CC BY
59
УДК: 579.6 /579.258 DOI: 10.17816/ecogen15221-30
© М.А. Цыганков, М.В. Падкина
ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Дрожжи Pichia pastoris используются для синтеза секреторных рекомбинантных белков. Одним из подходов к повышению продукции целевых белков является сверхэкспрессия генов-помощников, белковые продукты которых участвуют в процессе секреции. Задачей нашего исследования была оценка влияния сверхпродукции протеиндисульфидизомеразы (Pdi) дрожжей P. pastoris на продукцию рекомбинантных интерферонов. В ходе нашей работы получены штаммы дрожжей P. pastoris, экспрессирующие ген PpPDI под контролем промотора алкоголь-оксидазы-1 (AOX1). Показано влияние суперпродукции Pdi на жизнеспособность и скорость роста клеток, а также на продукцию гете-рологичных белков — интерферо-на-альфа16 человека и интерферо-на-гамма курицы.
* Ключевые слова: Pichia pastoris; экспрессия гетерологичных генов; РШ; рекомбинантные интерфероны.
Поступила в редакцию 26.12.2016 Принята к публикации 15.06.2017
ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНА PDI НА ПРОДУКЦИЮ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ В ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS
ВВЕДЕНИЕ
Дрожжи Pichia pastoris представляют собой удобную систему экспрессии гетерологичных генов. Особенностями P. pastoris являются простота культивирования, методики генетических манипуляций, сильные, сравнимые с бактериальными промоторы, например промотор гена GAP или строго регулируемый промотор гена AOX1, а аэробный тип метаболизма позволяет достигать высокой плотности клеточной суспензии. От прокариотических систем экспрессии P. pastoris выгодно отличает наличие ферментов посттрансляционных модификаций эукариотических белков и высокая вероятность их успешного синтеза и правильного фолдинга [28]. P.pastoris, в отличие от распространенной эукариотической системы экспрессии гетерологичных генов на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, синтезируют гликопротеины с меньшим количеством мономеров без иммуногенных а-1,3-связанных ман-ноз [15]. Количество гетерологичных генов, экпрессированных в P. pastoris, постоянно увеличивается, а появление нуклеотидной последовательности генома в открытом доступе [29] открывает дополнительные возможности для изучения данного организма. Одновременно растет количество коммерческих препаратов на основе рекомбинантных белков, произведенных в P. pastoris, на данный момент их уже 16 [33].
Многие рекомбинантные белки продуцируют в дрожжах в виде секреторных продуктов. Прежде чем покинуть клетку после трансляции, белок должен проделать длинный путь, сопровождаемый посттрансляционными модификациями — из эндоплазматического ретикулума (ЭР) через транспортные везикулы в аппарат Гольджи (АГ) и через секреторные везикулы во внеклеточное пространство [18]. Многие секреторные гетерологичные белки в дрожжевых системах экспрессии продуцируются в количестве не более 1 % от теоретически возможного [25]. Очевидно, что изучение подходов к увеличению выхода таких белков в P. pastoris является актуальной задачей.
Было показано, что в P. pastoris синтез гетерологичных белков является стрессорным фактором и приводит к повышенному уровню транскрипции генов шаперонов, вспомогательных белков фолдинга, внутриклеточного транспорта и других [20]. Исходя из этого, можно предположить, что коэк-спрессия генов белков, участвующих в секреции и фолдинге, может влиять на выход гетерологичного белка.
Одним из таких белков является протеиндисульфидизомераза (Pdi). Pdi — мультифункциональный белок массой 57 кДа, который находится в ЭР эукариотических клеток. Он катализирует формирование, восстановление и изомеризацию дисульфидных связей в синтезируемых белках. Помимо каталитической функции, Pdi выступает в качестве шаперона, ингибируя агрегацию неправильно свернутых белков, и является частью по крайней мере двух мультиэнзимных комплексов [40].
У эукариот Pdi была обнаружена в результате исследования окислительного рефолдинга in vitro Гилбертом и др. [8]. У хорошо изученных дрожжей S. cerevisiae найдены четыре паралога гена ScPDI [31], а у человека существует целое семейство Pdi, насчитывающее 20 белков, участвующих во многих физиологических и патологических процессах [14]. Нуклеотидная
последовательность гена PpPDl в дрожжах P. pastoris была расшифрована Уорсеймом и др. [40]. Во всех организмах Pdi выполняет важные, незаменимые функции. Делеция у дрожжей S. cerevisiae основного гена ScPDll приводит к нежизнеспособности клеток [19], а у нематоды Caenorhabditis elegans один из трех паралогов — ген CePDl2 необходим для нормального постэмбрионального развития [41]. Сведений о наличии паралогов гена PpPDl в дрожжах P. pаstoris и влиянии делетирова-ния гена PpPDl на жизнеспособность дрожжей нет.
Коэкспрессию гена PDl для увеличения синтеза ге-терологичных белков использовали во многих системах экспрессии. Эффект был показан, начиная от бесклеточных систем трансляции при получении антител [37] до систем на основе гибридом [24] и клеток яичников китайского хомячка (CHO-линий) [16]. В клетках Es^erichia coli коэкспрессия эукариотической Pdi увеличивала выход антигенсвязывающего домена (Fab-домена) [23] и бычьего ингибитора трипсина [32]. В бакуловирусной системе коэкспрессия гена PDl повышала уровень растворимых антител in vivo [22]. Влияние сверхэкспрессии гена PDl на продукцию гетерологичных белков изучали и в дрожжах. Например, внесение еще одной копии гена KlPDll в геном дрожжей Kluyveromyces lactis повышало продукцию сывороточного альбумина человека — белка, насыщенного дисульфидными связями [26]. В дрожжах Schizosaccharomyces pombe сверхэкспрессия каждого из двух паралогов гена SpPDl приводила к повышению продукции секретируемого сывороточного трансферрина человека [30]. Многочисленны примеры сверхэкспрессии гена PDl в дрожжах S. cerevisiae и P. pastoris [21].
