CC BY
13УДК 633.494:631.527
Г.В. Мозгова1, Н.Е. Хоружий1, А.В. Амосова2, Я.Э. Пилюк3, В.М. Белявский3, С.Ю. Храмченко3,
О.В. Муравенко2, В.А. Лемеш1
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ РАПСА (BRASSICA NAPUS) В СВЯЗИ С МОРОЗОСТОЙКОСТЬЮ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: N.horuzhiy@igc.by 2Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН Россия, 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32 3НПЦ НАН Беларуси по земледелию Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Тимирязева, 1
Выявлены ДНК-маркеры (Bn0110, BoCCA1-1R1 и BoCCA1-2R1), позволяющие детектировать локусы количественных признаков и аллели генов, ассоциированные с повышенной и пониженной морозостойкостью озимого рапса. Выделены генотипы, маркированные по генам, ассоциированным с устойчивостью к низким температурам. Установлено, что 31 из 56 проанализированных образцов несут QTL Bn0110, ассоциированный с устойчивостью к пониженным температурам. Анализ сортов с помощью молекулярных маркеров, ассоциированных с аллелями генов генома С B.napus, определяющих устойчивость и восприимчивость генотипов к низким температурам, показал, что аллель BoCCAl-1, характерный для устойчивых к холоду генотипов, содержится в геномах 10 из 56 проанализированных образцов. При этом BoCCA1-2R1, характерный для восприимчивых генотипов, присутствует у 46 из 56 образцов, что необходимо учитывать при подборе родительских пар в селекции на морозостойкость. Молекулярно-цитогенетический анализ выявил сортовую специфичность сочетаний полиморфных вариантов разных хромосом в кариотипах озимых сортов рапса. У наиболее зимостойких сортов российской (Норд и Северянин) и белорусской (Зорны) селекции обнаружено сходство по распределению и размерам выявленных хромосомных маркеров и идентичность сочетаний полиморфных вариантов гомологичных хромосом, несущих локусы 45S и/или 5S рДНК. Наиболее широкий хромосомный полиморфизм по локализации и размерам локусов 45S и 5S рДНК наблюдается у самых зимостойких сортов озимого рапса, которые широко районированы, в том числе в районах рискованного земледелия (Красноярский край, Россия).
Ключевые слова: рапс, морозостойкость, молекулярные и хромосомные маркеры.
Введение
Влияние низких температур на жизнедеятельность растений (холодовой стресс) определяется совокупностью двух стрессовых факторов — охлаждения (воздействия низких положительных температур в диапазоне от 0 до 15 °С) и замораживания (воздействия температур ниже 0 °С) [1, 2]. Известно, что изменение температуры в зимний и весенний период влияет на все важнейшие стадии репродуктивного цикла, включая гаметогенез, опыление, оплодотворение и эмбриогенез [3]. Выращивание новых сортов в определенных условиях окружающей среды определяет необходимость создания сортов с соответствующим набором
признаков и разработки агротехнических приемов, которые обеспечат устойчивость к абиотическим и биотическим стрессам, а также максимальную урожайность.
В работе [1] описаны два механизма устойчивости к замораживанию — избегание формирования кристаллов льда в тканях и активация специфических защитных механизмов, позволяющих адаптироваться к низкотемпературным условиям. Некоторые растения могут избежать замораживания путем переохлаждения (охлаждение до температур ниже нуля без формирования льда), значительно увеличивая концентрацию осмолитов внутри клетки (гидрофильных белков, углеводов, бетаина, про-
лина и др.), которые связывают воду, что препятствует образованию кристаллов льда [4]. Однако было обнаружено, что это состояние является временным и неспособно противостоять значительному понижению температуры, а также неэффективно, если низкая температура сохраняется в течение длительного периода времени. Активация механизмов устойчивости представляет собой сложный процесс, который приводит к изменению метаболизма и экспрессии множества генов растения [5].
