пептид содержит амидиро-ванный С-концевой остаток аргинина. Отсутствие модификации на С-конце может влиять на стабильность и активность АМП, однако эффективная продукция рекомбинантного протегрина-1 (rPG-1) in situ в гетерологической системе способна минимизировать подобные эффекты.
Нуклеотидная последовательность гена про-тегрина-1 P. pastoris GS115 была оптимизирована в соответствии с частотой использования кодо-нов и клонирована в челночный экспрессионный вектор pGAPZalpha A. Полученная генетическая конструкция pGAP-PG-1 обеспечивала конститутивную продукцию протегрина-1 за счет сильного
конститутивного промотора гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAP), а секрецию во внеклеточную среду обеспечивала сигнальная последовательность альфа-фактора дрожжей (рис. 2Б). Созданный штамм дрожжей rPG-1, трансфици-рованный плазмидой pGAP-PG-1, секретировал зрелый пептид во внеклеточную среду и формировал четкие зоны ингибирования роста репортер-ных штаммов грамположительных (B. megaterium) и грамотрицательных (E. coli AlptD) бактерий (рис. 2В).
А
Б
PG-1 V , , я
• • с V С
В Escherichia coli AlpfD Bacillus megaterium B-512
a PG-1 AOXTTpA pGAP-PG-1
rPG-1
К-
rPG-1
К-
Рис. 2. Генетическое программирование дрожжей P. рasforis. А - схема строения протегрина-1 (фиолетовым обозначены положительно заряженные аминокислотные остатки, красным - незаряженные, желтым - остатки цистеина; Б - схема генетической конструкции для продукции протегрина-1 в дрожжах: PGAP - промотор гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAP), a - сигнальная последовательность альфа-фактора, PG-1 - кодон-оп-тимизированная последовательность протегрина-1, AOX TT - АОХ1-терминатор транскрипции, pA - сигнал полиаденилирования, ZeoR - устойчивость к зео-цину; В - тест антимикробной активности штамма продуцента протегрина (rPG-1) и контрольных дрожжей, продуцирующих флуоресцентный белок mCherry (K-). Диаметр зон ингибирования роста - 12 и 14 мм для ре-портерных бактерий E. coli AlpfD и B. megaterium соответственно
Уровень продукции rPG-1 клетками дрожжей оценивали по значениям антимикробной активности среды культивирования против репортерной бактерии E. coli AlptD. В качестве стандарта использовали химически синтезированный аналог rPG-1. Концентрация rPG-1 в среде культивирования равна 540 нг/мл.
Таким образом, показана возможность реконструкции искусственной антимикробной активности в клетках P pastoris, продуцирующих rPG-1.
Кокультивирование в каплях микрофлюидной двойной эмульсии
Эффективные агенты биоконтроля способны ограничивать распространение патогенных микроорганизмов, против которых они направлены. Зачастую конкуренция микроорганизмов происходит в рамках определенных микрокомпартментов среды обитания, будь то почвенные сообщества или микробио-та кишечника [30]. Таким образом, при создании агентов биоконтроля и пробиотических организмов необходимо оценить их способность ингибировать рост таргетных бактерий в микрокомпартментах и при численном преимуществе последних. Капли двойной эмульсии, сгенерированные с помощью микрофлюидных технологий, позволяют заключить клетки эффекторных дрожжей с репортерным штаммом бактерии и оценить их антибиотические
свойства. Подобная модель в дальнейшем может быть модифицирована для проведения широкомасштабных скринингов антимикробной активности.
В рамках данной работы рекомбинантный штамм дрожжей, продуцирующий протегрин (rPG-1), был коинкапсулирован в капли микрофлюидной двойной эмульсии с репортерными клетками E. coli AlptD sfGFP, конститутивно продуцирующими зеленый флуоресцентный белок sfGFP (рис. 3А). В качестве контроля использовали коинкапсуляцию E. coli AlptD sfGFP с дрожжами дикого типа (GS115) и инкапсуляцию E. coli AlptD sfGFP без дрожжей. Антимикробную активность рекомбинантных штаммов дрожжей P. pastoris детектировали по гибели или пролиферации репортерной бактерии-мишени и сопутствующей флуоресценции sfGFP в каплях микрофлюидной двойной эмульсии.