Целью нашего исследования было оценить влияние сверхэкспрессии гена PpPDl на уровень продукции модельных гетерологичных белков: интерферона-альфа16 человека (IFNa16-hum) и интерферона-гамма курицы (IFNy-chk).
Интерфероны — белки иммунной системы, участвующие в обеспечении противовирусной защиты орга-
низма, обладающие многообразными биологическими функциями. Выбор этих белков в качестве модельных был обусловлен несколькими причинами. Во-первых, препараты на основе интерферонов используются для лечения различных вирусных и онкологических заболеваний человека [9]. IFNY-chk может быть использован как адъювант вакцин и фактор роста в птицеводстве [27]. Во-вторых, данные интерфероны различаются по своему строению: IFNa16-hum — негликозилированный белок, в котором присутствуют две дисульфидные связи (Uniprot No P05015, 01.09.2016), IFNY-chk — глико-зилированный белок без дисульфидных связей (Uniprot No P49708, 01.09.2016). Различия в строении белков позволят ответить на вопрос, как влияет сверхэкспрессия гена PpPDl на продукцию интерферонов, и оценить зависимость эффекта от присутствия в белках дисуль-фидных связей и сайтов гликозилирования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Плазмиды
Для создания векторов экспрессии использовали плазмиды pPlC9 иpPlCZaA (Invitrogen).
Штаммы
На этапе конструирования плазмид и их амплификации применяли штамм DH5a Escherichia coli (F'lendAl hsdRl7 (rk mk+) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nalr) relAlD (lacZYA - argF) U169 deoR (f80dlacD(lacZ) M15). В работе были использованы штаммы дрожжей P. pastoris, экспрессирующие структурные гены интер-ферона-альфа16 человека (GS-humA16) [11] и интер-ферона-гамма курицы (GS-chkIG) [13], под контролем промотора гена AOX1 и секретирующие гетерологичные белки. Для получения штаммов фенотипа Mut+ и MutS, не секретирующих гетерологичные белки, применяли штамм P. pastoris GS115 (his4) (Invitrogen) (his4 — мутация, приводящая к потребности в гистидине). Полученные в работе штаммы приведены в таблице 1.
Таблица 1
Штаммы, полученные в работе Strains, obtained in the work
Название, употребляемое в статье Генотип Фенотип
GS-HIS his4:: HIS4 HIS+ Mut+
GS-aox1 aoxl AHIS4 HIS+ MutS
GS-AOX1PDI PAOX1:: PAOX1-PDI HIS+ Mut+ ZeoR
GS-chkIFNG-AOX1PDI aoxl APAOXl-chkIFNG PAOX1:: PAOXl-PpPDI HIS+ MutS ZeoR
GS-humIFNA16-AOX1PDI aoxl APAOX1-humIFNA16 PAOX1:: PAOX1-PDI HIS+ MutS ZeoR
Примечание: HIS+ — прототрофность по гистидину, Mut+ — быстрый и MutS — медленный рост дрожжей на среде с метанолом, определяемый функциональностью гена AOXl, ZeoR — способность расти на среде с антибиотиком зеоцином. Note: HIS+ — histidine prototrophy, Mut+ — fast and MutS — slow yeast grow rate in medium containing methanol as a sole carbon source, which is determined of AOXl gene functionality, ZeoR — ability to grow on a medium containing Zeocin
Трансформация
Трансформацию дрожжей плазмидными векторами производили методом электропорации по описанной ранее методике [42]; трансформацию бактерий — по стандартной методике [5].
Бактериальные штаммы культивировали в среде Лу-риа — Бертани [5]. Для отбора трансформантов, устойчивых к ампициллину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 50 мг/л; для отбора трансформантов, устойчивых к зеоцину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 25 мг/л. При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды. Штаммы E. coli выращивали при 37 °C.
Для отбора дрожжевых трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину, использовали среду, содержащую на 1 литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глюкозу — 10 г и агар — 20 г, антибиотик — 150 мг/л.
Для отбора дрожжевых трансформантов, прототроф-ных по гистидину, использовали минимальную среду, содержащую 25 г/л агара и 6,8 г/л смеси витаминов, микроэлементов и источника азота (Y0626 (Sigma)). Для селекции трансформантов, имеющих фенотип MutS, штаммы высевали на минимальную среду (Mm), содержащую 0,5 % метанола в качестве единственного источника углерода, и визуально определяли клетки с замедленным ростом.
Выращивание штаммов-продуцентов гетерологичных белков
Дрожжи P. pastoris культивировали двумя методами — одностадийным и двух стадийным в трех по-вторностях. При двухстадийном культивировании на первом этапе дрожжи выращивали 48 часов при 30 °C в 200 мл среды, содержащей на литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глицерин — 20 г. Затем клетки отбирали центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и переносили в 50 мл среды, содержащей на литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, метанол — 20 мл и 0,1М калий фосфатный буфер pH = 6,0 (YPM-КФБ). Культивировали при 20 °C 48 часов. При одностадийной схеме выращивания клетки дрожжей одного возраста с твердой среды ресуспендировали в стерильной воде и одинаковое количество клеток засевали в 50 мл среды YPM-КФБ. Культивирование проводили 48 часов при 25 °C. Несмотря на то что 20—22 °C — оптимальная температура для индукции интерферонов, при которой количество белка в культуральной среде максимально [3], для одностадийного культивирования мы выбрали температуру 25 °C, чтобы обеспечить достаточную биомассу продуцента и количество гетерологичного белка. Плотности клеточной суспензии измеряли при длине волны 600 нм.