Установлено, что во время холодового стресса происходит изменение текучести липидов клеточной мембраны, что приводит к потере пластичности и ужесточению ее структуры [6]. Это является необходимым условием для передачи холодового сигнала внутрь клетки. Активация неизвестных кальциевых каналов в плазматической и вакуолярной мембранах приводит к потоку ионов кальция из апопласта и вакуоли в цитозоль. Значительное повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме приводит к активации кальмодулинов, кальций-зависимых протеинкиназ, протеинфосфатаз, фосфолипазы С и МАР-киназного каскада [3]. В конечном итоге холодовой сигнал трансду-цируется в ядро, где происходит фосфорилиро-вание транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов холодового ответа [7]. Например, у В. парт установлена холодовая индукция промотора В№15 [8], необходимым условием для которой является приток ионов кальция. Значительное влияние на метаболизм растений во время холодового ответа оказывает изменение экспрессии генов синтеза растительных гормонов (салициловой и абсцизовой кислот, гиббереллинов [7], что приводит к ин-гибированию роста и запуску систем захвата реактивных форм кислорода, повреждающих различные внутриклеточные структуры.
У морозоустойчивых растений семейства Brassicaceae в плазматических мембранах повышено содержание ненасыщенных жирных кислот, что обуславливает фазовый переход липидов мембран из жидкокристаллического состояния в гель при отрицательных температурах [3]. В состоянии геля резко снижается проницаемость мембран. Кроме того, у морозоустойчивых растений активируется синтез криопротекторов — гидрофильных белков, моно- и олигосахаридов, пролина, бетаина
и др. Вода, входящая в состав гидратных оболочек этих веществ, не замерзает и не выходит из клеток. В клеточной стенке эфективными криопротекторами являются гемицеллюлозы. Они обволакивают растущие кристаллы льда, замедляя их рост и препятствуя формированию новых центров нуклеации льда. Факторы транскрипции и эффекторные гены, участвующие в холодовом ответе, в совокупности называются генами, регулируемыми холодом (COR) [5]. У A. thaliana охарактеризованы индуцируемые холодом гены COR78 и COR15a [9]. Факторы, связывающие C-повторы (C-repeat binding factor, CBF), у растений семейства Brassicaceae являются ключевыми элементами ответа на холодовой стресс. Их экспрессия начинается уже через 15 минут холодового воздействия. Факторы CBF связываются с промоторами генов, регулируемых холодом, и активируют их экспрессию, что приводит к повышению морозоустойчивости растения. Роль факторов CBF в холодовом ответе подчеркивается тем фактом, что сверхэкспрессия гена CBFI A. thaliana у трансгенного табака приводит к приобретению последним конститутивной морозоустойчивости [4, 9].
Методы скрининга, позволяющие точно оценить зимостойкость, имеют решающее значение для программ исследований озимых культур. Выживаемость в полевых условиях, измеряемая как процент растений, переживших зиму, является наиболее часто используемым методом [10]. Существующие трудности проведения полевых испытаний стимулировали интерес к разработке методов, которые дополнили бы полевой скрининг.
Учитывая тот факт, что большинство генов, отвечающих за устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, являются количественными [11], одним из подходов для разработки новых холодоустойчивых сортов является идентификация специфических генетических детерминант устойчивости к холоду, интрогрессия обнаруженных локусов в геномы элитных сортов, а также селекция желаемых линий при помощи молекулярных маркеров.
Рапс (Brassica napus L. 2n = 38 AACC) является хозяйственно-ценной культурой и природным аллополиплоидом, геном которого образовался в результате спонтанного скрещивания
капусты огородной (Brassica oleracea L., 2n = 18, СС) и сурепицы (Brassica rapa L., 2n = 20, AA) c последующим удвоением числа хромосом [12]. А- и С-субгеномы рапса являются близкородственными [13]. Поскольку рапс и сурепица являются также родственниками A. thaliana и показана значительная гомология между их геномами, это позволяет разрабатывать молекулярные маркеры к сложно наследуемым признакам, например, определяющим качественную и количественную устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам. Было обнаружено, что у сурепицы отсутствует около 35% генов, входящих в состав генома A. thaliana, однако гены, кодирующие белки, участвующие в сигнальной транс-дукции, а также транскрипционные факторы сохраняют высокий уровень гомологии [3]. Расшифровка последовательностей генома растений семейства Brassicaceae также увеличивает возможность детекции полиморфизмов по многим агрономически важным генам-кандидатам, в том числе по последовательностям, связанным с морозоустойчивостью.