После инкубации в течение 24 ч капли анализировали с помощью проточного цитофлуориметра. Коинкапсуляция бактерии-мишени со штаммом дрожжей rPG-1 приводила к снижению сигнала флуоресценции репортера по сравнению с каплями, в которых E. coli AlptD sfGFP были инкапсулированы отдельно или вместе с контрольным штаммом GS115 (рис. 3Б). Снижение уровня флуоресценции в каплях свидетельствовало о подавлении роста клеток E. coli AlptD sfGFP в присутствии дрожжей rPG-1. В то же время дрожжи GS115 не оказыва-
P. pastoris rPG-1 + E. coli sfGFP В P. pastoris rPG-1 + E. coli sfGFP
,ь л е п а к т е ч С
Рис. 3. Анализ антимикробных свойств рекомбинантного агента биоконтроля. А — схема кокультивирова-ния эффекторных дрожжей с бактерией-мишенью в каплях двойной эмульсии. Б — результаты проточной цитофлуориметрии капель после кокультивирования: цветом отмечено распределение сигнала флуоресценции E. coli AlptD sfGFP инкапсулированных со штаммом rPG-1 (красный), с контрольными дрожжами P. pastoris GS115 (синий), без дрожжей (зеленый). В — микроскопия капель микрофлюидной двойной эмульсии при инкапсуляции бактерии-мишени E. coli sfGFP с эффекторными дрожжами P. pastoris rPG-1 и с контрольными клетками P. pastoris GS115. Шкала делений - 50 мкм
105 106 107 Флуоресценция sfGFP, RFU
Б
ли значительного влияния на пролиферацию E. coli AlptD sfGFP, что приводило к увеличению сигнала флуоресценции в соответствующих каплях.
Микроскопия образцов после инкубации показала высокоэффективное подавление роста репортерно-го штамма E. coli AlptD sfGFP, сопровождающееся пролиферацией P. pastoris rPG-1 (рис. 3В). В то же время коинкапсуляция репортерной бактерии с контрольным штаммом GS115 приводила к преобладанию капель, заполненных размножившимися клетками бактерии-репортера (рис. 3В). Подобный эффект сохранялся и при совместном культивировании эффекторных дрожжей с таргетной бактерией в 96-луночном планшете. В суспензии P pastoris rPG-1 подавлялся рост E. coli AlptD sfGFP, в отличие от контрольных дрожжей P pastoris GS115.
Таким образом, созданные дрожжи-продуценты rPG-1 способны ингибировать рост таргетной бактерии в совместной культуре уже на первые сутки инкубации. Полученные результаты могут быть имплементированы для разработки пробиотических организмов на основе дрожжей-продуцентов рАМП и создания программируемых рекомбинантных агентов биоконтроля.
ОБСУЖДЕНИЕ
Стремительное распространение антибиотикорези-стентности серьезно осложняет борьбу с инфекционными заболеваниями. Появление бактериальных штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) еще сильнее уменьшает число доступных схем терапии. Таким образом, остро стоит вопрос о поиске альтернативных антимикробных соединений. Антимикробные пептиды способны стать источником новых антимикробных препаратов, поскольку обладают активностью против широкого спектра патогенов, в том числе ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью [31].
АМП включают представителей различных структурных классов. Среди них выделяют бета-шпильки, альфа-спирали, линейные, комбинированные, а также циклические пептиды [32]. Широкая структурная вариабельность АМП позволяет реализовывать разные механизмы воздействия на бактериальные клетки, влияя на спектр антимикробной активности. Технологии рационального дизайна позволяют провести тонкую настройку физико-химических свойств АМП и получить пептид с улучшенными показателями активности и токсичности [33]. Таким образом, АМП создают пластичную основу для получения эффективных антимикробных препаратов.
Протегрин-1, относящийся к бета-шпилечным АМП, состоит из 18 аминокислотных остатков и содержит две внутримолекулярные дисульфидные
связи. Он проявляет широкую антимикробную активность за счет взаимодействия с бактериальной мембраной и формирования в ней пор [34, 35]. Принимая во внимание высокие показатели антимикробной активности и широкий спектр чувствительных к нему патогенов, протегрин-1 был выбран в качестве активного компонента для создания ре-комбинантного агента биоконтроля.
Гетерологическая продукция АМП представляет важную биотехнологическую задачу, а также служит основой для создания систем широкомасштабного скрининга антимикробных соединений. Метилотрофные дрожжи P. pastoris широко используются в биотехнологии, поскольку позволяют за короткое время получать рекомбинантные белки с высоким выходом [13, 14]. Наиболее широко используется получение рекомбинантных белков под контролем промотора алкогольокси-дазы-1 (AOX1), индуцируемого метанолом [36]. Однако метанол легко воспламеняется и относится к токсичным веществам, к тому же индуцированная экспрессия не позволяет оценить конкурентные характеристики рекомбинантных дрожжей in vivo. В нашей работе синтез антимикробного пептида в клетках P. pastoris осуществлялся под контролем сильного конститутивного промотора глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAP). Это позволило получить рекомбинантный штамм дрожжей, способный эффективно ингибировать рост грамположительных (B. megaterium) и грамотрица-тельных (E. coli AlptD) бактериальных мишеней.