Для определения влияния сверхпродукции Pdi на удельную скорость роста выращивали инокулюм до
стационарной фазы роста на среде с YPM-КФБ, затем засевали одинаковое количество клеток в 120 мл среды Mm. Культивирование проводили 3 суток при 30 °C. Каждые 2 часа измеряли плотность клеточной суспензии. В качестве контроля использовали штамм GS-HIS. Эксперименты выполняли в двух повторно-стях. Культивирование во всех случаях осуществляли при 150 об/мин.
Для определения влияния восстанавливающих агентов на штаммы со сверхэкспрессией гена PpPDI дрожжи высевали в разных разведениях на твердые среды, содержащие анализируемые вещества, в условиях индукции дополнительной копии гена PpPDI по методике, описанной ранее [17].
Анализ гетерологичных белков
Анализ гетерологичных белков электрофорезом в по-лиакриламидном геле (ПААГ) и гибридизацию с антителами выполняли по методике, использованной нами ранее [10].
Пробы готовили концентрированием культуральной жидкости в 10 раз при помощи центрифужных ультрафильтров Amicon Ultra 0,5 mL (Merck Millipore). В качестве контроля на гель наносили культуральную жидкость штамма GS-aox1, выращенного в тех же условиях. Для оценки количества целевого белка в пробах на гель наносили известное количество трипсиногена А, имеющего молекулярную массу 25 кДа, близкую гетерологич-ным интерферонам. Электрофореграммы анализировали с помощью компьютерной программы GelQuantNET (BiochemLabSolutions).
Для определения интерферона-альфа16 человека использовали первичные кроличьи IgG-поли-клональные антитела PA5-54146 (Thermo scientific). В качестве вторичных применяли конъюгат видоспе-цифических антител к иммуноглобулинам кролика и пе-роксидазы хрена A-0545 (Sigma). Все антитела разводили в 1000 раз.
Выделение ДНК
Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов Plasmid Miniprep (Евроген) по методике, рекомендованной производителем; хромосомную ДНК из клеток дрожжей — по методике Smash&Grab [7].
Полимеразная цепная реакция
Для амплификации гена PpPDI использовали прай-меры: прямой (f-HindIII-PDI) 5-ACCCAAGCTTACGATG CAATTCAACTGGGA-3' и обратный (r-PDI-XhoI) 5'-GC CGCTCGAGTTAAAGCTCGTCGTGAGCGT-3 Прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы HindIII, а обратный праймер — для рестриктазы XhoI.Для проверки ориентации гена PpPDI, клонированного под промотором гена AOX1, в качестве прямого использовали праймер (5-AOX1) 5'-CATCCAAAGACGAAAGGTTG-3',
комплементарный 3Л-концу промотора гена АОХ1. Поли-меразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в приборе ТееИпе ТС-3000 (Эа^ег) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95 °С в течение 45 с, отжиг праймеров в течение 90 с при температуре 55 °С, по-лимеразная реакция при 72 °С в течение 120 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72 °С в течение 5 минут. Всего 35 циклов.
Относительное количество копий гена РрР01 в дрожжевых штаммах определяли при помощи ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) на приборе АНК-32 (Син-тол) методом TaqMan [12]. В качестве референсного гена был взят ген РрАСТ1. Использовали праймеры следующего состава: прямой к гену РрРЭ1 ^-РЭ1) 5Л- ТС О СТАЛО С АТС С СААОААС - 3Л, обратный к гену РрРШ (Р01-Я) б-СААСТТСАТСОТОООССТТТ-З, зонд, меченный флуорофором НОХ и гасителем флуоресценции BHQ-2 (РЭ1-р) ^-АОАААТТСАТСОСАО ОАОАООСАОА-3Л; прямой к гену РрАСТ1 (F-ACT1) ^-АОТОТТСССАТСООТСОТАО-З; обратный к гену РрАСТ1 (АСТ1-Я) 5,-ООТТСАТТООАОССТСАОТС-3; зонд, меченный флуорофором НОХ и гасителем флуоресценции BHQ-2 (АСТ1-р) б-САССАСАССТТССТАСА АСОАОТТОСОТ-3Л. Проводили 25 циклов по следующей программе: первоначальное плавление цепей ДНК при 95 °С — 10 мин, 60 °С — 60 с, 95 °С — 20 с.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клонирование гена PpPDI и получение вектора, содержащего ген PpPDI под промотором гена AOX1
В качестве матрицы для амплификации гена РрРЭ1 была использована хромосомная ДНК штамма ОБ115. Праймеры к началу и концу структурного гена содержали сайты узнавания рестриктазами Н1пШП и ХИо1 соответственно. Для транскрипции гена РрРЭ1 в дрожжах был выбран промотор гена АОХ1, так как целью исследования было выявить влияние сверхэкспрессии гена РрРЭ1 на продукцию гетерологичных белков, структурные гены которых также работают под контролем промотора гена АОХ1. Таким образом достигается одновременная индукция целевого гена и гена-помощника.
Для создания вектора экспрессии гена РрРЭ1 использовали плазмидурР1С2оА, которую обрабатывали рестриктазами Н1пШП и ХИо1, чтобы удалить альфа-фактор дрожжей. Ген РрРВ1, полученный при помощи ПЦР, содержал нативную сигнальную последовательность для транслокации белка в ЭР и был фланкирован сайтами узнавания рестриктаз Н1пШП и ХИо1. Подтверждение структуры полученной плазмиды и ориентацию встройки осуществляли при помощи ПЦР и рестрикционного анализа. Схема получения плазмиды представлена на рис. 1 а.
Рис. 1. Получение плазмид Fig. 1. Plasmid construction
Получение штаммов
Штамм GS-aox1 с фенотипом HIS+ MutS был получен трансформацией штамма GS115 плазмидой pPIC9, обработанной рестриктазой BglII (рис. 1b). Встраивание полученной линейной конструкции, фланкированной 5Л-и 3л-областью гена AOX1, происходит с замещением хромосомного гена AOX1 экспрессионной кассетой и маркерным геном HIS4.