Генетическая изменчивость существующего селекционного материала рапса ограничена вследствие интенсивной селекции по специфическим признакам, определяющим качество масла и семян. Во многих исследованиях продемонстрирована пригодность использования молекулярных маркеров для оценки генетической изменчивости рапса [14]. Большинство генетических карт, имеющихся на данный момент, построены на основе RFLP- и SRAP-маркеров. Также продемонстрирована эффективность использования SSR-маркеров для четкой дифференциации ярового и озимого рапса [15].
Молекулярные методы анализа микросател-литных последовательностей (SSR), однону-клеотидных полиморфизмов (SNP), маркерных экспрессирующихся последовательностей (EST) и др. широко используются для идентификации генов растений, имеющих важное экономическое значение [16].
Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в кариотипе рапса выявляется большое число сайтов локализации рибосом-ных генов, которые используются для идентификации хромосом [17, 18]. Ранее было также обнаружено наличие меж- и внутрисортового
полиморфизма по числу и распределению 45S и 5S рДНК локусов у B. napus различной селекции, который был выше у озимых сортов по сравнению с яровыми [18].
Для понимания функциональной геноми-ки абиотического стресса важным является осуществление научно-исследовательских инициатив, связанных с изучением стресс-индуцируемых генов в различных условиях окружающей среды, поскольку механизмы стрессовых воздействий и задействованные пути синтеза метаболитов в таких условиях могут отличаться. Следовательно, будут отличаться и подходы к отбору селекционно-ценных форм. Вместе с тем межинститутских инициатив по поиску молекулярных маркеров морозоустойчивости с применением комплексного подхода по анализу сложного генома растений семейства Brassicaceae немного. В связи с этим наше исследование, направленное на изучение внутривидового генетического полиморфизма сортов озимого рапса с помощью SSR и SCAR маркеров, а также хромосомного полиморфизма в кариотипах с помощью FISH с зондами 45S и 5S рДНК и DAPI-дифференциального окрашивания с целью поиска молекулярных и хромосомных маркеров, ассоциированных с морозостойкостью, является новым и актуальным.
Материалы и методы
Материалом для молекулярных исследований послужила коллекция сортов озимого рапса, выведенных в разных регионах мира (56 образцов) и различных по степени устойчивости к низким температурам (табл. 1). Ци-тогенетические исследования выполнены на шести озимых сортах российской и белорусской селекции (табл. 2). Образцы были получены из коллекций НПЦ по земледелию НАН Беларуси (РБ), ВИР им. НИ. Вавилова и Федерального научного центра кормопроизводства и агроэкологии им. В.Р. Вильямса (РФ).
Выделение геномной ДНК из листьев индивидуальных растений рапса проводилось при помощи набора реактивов Genomic DNA Purification Kit согласно инструкции производителя (Thermo Fisher Scientific). Концентрацию и чистоту (определение отношения A260/ A280) ДНК определяли при помощи спектрофотометра Implen NP60.
Таблица 1
Коллекция сортов озимого рапса
Название сорта Страна происхождения Название сорта Страна происхождения
Аранго Франция Столичный Россия
Аризона Франция Лауреат Россия
Атензо Франция Горизонт Россия
Атора Германия НОРД Россия
Зенит Беларусь Северянин Россия
Зорны Беларусь Schnitt gruner Германия
Импрессион Германия Sutton's Favourite Великобритания
Ментор Германия Asparagus Великобритания
Мерседес Германия Schnitt brauner Германия
Минерва Германия Tall Scotch Curled Канада
Коллинс Германия Pabularia Новая Зеландия
Ориолус Германия Hungry gar Великобритания
Сафер Германия Васэ Абурана Япония
Тайфун Германия Кавангаре Япония
Трумпф Германия Dunne Германия
Трой Германия Orig Senraps Швеция
Туре Германия Forrajero Перу
Фенцер Германия Ветразь Беларусь
Эдимакс Германия Svalof Victoria Швеция
Делфи Германия Местная Россия
Эйнштейн Германия Rapido Финляндия
Кристалл Германия Gruber Финляндия
Адмирал Франция Латвийская б Латвия
Артога Франция Злата Российская Федерация
Кларус Германия Okute Oosaka Shirona Япония
Куга Германия Goseki Late Япония
Альбатрос Франция Ova Dauhnfeldt Дания
Андерсон Франция Brunstadnepe Норвегия
Целевые фрагменты ДНК амплифицирова-ли с локус-специфическими парами прайме-ров, фланкирующими участки последовательностей генов, детерминирующих различия в
зимостойкости и устойчивости к замораживанию у рапса.