Агенты биоконтроля способны ингибировать рост патогенных организмов, против которых они направлены [15]. Для эффективной защиты от патогенов агенты биоконтроля должны обладать способностью конкурировать с этими патогенами в рамках ограниченного количества ресурсов и пространства. В данной работе такие условия моделировали посредством микрокомпартментализации бактериальной мишени и дрожжевого эффектора в каплях микрофлюидной двойной эмульсии, и при инкапсуляции создавалось численное преимущество бактериальных клеток над дрожжевыми. Установлено, что штамм дрожжей, секретирующий рекомбинант-ный протегрин-1 (rPG-1) в культуральную среду, уже в первые сутки после инкапсуляции способен эффективно подавлять рост бактерии-мишени. За счет конститутивной продукции rPG-1 рекомби-нантные дрожжи обладают постоянной антимикробной активностью, они способны контролировать рост микроорганизмов без необходимости в добавлении индуктора. Таким образом, в результате генетического программирования дрожжей P. pastoris создан рекомбинантный агент биоконтроля, способный ин-
гибировать рост бактерии-мишени в условиях конкуренции за пространство и питательные вещества.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе данного исследования на основе метило-трофных дрожжей Р. pastoris создан рекомбинант-ный агент биоконтроля, активным компонентом которого выступает рАМП протегрин-1. Полученный штамм дрожжей ингибировал рост репортерной мишени как на агаризованной среде, так и в условиях кокультивирования в каплях микрофлюидной
двойной эмульсии. Разработанная стратегия получения рекомбинантных агентов биоконтроля является важным этапом создания альтернативных способов борьбы с патогенами. Кроме того, рассмотренные подходы могут применяться для поиска новых антимикробных соединений с использованием технологий глубокого функционального профилирования [37].
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (проект № 21-14-00357).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Murray C.J.L., Ikuta K.S., Sharara F., Swetschinski L., Robles Aguilar G., Gray A., Han C., Bisignano C., Rao P., Wool E., et al. // Lancet. 2022. V. 399. № 10325. P. 629-655.
2. Chahine E.B., Dougherty J.A., Thornby K.-A., Guirguis E.H. // Ann. Pharmacother. 2022. V. 56. № 4. P. 441-462.
3. Oliveira D.M.P.D., Forde B.M., Kidd T.J., Harris P.N.A., Schembri M.A., Beatson S.A., Paterson D.L., Walker M.J. // Clin. Microbiol. Rev. 2020. V. 33. № 3. Р. e00181-00119.
4. Lin Q., Deslouches B., Montelaro R.C., Di Y.P. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2018. V. 52. № 5. Р. 667-672.
5. Mookherjee N., Anderson M.A., Haagsman H.P., Davidson D.J. // Nat. Rev. Drug Discov. 2020. V. 19. № 5. Р. 311-332.
6. Mahlapuu M., Hakansson J., Ringstad L., Björn C. // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2016. V. 6. № 194. Р. 1-20.
7. Spohn R., Daruka L., Lazar V., Martins A., Vidovics F., Grezal G., Mehi O., Kintses B., Szamel M., Jangir P.K., et al. // Nat. Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 4538.
8. Assoni L., Milani B., Carvalho M.R., Nepomuceno L.N., Waz N.T., Guerra M.E.S., Converso T.R., Darrieux M. // Front. Microbiol. 2020. V. 11. № 593215. Р. 1-20.
9. Zhu Y., Hao W., Wang X., Ouyang J., Deng X., Yu H., Wang Y. // Med. Res. Rev. 2022. V. 42. № 4. P. 1377-1422.
10. Koo H.B., Seo J. // Pept. Sci. 2019. V. 111. № 5. P. e24122.
11. Moretta A., Scieuzo C., Petrone A.M., Salvia R., Manniello M.D., Franco A., Lucchetti D., Vassallo A., Vogel H., Sgambato A., et al. // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021.
V. 11. № 668632. P. 1-26.
12. Tucker A.T., Leonard S.P., DuBois C.D., Knauf G.A., Cunningham A.L., Wilke C.O., Trent M.S., Davies B.W. // Cell. 2018. V. 172. № 3. P. 618-628.e613.