Штамм GS-HIS с фенотипом HIS+ Mut+ был также получен из штамма GS115 трансформацией плазмидой pPIC9. Плазмиду обрабатывали рестриктазой StuI (рис. 1с), таким образом вставка в геном происходила в локус HIS4, что обеспечивало появление в геноме функциональной копии гена HIS4 и прототрофность штамма по гистидину. Штамм GS-HIS был использован в качестве контрольного при оценке влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста дрожжей. Штамм GS-aox1 был использован в качестве контрольного при анализе куль-туральной жидкости штаммов, продуцирующих гетероло-гичные белки. Для оценки роста клеток при сверхэкспрессии гена PpPDI применяли штамм GS-AOX1PDI, который получали трансформацией штамма GS-HIS плазмидой pPICZaA-AOXIPDI. Вектор обрабатывали рестриктазой SacI, которая гидролизовала его в 5Л-области промотора AOX1 (см. рис. 1), вставка экспрессионной кассеты происходила в хромосомный локус AOX1 за счет кроссинговера с сохранением функциональности гена AOX1.
Для оценки влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на продукцию гетерологичных белков штаммы, полученные ранее в нашей лаборатории, секретирующие в куль-туральную среду интерферон-альфа 16 человека [11] и интерферон-гамма курицы [13], трансформировали плазмидой pPICZaA-AOXIPDI. Гены, кодирующие гетеро-логичные интерфероны, находятся под контролем промотора гена AOX1, штаммы были получены замещением хромосомного гена АОХ1 экспрессионной кассетой и имеют фенотип HIS+ MutS. Плазмиду pPICZaA-AOXIPDI также обрабатывали рестриктазой SacI, сайт расщепления которой находится в 5Л-области промотора AOX1 (см. рис. 1). Интеграция в геном осуществлялась в промоторную область гена AOX1 без нарушения функции промотора и гена АОХ1. В итоге на некотором расстоянии работают два промотора гена AOX1, каждый из которых контролирует свой ген и имеет свою область терминации транскрипции.
Наличие в штаммах реципиентов нужных генетических конструкций и ориентацию встройки определяли при помощи ПЦР. Появление в культуральной жидкости целевого белка подтверждали электрофорезом куль-туральных жидкостей штаммов-продуцентов (рис. 2). И ФА-анализ исходных штаммов, подтверждающий наличие целевого белка, был проведен ранее [11, 13].
Определение копийности гена PpPDI
При трансформации методом электропорации возможна множественная встройка вектора в геном дрож-
жей P. pastoris [44]. Количество копий генов определяли методом относительной количественной оценки при помощи РТ-ПЦР, в частности ACt-методом c применением референсного гена [2]. В качестве контрольных были взяты исходный штамм GS115 и штамм GS-HIS. РТ-ПЦР осуществляли в трех параллельных повторно-стях. Данные РТ-ПЦР представлены на рис. 3. Значения относительного количества гена PpPDI в исходном штамме и штаммах-реципиентах обрабатывали при помощи
Weight, kDa
2 M1 к"
180 _
130 '—•
% ш г
55 ••
43 34 26
Рис. 2. Электрофореграмма белков культуральной среды штаммов-продуцентов со сверхэкспрессией гена PpPDI: M1, M2 — маркеры молекулярного веса белков; (K- ,1,2,3,4) — белковые компоненты из культуральной среды штаммов: [K-] — GS115, [1] — GS-humIFNA16, [2] — GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] — GS-chkIFNG, [4] — GS-chkIFNG-AOX1PDI
Fig. 2. SDS-PAGE analysis of proteins from culture fluid of productive strains with PpPDI gene overexpression: M1, M2 — protein markers of a certain molecular weight (kDa), (K- ,1,2,3,4) — protein components from culture fluid of these strains: [K-] - GS115, [1] - GS-humIFNA16, [2] -GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] - GS-chkIFNG, [4] -GS-chkIFNG-AOX1PDI
Рис. 3. Определение копийности гена PpPDI в полученных штаммах: штаммы: [1] — GS115, [2] — GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] — GS-chkIFNG-AOX1PDI, [4] — GS-HIS, [5] — GS-AOX1PDI
Fig. 3. PpPDI gene copy number determination in the obtained strains: Strains: [1] - GS115, [2] - GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] - GS-chkIFNG-AOX1PDI, [4] - GS-HIS, [5] - GS-AOX1PDI
критерия Манна — Уитни [6]. Полученные значения находятся в зоне значимости.
Скорость роста штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI
Для оценки влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста контрольный штамм GS-HIS и штамм GS-AOX1PDI выращивали на жидких средах Mm в условиях индукции промотора гена AOX1. Культивировали в двух параллельных экспериментах. Удельную скорость роста культуры рассчитывали по формуле
р = (lnX-lnX0)//(7; — T0), где X1 и X0 — значения биомассы, соответствующие времени роста 71 и 70 [1]. Данные скорости роста изучаемых штаммов, приведенные на рис. 4, показывают замедленный рост клеток со сверхэкспрессией гена PpPDI.
Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на устойчивость штаммов к восстанавливающим агентам
Исходя из данных, что мутанты pdi бактерий чувствительны к восстанавливающему агенту дитиотрейтолу (DTT), в учебном пособии Мюльберга [8] было высказано предположение, что сверхэкспрессия PpPDI будет придавать устойчивость к восстановителям — DTT и в-меркаптоэтанолу. Данных о влиянии этих соединений на P. pastoris нет. У близких к P. pastoris дрожжей Pichia methanolica добавление в среду 2 — 3 мМ в-меркаптоэтанола приводило к 50 % ингибированию роста вне зависимости от источника углерода [4]. Дрожжи 5. cerevisiae дикого типа растут при 32 мМ концентрации DTT в среде, хотя такая концентрация препятствует росту чувствительных к DTT мутантов hacl [35].