ПЦР проводили на амплификаторе Simpli-Amp Thermal Cycler (Applied Biosystems) со
следующими условиями реакции: 95 °С — 5 мин; 35 циклов: 95 °С — 30 с, 60 °С — 30 с, 72 °С — 1 мин; 72 °С — 5 мин. Реакционная смесь содержала 100 нг геномной ДНК, 1 цМ dNTP, 1,5 mM MgCl2, 10x ПЦР-буфер (650 mM Tris-HCl, 166 mM (NH4)2SO4, 0,2% твин-20, pH 8,8), 0,25 цМ каждого праймера и 1 U Taq-полимеразы (Праймтех, Республика Беларусь) в общем объеме 25 ц1. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле с добавлением раствора бромида этидия до конечной концентрации 0,5 pg/ml при напряжении 100 В. Результаты электрофореза документировали с помощью системы гель-документации Bio-Rad GelDoc 2000.
Хромосомные препараты рапса готовили из корневой меристемы рапса по методике, разработанной ранее для мелкохромосомных видов растений с использованием предобработки ин-теркалятором ДНК — 9-аминоакридином [19].
Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с зондами 45S и 5S рДНК и DAPI-дифференциальное окрашивание хромосом проводили по описанным ранее методикам [20].
Просмотр хромосомных препаратов, отбор метафазных пластинок и их анализ проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX61, сопряженного с черно-белой ПЗС (прибор с зарядовой связью) камерой
CoolSnap (RoperScientific Inc., США). Анализировали не менее 15 выбранных метафазных пластинок каждого образца с хорошим разбросом хромосом. Полученные изображения хромосом обрабатывали с помощью стандартных компьютерных методик улучшения изображения Adobe Photoshop 10.0 (Adobe Systems Inc., Birmingham, USA). Идентификацию хромосом проводили в соответствии с морфологией хромосом и распределением выявленных хромосомных маркеров [21-24].
Результаты и обсуждение
Для оценки морозоустойчивости генотипов озимого рапса был проведен поиск молекулярных маркеров, позволяющих локализовать гены, отвечающие за эти признаки. В работе Rakic et al. [10] выявлен доминантный SSR-маркер Bn0110, тесно сцепленный с одноименным локусом количественной устойчивости. С помощью SSR-маркера Bn0110 нами проанализирована коллекция озимых сортов рапса (рис. 1). Установлено, что из 56 образцов в 31 образце присутствует QTL Bn0110 (размер фрагмента 350 п. н.).
Циркадные ритмы играют критическую роль в регуляции множества физиологических и метаболических процессов у растений. Белок CCA1 (Circadian Clock Associated 1, транс-
Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагмента Bn0110 (праймеры Bn0110F и Bn0110R). Дорожки 1-56 — образцы растений рапса; М — маркер молекулярного веса (GeneRuler 100bp Plus, Thermo
Fisher Scientific)
крипционный фактор семейства MYB) играет важную роль в фитохром-зависимой индукции фотосинтетических генов и регуляции циркад-ных ритмов. CCA1 участвует в позитивной регуляции холодового ответа у растений путем индукции экспрессии CBF-генов в условиях низкой температуры [25]. Это повышает вероятность того, что различные аллели гена CCA1 могут отвечать за различия многих сельскохозяйственных культур в уровне устойчивости к низким температурам.
Song et al. [11] разработали молекулярные маркеры BoCCA1-1R1 и BoCCA1-2R1, позволяющие детектировать наличие делеций и инсерций в двух различных аллелях гена CCA1 капусты огородной Brassica oleracea (BoCCAl-1 и BoCCAl-2), а также продемонстрировали эффективность этих маркеров для дифференциации устойчивых и чувствительных к низким отрицательным температурам генотипов капусты. Поскольку рапс B. napus произошел в результате скрещивания сурепицы (n = 10, геном AA) с капустой (n = 9, геном CC) и последующего удвоения числа хромосом [26], данные ДНК-маркеры были использованы нами для идентификации морозостойких форм рапса. Установлено, что праймеры, фланкирующие аллель BoCCAl-1, позволяют амплифицировать последователь-
ности различных размеров: у устойчивых к холоду сортов рапса — фрагмент размером 1000 п. н., у восприимчивых — 750 п. н. [11].