13. Popa C., Shi X., Ruiz T., Ferrer P., Coca M. // Front. Microbiol. 2019. V. 10. № 1472. P. 1-13.
14. Chen X., Li J., Sun H., Li S., Chen T., Liu G., Dyson P. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 14543.
15. Stenberg J.A., Sundh I., Becher P.G., Björkman C., Dubey M., Egan P.A., Friberg H., Gil J.F., Jensen D.F., Jonsson M., et al. // J. Pest Sci. 2021. V. 94. № 3. P. 665-676.
16. Pipiya S.O., Mokrushina Y.A., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S. // Antibiotics. 2020. V. 9. № 9. P. 527.
17. Huang Y., Gao L., Lin M., Yu T. // Postharvest. Biol. Technol. 2021. V. 171. № 11. Р. 1298.
18. Baranova M.N., Babikova P.A., Kudzhaev A.M., Mokrushina Y.A., Belozerova O.A., Yunin M.A., Kovalchuk S., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S. // Antibiotics. 2021. V. 10. № 10. P. 1161.
19. Wu S., Letchworth G.J. // BioTechniques. 2004. V. 36. № 1. P. 152-154.
20. Terekhov S.S., Smirnov I.V., Stepanova A.V., Bobik T.V.,
Mokrushina Y.A., Ponomarenko N.A., Belogurov A.A., Rubtsova M.P., Kartseva O.V., Gomzikova M.O., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. № 10. P. 2550-2555.
21. Edwards I.A., Elliott A.G., Kavanagh A.M., Zuegg J., Blaskovich M.A.T., Cooper M.A. // ACS Infect. Dis. 2016. V. 2. № 6. P. 442-450.
22. Orlov D.S., Shamova O.V., Eliseev I.E., Zharkova M.S., Chakchir O.B., Antcheva N., Zachariev S., Panteleev P.V., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V., et al. // Mar. Drugs. 2019. V. 17. № 6. P. 376.
23. Park C., Cho J., Lee J., Lee D.G. // Biotechnol. Lett. 2011. V. 33. № 1. P. 185-189.
24. Manzo G., Ferguson P.M., Hind C.K., Clifford M., Gustilo V.B., Ali H., Bansal S.S., Bui T.T., Drake A.F., Atkinson R.A., et al. // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 10934.
25. Manzo G., Hind C.K., Ferguson P.M., Amison R.T., Hodgson-Casson A.C., Ciazynska K.A., Weller B.J., Clarke M., Lam C., Man R.C.H., et al. // Commun. Biol. 2020. V. 3. № 1. P. 697.
26. Dosler S., Karaaslan E., Alev Gerceker A. // J. Chemother. 2016. V. 28. № 2. P. 95-103.
27. Akbari R., Hakemi-Vala M., Pashaie F., Bevalian P., Hashemi A., Pooshang Bagheri K. // Microb. Drug Resist. 2018. V. 25. № 2. P. 193-202.
28. Jang W.S., Kim C.H., Kim K.N., Park S.Y., Lee J.H., Son S.M., Lee I.H. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003. V. 47. № 8. P. 2481-2486.
29. Sung W.S., Park S.H., Lee D.G. // FEBS Lett. 2008. V. 582. № 16. P. 2463-2466.
30. Donaldson G.P., Lee S.M., Mazmanian S.K. // Nat. Rev. Microbiol. 2016. V. 14. № 1. P. 20-32.
31. Park S.C., Park Y., Hahm K.S. // Int. J. Mol. Sci. 2011. V. 12. № 9. P. 5971-5992.
32. Huan Y., Kong Q., Mou H., Yi H. // Front. Microbiol. 2020. V. 11. № 582779. P. 1-21.
33. Elliott A.G., Huang J.X., Neve S., Zuegg J., Edwards I.A., Cain A.K., Boinett C.J., Barquist L., Lundberg C.V., Steen J., et al. // Nat. Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 3184.
34. Bolintineanu D., Hazrati E., Davis H.T., Lehrer R.I., Kaznessis Y.N. // Peptides. 2010. V. 31. № 1. P. 1-8.
35. Fahrner R.L., Dieckmann T., Harwig S.S., Lehrer R.I., Eisenberg D., Feigon J. // Chem. Biol. 1996. V. 3. № 7.
P. 543-550.
36. Karbalaei M., Rezaee S.A., Farsiani H. // J. Cell. Physiol. 2020. V. 235. № 9. P. 5867-5881.
37. Terekhov S.S., Smirnov I.V., Malakhova M.V., Samoilov A.E., Manolov A.I., Nazarov A.S., Danilov D.V., Dubiley S.A., Osterman I.A., Rubtsova M.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018. V. 115. № 38. P. 9551-9556.