Мы показали, что при 8 мМ DTT и 0,01 мМ в-меркаптоэтанола характер роста у исходного штамма и штамма со сверхэкспрессией гена PpPDI не от-
0,0013x + 0,1136
ч\
y = -0.0< Юбх+0.07 66
Время культивирования, ч Cultivation time, hours
-♦-GS115-HIS -B-GS115-AOX1PDI
Рис. 4. Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста клеток
Fig. 4. Effect of PpPDI gene overexpression on cell growth rate
личался. Повышение концентрации ЭТТ до 16 мМ и в-меркаптоэтанола до 2 мМ приводило к гибели клеток обоих штаммов.
Сравнение одностадийного и двухстадийного культивирования
В качестве несомненного плюса дрожжей Р. РаБ^пБ, как системы для продукции гетерологичных белков, указывается возможность их роста до высокой густоты клеточной суспензии, что увеличивает возможный выход белка. Мы провели культивирование при разных условиях: двухстадийное, искусственно обеспечивающее высокую плотность клеток в среде, и одностадийное, при росте до естественной плотности клеточной суспензии. При одностадийном культивировании плотность биомассы достигала 10 г/л, при двухстадийном — 73 г/л после 48 часов индукции.
Выход белка в исходных штаммах-продуцентах при одностадийном культивировании составил 3,4 ± 1,2 мг/л среды ^Ыа16-Ьит и 2,1 ± 0,7 мг/л ^Ыу-сЬк, при двухстадийном — 6,0 ± 1,3 мг/л ^Ыа16-Ьит и 6,9 ± 1,5 мг/л ^Ыу-сЬк. При двухстадийном культивировании целевого белка в культуральной жидкости оказалось больше на 76 % для ^Ыа16-Ьит и на 228 % для ^Ыу-сЬк.
Средняя продуктивность клеток (количество белка, отнесенное к клеточной массе, мкг/мг) при одностадийной индукции составила 0,37 ± 0,14 мкг/мг для ^Ыа16-Ьит и 0,22 ± 0,08 мкг/мг для ^Ыу-сЬк. При двухстадийной индукции продуктивность составила 0,07 ± 0,03 мкг/мг для ^Ыа16-Ьит и 0,10 ± 0,02 мкг/мг для ^Ыу-сЬк. Видимо, несмотря на снижение продуктивности клеток, при двухстадийной индукции выход белка увеличивается, что обусловлено большей биомассой.
Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на продукцию гетерологичных белков
Сверхэкспрессия гена РрРВ1 при одностадийной схеме культивирования привела к увеличению продукции обоих целевых белков: на 30 ± 10 % для ^Ыа16-Ьит и на 30 ± 4 % для ^Ыу-сЬк. При двухстадийном культивировании увеличилась продукция только ^Ыа16-Ьит — на 19 ± 3 %, а для ^Ыу-сЬк такого влияния не наблюдалось.
Мы столкнулись с тем, что в культуральной жидкости при росте штаммов-продуцентов как ^Ыа16-Ьит, так и ^Ыу-сЬк при сверхэкспрессии гена РрРВ1 появляется большое количество растворимого белка с молекулярной массой около 50 кДА, не присутствующего в культу-ральных средах контрольных штаммов (см. рис. 2).
Для того чтобы выяснить, не является ли этот белок производным целевых белков, мы провели ИФА культуральной жидкости штамма 08-Ьит^ЫА16 с антителами к ^Ыа1!а16-Ьит. Данные ИФА на рис. 5 свидетельствуют, что белок массой 50 кДА не имеет отношения к ^Ыа1!а16-Ьит. Определение природы белка, секре-
тируемого в культуральную среду дрожжами при сверхэкспрессии гена PpPDI, — дело дальнейших экспериментов. Тонкая полоса в районе 40 кДА на рис. 5 может объясняться наличием в пробе ^ЫаИаШ-Ииш в виде ди-мера, так как интерфероны альфа-типа способны образовывать нековалентно связанные димеры [34].
ОБСУЖДЕНИЕ
Уровень продукции секреторного белка не только зависит от уровня транскрипции соответствующего гена и трансляции, но и определяется эффективностью работы всего секреторного аппарата клетки дрожжей. Сворачивание (фолдинг) секреторных белков в ЭР является ключевым этапом в ходе синтеза как собственных, так и гетерологичных белков в клетке и происходит при участии молекулярных шаперонов, в частности РШ-фермен-та, катализирующего образование дисульфидных связей. Эксперименты, проведенные нами, позволяют оценить влияние сверхпродукции РШ в дрожжевой клетке на продукцию гетерологичных интерферонов — ^Ыа16-Ииш и ^Ыу-еИк.
Данные РТ-ПЦР говорят о встройке не более одной дополнительной копии гена. Даже одна дополнительная копия гена под контролем сильного промотора оказывает эффект на скорость роста штамма и продукцию гетерологичных белков. Полученное дробное количество копий гена PpPDI можно объяснить анеуплоидией исследуемого штамма по четвертой хромосоме, где и находится ген PpPDI, а так как референсный ген находится в третьей хромосоме, то он в данном случае не теряет своих рефе-ренсных свойств.
Полученные штаммы со сверхэкспрессией гена PpPDI жизнеспособны и могут быть использованы в дальнейших исследованиях. Наблюдаемое замедление скорости роста в логарифмической фазе согласуется с данными, полученными для дрожжей 5. cerevisiae, в которых сверхэкспрессия гена PDI приводит к такому же эффекту [35]. Как уже было сказано, РШ — мультифункцио-нальный белок и может действовать в клетке и как фермент, и как шаперон. Есть данные, что РШ в условиях теплового стресса может брать на себя часть функций шаперона ЭР — калнексина [43]. Полученные данные позволяют предположить, что повышенная продукция РШ оказывает влияние на различные внутриклеточные процессы. Замедленный рост можно объяснить тем, что сверхэкспрессия гена PpPDI под сильными промотором гена АОХ1, работающим в дополнение к нативной копии АОХ1, приводит к перегрузке аппарата трансляции.