Верификация коллекции образцов рапса при помощи SCAR-маркера ВоССА1-1Ю показала, что аллель ВоССА1-1, характерный для устойчивых к холоду сортов рапса, содержится в 10 геномах из 56 проанализированных сортов (рис. 2).
SCAR-маркер ВоССА1-2Ю ассоциирован с аллелем ВоССА1-2 гена ССА1, который вносит вклад в общую устойчивость рапса к низким температурам. Праймеры, фланкирующие последовательность маркера, позволяют ампли-фицировать фрагмент размером 800 п. н. для восприимчивых образцов. Использование ДНК-маркера ВоССА1-2Ю позволило детектировать последовательность, определяющую восприимчивость, у 46 из 56 проанализированных образцов (рис. 3), что необходимо учитывать при подборе родительских пар в селекции на морозостойкость.
Проведенный в данной работе анализ карио-типов и DAPI-бэндинг выявил наличие у всех исследуемых сортов рапса характерный для рапса аллополиплоидный кариотип (2п = 38), представленный двумя А- и С-субгеномами с хромосомами размером 3,5-7 мкм. Крупные гетерохроматические DAPI-бэнды расположены
700 п. н.
700 п. н
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 М
BoCCÄl-1 (восприимчивый)
— **
- шщ »■' 'wiii# % ■ т ш^тШШт
С -1 о - Г -> , о г- «-> ~ о rj
М 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 М _ ВоССА1-1
(устойчивый) н
Рис. 2. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагмента BoCCA1-1 (праймеры BoCCA1-F и BoCCA1-1R1). Дорожки 1-56 — образцы растений рапса; М — маркер молекулярного веса (GeneRuler 100bp Plus, Thermo
Fisher Scientific)
Рис. 3. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагмента BoCCA1-2 (праймеры BoCCA1-F и BoCCA1-2R1). Дорожки 1-56 — образцы индивидуальных растений рапса; М — маркер молекулярного веса (GeneRuler
100bp Plus, Thermo Fisher Scientific)
в основном в прицентромерных районах хромосом, а средние и небольшие DAPI-бэнды — преимущественно в теломерных и интеркаляр-ных районах хромосом.
В табл. 2 представлены полиморфные варианты хромосом, несущие кластеры рибо-сомных генов, наблюдаемые у исследуемых сортов рапса. FISH-анализ с зондами 45 S и 5S рДНК выявил в кариотипах исследуемых сортов наличие 12-16 сайтов 45S рДНК и 10-14 сигналов 5S рДНК. Кроме того, внутривидовой полиморфизм по размеру локусов 45S и
Локализация сайтов 45S и 5S рДНК в
5S рДНК выявлен на хромосомах 2А, 3А, 4А, 4С и 8С (табл. 2). В кариотипах образцов сорта Северянин наблюдался полиморфизм как по числу 45S рДНК (14-15-16 сайтов), так и по числу 5S рДНК локусов (12-13-14). При этом, в кариотипах выявлены как гомоморфные, так и гетероморфные сочетания гомологов хромосомы 4А (табл. 2).
Полученные результаты согласовываются с описанным ранее для В. парт высоким уровнем внутривидового полиморфизма по локализации на хромосомах рДНК сайтов [17, 18, 24].
Таблица 2
кариотипах изучаемых сортов рапса
Генотип Хромосомы A- и C-субгеномов с отдельными 45S рДНК Хромосомы A- и C-суб-геномов с отдельными 5S рДНК Хромосомы A- и C-субгеномов с ко-локализованными 45S+5S рДНК Общее число сигналов 45S/5S рДНК в кариотипе
7C/8CS ЯОР 2А L ПЦ/ПК 10А S СТ 4С L ПЦ/МД 1A L ПК 3A L ПК 4А L ПК 5A S ЯОР
Лауреат К/К С/0 С М/С К/М К/К 0/0 К/С 14/12
Горизонт К/К С/0 С С/0 К/М С/С 0/0 К/С 12/10
Норд К/К C/M С С/0 К/М С/С С/0 К/С 16/12
Северянин К/К С/М С М/С К/М К/К 0/0 С/М К/С 14-1516/12-13-14
Примечание. Наблюдаемые варианты размеров рДНК сайтов: К — крупный, С — средний, М — мелкий; L ПЦ / ПК / ДС/ МД — сайты рДНК, расположенные в прицентромерном районе / проксимальном районе / медианном районе / дистальном районе длинного плеча хромосомы; S ЯОР / СТ — сайты рДНК, локализованные в районе вторичной перетяжки спутничной хромосомы / субтеломерном районе короткого плеча хромосомы
Продолжение табл. 2
Генотип Хромосомы A- и C-субгеномов с отдельными 45S рДНК Хромосомы A- и С-суб-геномов с отдельными 5S рДНК Хромосомы A- и С-субгеномов с ко-локализованными 45S+5S рДНК Общее число сигналов 45S/5S рДНК в кариотипе
7C/8CS ЯОР 2А L ПЦ/ПК 10А S СТ 4С L ПЦ/МД 1A L ПК 3A L ПК 4А L ПК 5A S ЯОР
Столичный К/К С/М С С/М К/М К/С 0/0 К/С 14/12
Зорны К/К C/M С С/0 К/М С/С С/0 К/С 16/12
Ветразь К/С С/0 С М/С К/М С/М С/М К/С 14/10
У наиболее зимостойких сортов российской (Норд и Северянин) и белорусской (Зорны) селекции обнаружено сходство по распределению и размерам выявленных хромосомных маркеров. При этом у сорта Северянин выявлен гетероморфизм гомологов. Эти сорта имеют наиболее широкое районирование, в том числе в районах рискованного земледелия (Красноярский край, РФ), что указывает на его высокие адаптационные свойства.
Заключение
Озимый рапс характеризуется как высокотехнологичная и продуктивная масличная культура. Однако низкие температуры представляют собой один из основных факторов, угрожающих производству рапса. Строгое соблюдение технологии возделывания является одним из решений, позволяющим предотвратить потери культуры при перезимовке. Вторым решением является создание устойчивых к отрицательным температурам сортов озимого рапса. Для этого необходимо идентифицировать морозостойкую зародышевую плазму у выращиваемых на территории Беларуси и России генотипов озимого рапса и использовать ее в селекции современных сортов.
Целью нашего исследования являлась идентификация молекулярных маркеров, ассоциированных с генами, вносящими вклад в морозоустойчивость, а также поиск хромосомных маркеров, ассоциированных с устойчивостью к низким температурам, на основе изучения
внутривидового хромосомного полиморфизма в кариотипах сортов озимого рапса с помощью FISH с зондами 45S и 5S рДНК и DAPI-дифференциального окрашивания, что позволит выявить с помощью спектра маркеров морозоустойчивые сорта рапса для дальнейшего селекционного процесса по данному признаку.
В исследовании использовано три ДНК-маркера (Bn0110, BoCCA1-1R1 и BoCCA1-2R1), которые позволяют детектировать гены, ассоциированные с повышенной и пониженной устойчивостью озимого рапса к низким температурам. С помощью ДНК-маркеров проведено типирование коллекции озимых сортов рапса по генам, определяющим морозоустойчивость. Установлено, что 31 из 56 проанализированных образцов несут QTL Bn0110, ассоциированный с устойчивостью к пониженным температурам. Анализ сортов с помощью молекулярных маркеров, ассоциированных с аллелями генов генома С B. napus, определяющими устойчивость и восприимчивость генотипов к низким температурам, показал, что аллель BoCCA1-1, характерный для устойчивых к холоду генотипов, содержится в геномах 10 из 56 проанализированных образцов. При этом аллель BoCCA1-2R1, характерный для восприимчивых генотипов, присутствует у 46 из 56 образцов, что необходимо учитывать при подборе родительских пар в селекции на морозостойкость.
Проведенный молекулярно-цитогенетиче-ский анализ выявил сортовую специфичность
сочетаний полиморфных вариантов разных хромосом в кариотипах озимых сортов рапса. У наиболее зимостойких сортов российской (Норд и Северянин) и белорусской (Зорны) селекции обнаружено сходство по распределению и размерам хромосомных маркеров и идентичность сочетаний полиморфных вариантов гомологичных хромосом, несущих локусы 45S и/или 5S рДНК. Наиболее широкий хромосомный полиморфизм по локализации и размерам локусов 45S и 5S рДНК наблюдается у самых зимостойких сортов озимого рапса, которые широко районированы, в том числе в районах рискованного земледелия (Красноярский край, РФ).