Учитывая функцию Р& в окислительном фолдинге белка, можно было ожидать, что устойчивость штаммов, содержащих лишнюю копию гена PpPDI, к восстанавливающим агентам повысится. Это бы открыло возможность для создания нового вектора для трансформации дрожжей, содержащего дополнительную копию гена PpPDI
Weight, kDa
Вес' ля кДа M
180 -—' 130^
55 43
34 ***
26 Ш
17
Рис. Б. Иммуноблотинг белков культуральных сред: [M] — маркер молекулярной массы белков. Культуральные жидкости штаммов: [K-] — GS-aoxl при одностадийном культивировании, [l] — GS-humIFNAl6 при одностадийном и [2] — при двухстадийном культивировании
Fig. Б. Western-blot analysis of proteins from culture fluids: [M] — protein marker of a certain molecular weight (kDa). Culture fluid probes of strains: [K-] — GS-aoxl in one step cultivation, [l] — GS-humIFNAl6 in one step cultivation and [2] — in two step cultivation
в качестве маркера устойчивости. Однако повышенная устойчивость к DTT или ß-меркаптоэтанолу штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI обнаружена не была. Более того, в сравнении с другими видами дрожжей исходные штаммы P. pastoris проявляли меньшую устойчивость к исследуемым веществам. Исходя из данных, что Pdi действует координированно с белком Erolp, который является донором окисляющих эквивалентов [8], можно предположить, что только совместное повышение экспрессии генов PpPDI и PpEROl способно повысить устойчивость клетки к восстанавливающим агентам.
Выход белка при двухстадийном культивировании оказался выше по сравнению с одностадийным, но наблюдалось падение продуктивности клеток. Возможно, на выход целевого белка негативно влияла высокая густота клеточной суспензии в начале стадии индукции. Нахождение оптимальных условий культивирования штаммов-продуцентов может быть важным фактором повышения выхода рекомбинантных белков.
Несмотря на замедление роста штаммов со сверх -экспрессией гена PpPDI, продукция целевого белка в случае одностадийного культивирования возрастала для обоих целевых белков. При двухстадийном культивировании положительный эффект наблюдался только для IFNalfal6-hum. Можно сделать вывод, что эффект сверхэкспрессии генов-помощников может зависеть от метода культивирования и конкретного гетерологичного белка.
В нашей работе наибольшее положительное влияние сверхэкспрессии гена PpPDI наблюдали для IFNalfal6-hum, содержащего дисульфидные связи, что предсказуемо, исходя из основной функции Pdi. Тем не менее данные о повышении продукции разных модельных белков, отличающихся по строению, наличию дисульфидных связей, углеводного компонента, можно рассматривать как еще одно доказательство того, что помимо непосредственной функции фермента, контролирующего образование дисульфидных связей, Pdi является также ша-пероном и может неспецифично повышать продукцию секретируемых гетерологичных белков. Использование штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI в сочетании с оптимизацией культивирования можно рассматривать как способ повышения эффективности производства интерферонов IFNalfal6-hum и IFNY-chk. Исходя из механизмов окислительного фолдинга, включающего слаженную работу Pdi с Erolp [8], было бы логично ожидать положительного синергичного эффекта при одновременной сверхэкспрессии генов PpPDI и PpEROÍ на выход ре-комбинантных белков.
БЛАГОДАРНОСТИ
Aвторы выражают благодарность A^. Румянцеву и A.E. Зобниной (СПбГУ, лаборатория биохимической генетики) за методическую помощь.
Работа поддержана грантами: СПбГУ 1.38.229.2014, НШ 9513.2016.4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаретова ЛА, Кириенко O.A. Оценка параметров роста микроорганизмов в условиях периодического и непрерывного культивирования. — Хабаровск: Изд-во Тихоокеан. гос. ун-та, 2010. — 16 с. [Garetova LA, Kirienko OA. Ocenka parametrov rosta mikroorganizmov v uslovijah periodicheskogo i nepreryvnogo kul'tivirovanija. Khabarovsk: Izd-vo Tihookean. gos. un-ta; 2010. 16 p. (In Russ.)]
2. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В., Ши-шова М.Ф. Количественный анализ экспрессии генов / Под ред. Е.В. Ермиловой. — 2-е изд. — СПб.: ТЕССA, 2011. - 122 c. [Ermilova EV, Zaluckaja ZhM, Lapina TV, Shishova MF. Kolichestvennyj analiz jekspressii genov. Ed by E.V. Ermilovoj. 2nd ed. Saint Petersburg: TESSA; 2011. 122 p. (In Russ.)]
3. Карабельский A3., Зиновьева Ю.Г., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris — продуцентов химерных белков «альбумин-интерлейкин-2» и «альбумин-интерферон-а16» // Вестник Caнкт-Пeтeрбургского университета. — 2009. — Вып. 2. — Сер. 3. — C. бЗ—6З. [Karabel'skij AV, Zinov'eva JuG, Smirnov MN, Padkina MV. Sozdanie
shtammov drozhzhej Pichia pastoris producentov himernyh belkov "al'bumin-interlejkin-2" i "al'bumin-interferon-a16". Vestnik Sankt-Peterburgskogo uni-versiteta. 2009;2(3):53-63. (In Russ.)]
4. Леонович О.А., Серкова Н.Н., Рабинович Я.М. Токсичность меркаптоэтанола для различных линий дрожжей Pichia methanolica, растущих на различных источниках углерода // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37. - № 1. - С. 96-99. [Leonovich SA, Serkova NN, Rabinovich IM. Toxicity of mercaptoethanol to mutant strains of the yeast Pichia methanolica growing on different carbon sources. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2001;37(1):96-9. (In Russ.)]