Следует отметить, что в Беларуси и России исследования подобного рода проводятся впервые, и их результаты в перспективе могут использоваться в селекции при получении новых отечественных озимых сортов рапса с повышенной морозоустойчивостью, что позволит избежать или минимизировать существенные потери урожая во время суровых зим.
Работа выполнена врамках договора Б18Р-108, подпрограммы «Структурная и функциональная геномика» ГПНИ «Биотехнологии» (Беларусь), а также поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований (проект № 18-54-00027Бела).
Список использованных источников
1. Levitt, J. Responses of Plants to Environmental Stress, 2nd Edition, Volume 1: Chilling, Freezing, and High Temperature Stresses. / J. Levitt // Responses of Plants to Environmental Stress, 2nd Edition, Volume 1: Chilling, Freezing, and High Temperature Stresses. — 1980. — Vol. 1. - P. 28-39.
2. Hale, M.G. The physiology of plants under stress. / M.G. Hale, D M. Orcutt // The physiology of plants under stress. — 1987. — Vol. 3. — P 332-340.
3. Amanga, A.O. Prospects for transgenic and molecular breeding for cold tolerance in canola (Brassica napus L.). / A.O. Amanga // Oilseeds. — 2012. — P. 108-129.
4. Cook, G. Genetically Modified Language: The Discourse of Arguments for GM Crops and Food. Genetically Modified Language / G. Cook. — Routledge, 2004. — Vol. 12. — P. 581-588.
5. Thomashow, M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms / M.F. Thomashow // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. — 1999. — Vol. 50, № 1. — P. 571-599.
6. Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity / B.L. Örvar [et al.] // The Plant Journal. — 2000. — Vol. 23, № 6. — P. 785-794.
7. Chinnusamy, V. Cold stress regulation of gene expression in plants / V. Chinnusamy, J. Zhu, J.-K. Zhu // Trends in Plant Science. — 2007. — Vol. 12, № 10. — P. 444-451.
8. An Overview of Cold Resistance in Plants / L.-J. Chen [et al.] // Journal of Agronomy and Crop Science. — 2014. — Vol. 200, № 4. — P. 237-245.
9. Gilmour, S.J. cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaliana / S.J. Gilmour, N.N. Artus, M.F. Thomashow // Plant Mol Biol. — 1992. — Vol. 18, № 1. — P. 13-21.
10. Rakic, B. Genetic variability between several Brasicaceae populations of different winter survival ability / B. Raki. — P. 3.
11. Allelic variation in Brassica oleracea Cir-cadian Clock Associated 1 (BoCCA1) is associated with freezing tolerance / H. Song [et al.] // Hortic. Environ. Biotechnol. — 2018. — Vol. 59, № 3. — P. 423-434.
12. Soltis, D.E. Molecular Data and the Dynamic Nature of Polyploidy / D.E. Soltis, P.S. Soltis, D.L.H. Rieseberg // Critical Reviews in Plant Sciences. — 1993. — Vol. 12, № 3. — P. 243-273.
13. Frequent nonreciprocal translocations in the amphidiploid genome of oilseed rape (Brassica napus) / A.G. Sharpe [h gp.] // Genome. — 1995. — Vol. 38, № 6. — P. 1112-1121.
14. Snowdon, R.J. Molecular markers in Bras-sica oilseed breeding: current status and future possibilities / R.J. Snowdon, W. Friedt // Plant Breeding. — 2004. — Vol. 123, № 1. — P. 1-8.
15. Plieske, J. Microsatellite markers for genome analysis in Brassica. I. development in Brassica napus and abundance in Brassicaceae species / J. Plieske, D. Struss // Theor Appl Genet. — 2001. — Vol. 102, № 5. — P. 689-694.
16. Quiros, C.F. Molecular Markers and Their Application to Genetics, Breeding and Evolution of Brassica (Utilization of DNA-Marker for Breeding and Classification in Horticultural
Plants, For Further Development of Horticulture in East Asia) / C.F. Quiros // Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. — 1998. — Vol. 67, № 6. — P. 1180-1185.
17. Xiong, Z. Homoeologous shuffling and chromosome compensation maintain genome balance in resynthesized allopolyploid Brassica na-pus / Z. Xiong, R.T. Gaeta, J.C. Pires // PNAS. — 2011. — Vol. 108, № 19. — P. 7908-7913.