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Ред. А.А. Баев, К.Г. Скрябин. - М.: Мир, 1984. -480 с. [Maniatis T, Fritch EE, Sambrook J. Molecular Cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1982:545.]
6. Манн - Уитни, автоматический расчет. Доступно по: http://www.psychol-ok.ru/statistics/mann-whitney/. Ссылка активна на 27.09.2016.
7. Методика выделения ДНК, «Smash and Grab». Доступно по: http://web.mit.edu/biology/guarente/ protocols/quickprep.html. Ссылка активна на 01.09.16.
8. Мюльберг А.А. Фолдинг белка. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. - 176 с. [Mjul'berg AA. Folding belka. Saint Petersburg: Izd-vo S.-Peterb. un-ta; 2004. 176 p. (In Russ.)]
9. Наровлянский А.Н., Ершов Ф.И, Гинцбург А.Л. Ин-терфероны: перспективные направления исследований // Иммунология. - 2013. - № 3. - C. 168-172. [Narovljanskij AN, Ershov FI, Gincburg AL. Interferony: perspektivnye napravlenija issledovanij. Immunologija. 2013;3:168-172. (In Russ.)]
10.Падкина М.В., Парфёнова Л.В., Градобоева А.Е., Самбук Е.В. Синтез гетерологичных интерферо-нов в клетках дрожжей Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46. -№ 4. - С. 448-455. [Padkina MV, Parfenova LV, Gradoboeva AE, Sambuk EV. Heterologous interferons synthesis in yeast Pichia pastoris. Applied Biochemistry and Microbiology. 2010;46(4):409-414. (In Russ.)]
11.Патент РФ на изобретение № 2380405/ 2007. [Patent RUS No 2380405/ 2007. (In Russ.)]
12. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени. - 3-е изд. - М.: БИНОМ, 2011. - 223 c. [Rebrikov DV PCR v real'nom vremeni. Moscow: BINOM; 2011. 223 p. (In Russ.)]
13.Цыганков М.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Синтез модифицированных, устойчивых к протеолити-ческой деградации интерферонов-гамма в дрожжах Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - № 4. - С. 429-436. [Tsygankov MA, Zobnina AE, Padkina MV. Synthesis of recombinant gamma interferons resistant to proteolysis
in the yeast Pichia pastoris. Applied Biochemistry and Microbiology. 2014;50(4):387-393. (In Russ.)]. doi: 10.7868/S055510991404028X.
14. Шишкин С.С., Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. AGR2, ERP57/GRP58 и некоторые другие протеин-дисульфидизомеразы человека // Успехи биологической химии. — 2013. — Т. 53. — С. 81 — 120. [Shishkin SS, Eremina LS, Kovalev LI, Kovaleva MA. AGR2, ERP57/GRP58 i nekotorye drugie protein-disul'fidizomerazy cheloveka. Uspehi biologicheskoj himii. 2013;53:81-120 (In Russ.)]
15.Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VV. S. Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign proteins — Vaccines. Indian Journal of Biotechnology. 2007;6:175-186.
16. Borth N, Mattanovich D, Kunert R, Katinger H. Effect of increased expression of protein disulfide isomerase and heavy chain binding protein on antibody secretion in a recombinant CHO cell line. BiotechnolProg. 2005 Jan-Feb;21(1):106-11. doi: 10.1021/bp0498241.
17. Conn PM. The unfolded protein response and cellular stress. MethodsEnzymol. 2011;489: xvii. doi: 10.1016/ B978-0-12-385116-1.00020-0.
18. Delic M, Valli M, Graf AB, et al. The secretory pathway: exploring yeast diversity. FEMS Microbiol Rev. 2013Nov;37(6):872-914. doi: 10.1111/1574-6976.12020.
19. Farquhar R, Honey N, Murant SJ, et al. Protein di-sulfide isomerase is essential for viability in Sac-charomyces cerevisiae. Gene. 1991; 108( 1 ):81 -9. doi: 10.1016/0378-1119(91)90490-3.
20. Gasser B, Maurer M, Rautio J, et al. Monitoring of tran-scriptional regulation in Pichia pastoris under protein production conditions. BMC Genomics. 2007;19;8:179. doi: 10.1186/1471-2164-8-179.
21. Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microbial Cell Factories. 2008;7:11. doi: 10.1186/1475-2859-7-11.
22. Hsu TA, Watson S, Eiden JJ, Betenbaugh MJ. Rescue of immunoglobulins from insolubility is facilitated by PDI in the baculovirus expression system. Protein Expr Purif. 1996 May;7(3):281-8. doi: 10.1006/ prep.1996.0040.
23. Humphreys DP, Weir N, Lawson A, et al. Co-expression of human protein disulphide isomerase (PDI) can increase the yield of an antibody Fab' fragment expressed in Escherichia coli. FEBS Lett. 1996Feb12;380(1-2):194-7. doi: 10.1016/0014-5793(96)00028-2.
24. Kitchin K, Flickinger MC. Alteration of hybridoma viability and antibody secretion in transfectomas with inducible overexpression of protein disulfide isomer-ase. Biotechnol Prog. 1995Sep-Oct;11(5):565-74. doi: 10.1021/bp00035a011.
25. Liu Z, Liu L, Osterlund T, et al. Improved production of a heterologous amylase in Saccharomyces cerevisiae by
inverse metabolic engineering. Appl Environ Microbiol. 2014Sep;80(17):5542-50. doi: 10.1128/AEM.00712-14.
26. Lodi T, Neglia B, Donnini C. Secretion of human serum albumin by Kluyveromyces lactis overex-pressing KlPDIl and KlEROl. Appl Environ Microbiol. 2005Aug;71(8):4359-4363. doi: 10.1128/ AEM.71.8.4359-4363.2005.
27. Lowenthal JW, Lambrecht B, van den Berg TP, et al. Avian cytokines — the natural approach to therapeutics. Dev Comp Immunol. 2000Mar-Apr;24(2-3):355-65. doi: 10.1016/s0145-305x(99)00083-x.
28. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 2005Mar;22(4):249-70. doi: 10.1002/yea.1208.
29. Mattanovich D, Callewaert N, Rouze P, et al. Open access to sequence: browsing the Pichia pastoris genome. Microb Cell Fact. 20090ct16;8:53. doi: 10.1186/14752859-8-53.
30. Mukaiyama H, Tohda H, Takegawa K. Overexpression of protein disulfide isomerases enhances secretion of recombinant human transferrin in Schizosaccharomy-ces pombe. Appl Microbiol Biotechnol. 2010Apr;86(4): 1135-43. doi: 10.1007/s00253-009-2393-x.
31. Norgaard P, Westphal V, Tachibana C, et al. Functional differences in yeast protein disulfide isomerases. J Cell Biol. 2001Feb5;152(3):553-562. doi: 10.1083/ jcb.152.3.553.
32. Ostermeier M, De Sutter K, Georgiou G. Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbA mutants and increases the yield of a heterolo-gous secreted protein with disulfide bonds. J Biol Chem. 1996May3;271(18):10616-22.
33. Pichia Technology from RCT. Available from: http:// www.pichia.com/science-center/commercialized-prod-ucts/. Accessed December 1, 2016.
34. Radhakrishnan R, Walter LJ, Hruza A, et al. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography. Structure. 1996Dec15;4(12):1453-63. doi: 10.1016/s0969-2126(96)00152-9.
35. The Saccharomyces Genome Database. Available from: http://www.yeastgenome.org/locus/S000000548/ overview. Accessed September 1, 2016.
36. Rand JD, Grant CM. The thioredoxin system protects ribo-somes against stress-induced aggregation. Mol Biol Cell. 2006Jan;17(1):387-401. doi: 10.1091/mbc.e05-06-0520.
37. Ryabova LA, Desplancq D, Spirin AS, Pluckthun A. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat Biotechnol. 1997Jan;15(1):79-84. doi: 10.1038/nbt0197-79.
38. Uniprot No P05015. Available from: http://www.uni-prot.org/uniprot/P05015. Accessed October 30, 2016.
39. Uniprot No P49708. Available from: http://www.uni-prot.org/uniprot/P49708. Accessed October 30, 2016.
40. Warsame A, Vad R, Kristensen T, Oyen TB. Characterization of a gene encoding a Pichia pastoris protein disulfide isomerase. Biochem Biophys Res Commun. 2001Mar;281(5):1176-82. doi: 10.1006/ bbrc.2001.4479.
41. Winter AD, Cormack G, Page AP. Protein disulfide isomerase activity is essential for viability and extracellular matrix formation in the nematode Caenorhab-ditis elegans. Dev Biol. 2007Aug15;308(2):449-61. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.05.041.
42. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. BioTechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.
43. Zhang H, He J, Ji Y, et al. The effect of calnexin deletion on the expression level of PDI in Saccharomyces cerevisiae under heat stress conditions. Cell Mol Biol Lett. 2008;13(1):38-48. doi: 10.2478/s11658-007-0033-y.
44. Zhu T, Guo M, Sun C, et al. A systematical investigation on the genetic stability of multi-copy Pichia pastoris strains. Biotechnol Lett. 2009May;31(5):679-84. doi: 10.1007/s10529-009-9917-4.
INFLUENCE OF PDI GENE OVEREXPRESSION ON HETEROLOGICAL PROTEINS PRODUCTION IN YEAST PICHIA PASTORIS
M.A. Tsygankov, M.V. Padkina For citation: Ecological genetics. 2017;15(2):21-30
* SUMMARY: Background. The yeast Pichia pastoris is used for synthesis of recombinant secretory proteins. Overexpression of assistant genes, coding proteins involved in secretion, is one of approaches to improve the production of target protein. PpPDl gene encodes P. pastoris yeast protein disulfide isomerase (Pdi). The aim of our study was to evaluate the effect of Pdi overproduction on recombinant interferons (human interferon-alfa 16 and chicken interferon-gamma) production. Materials and Methods. PpPDI gene was cloned under the control of the AOX1 gene promoter in plasmid pPICZaA. Primers for AJ302014.1 nucleotide sequence of NCBI data base were used for PpPDI gene cloning. The chromosomal DNA of the GS115 strain was used as a template. To generate strains with PpPDI gene overexpression we used a previously obtained strains producing human interferon-alfa16 and chicken inter-feron-gamma. Yeast transformation was performed by electroporation. Cultivation was performed using single and two-stage strategies in standard media containing methanol as the sole carbon source to induce the AOX1 gene promoter. Results. We obtained interferon-producing strains with PpPDI gene overexpression. Over-expression of the PpPDI gene in yeast P. pastoris increases the production of interferon-alfa16, a protein containing disulfide bonds, regardless of the mode of cultivation. Effect of PpPDI gene over-expression on the production of interferon-gamma — the protein without disulfide bonds, depends on cultivation mode. Conclusion. PpPDI gene overexpression can be used to enhance the production of interferons and other proteins that contain disulfide bonds. Effect of PpPDI gene overexpression on recombinant proteins without disulfide bonds may depend on cultivation procedure.
* KEYWORDS: Pichia pastoris; heterologous gene expression; Pdi; recombinant interferons.
Ф Информация об авторах
Михаил Александрович Цыганков — инженер-исследователь, лаборатория биохимической генетики, кафедра генетики и биотехнологии. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Марина Владимировна Падкина — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимической генетики, кафедра генетики и биотехнологии. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
* Information about the authors
Mikhail A. Tsygankov — engineer-researcher, Laboratory of biochemical genetics, Department of Genetics and Biotechnology. St Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: mial. [email protected].
Marina V. Padkina — PhD, leading researcher, Department of Genetics and Biotechnology. St Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