18. Intraspecific chromosomal and genetic polymorphism in Brassica napus L. detected by cytogenetic and molecular markers / A.V. Amosova [et al.] // J Genet. — 2014. — Vol. 93, № 1. — P. 133-143.
19. 9-Aminoacridine: An efficient reagent to improve human and plant chromosome banding patterns and to standardize chromosome image analysis / O.V. Muravenko [et al.] // Cytometry Part A. — 2003. — Vol. 51A, № 1. — P. 52-57.
20. Comparison of genomes of eight species of sections Linum and Adenolinum from the genus Linum based on chromosome banding, molecular markers and RAPD analysis / O.V. Muravenko [et al.] // Genetica. — 2009. — Vol. 135, № 2. — P. 245-255.
21. Levan, A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes / A. Levan, K. Fredga, A.A. Sandberg // Hereditas. — 1964. — Vol. 52, № 2. — P. 201-220.
22. Integration of the Cytogenetic and Genetic Linkage Maps of Brassica oleracea / E.C. Howell [et al.] // Genetics. — 2002. — Vol. 161, № 3. — P. 1225-1234.
23. Karyotype variation and conservation in morphotypes of non-heading Chinese cabbage / J. Zheng [et al.] // Plant Syst Evol. — 2015. — Vol. 301, № 7. — P. 1781-1791.
24. Genomic changes in generations of synthetic rapeseed-like allopolyploid grown under selection / A.V. Amosova [et al.] // Euphytica. — 2017. — Vol. 213, № 9. — P. 217.
25. Green, R.M. Loss of the circadian clock-associated protein 1 in Arabidopsis results in altered clock-regulated gene expression / R.M. Green, E M. Tobin // PNAS. — 1999. — Vol. 96, № 7. — P. 4176-4179.
26. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome / B. Chalhoub [et al.] // Science. — 2014. — Vol. 345, № 6199. — P. 950-953.
G.V. Mozgova1, N^. Horuzhiy1, A.V. Amosova2, Ya.E. Pilyuk3, V.M. Belyavsky3, S.Yu. Khramchenko3,
O.V. Muravenko2, V.A. Lemesh1
GENETIC POLYMORPHISM OF BRASSICA NAPUS RELATED TO
COLD TOLERANCE
institute of Genetics and Cytology of NASB Minsk, 220072, the Republic of Belarus 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, RAS Moscow, 119991, Russia 3Research and Practical Center of the National Academy of Sciences of the Republic of Belarus for Arable Farming Zhodino, 222160, the Republic of Belarus
DNA markers (Bn0110, BoCCA1-1R1 and BoCCA1-2R1), which allow detecting the loci of the quantitative traits and also alleles of the genes linked both to low and high winter resistance in winter rapeseed, were revealed. The genotypes which were marked according to the genes related to cold tolerance were identified. Out of 56 studied specimens, 31 specimens were found to have QTL Bn0110 associated with cold tolerance. The analysis of rapeseed varieties with the use of molecular markers associated with the alleles of genes in the B. napus C genome and related to cold tolerance and sensibility of genotypes demonstrated that the allele BoCCA1-1 (specific to cold tolerant genotypes) was revealed in the genomes of 10 out of 56 studied specimens. Besides, BoCCA1-2R1 (specific to sensitive genotypes) was absent in 46 out of 56 studied specimens. These results should be taken into account when selecting potential parents in breeding for cold tolerance. Molecular cytogenetic analysis indicated the variety-specific combinations of polymorphic variants of different chromosomes in karyotypes of the studied winter B. napus. In most winter resistant varieties of Russian (Nord and Severyanin) and Belarusian (Zorny) breeding, the similarity in distribution and sizes of the revealed chromosomal markers, as well as similar combinations of polymorphic variants of homologous chromosomes bearing 45S and 5S rDNA, were detected. All studied varieties are considered to be winter resistant and widely regionalized, including the areas of risk farming (Krasnoyarsk territory). Our findings demonstrated that the most winter resistant varieties of B. napus had the highest level of chromosomal polymorphism by the localization and sizes of 45S and 5S rDNA loci.
Key words: B. napus, winter resistance, molecular and chromosomal markers.
Дата поступления статьи: 4 февраля 2019 г.
