CC BY
7DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-18-30 УДК 504.06: 575.856(476)(047.31)
В. А. Лемеш, В. Н. Кипень, Г. В. Мозгова, Л. В. Хотылёва
ВАРИАЦИЯ ЧИСЛА КОПИЙ УЧАСТКОВ ДНК, АССОЦИИРОВАННЫХ С ХОЛОДОУСТОЙЧИВОСТЬЮ, ДЛЯ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА BRASSICACEAE
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: V.Lemesh@igc.by
Определено относительное число копий (CNV) на геном по пяти генетическим маркерам BnGMS180, BrGMS102, BrgMS372, BrGMS4511 и SSROllO, ассоциированных с устойчивостью к пониженным температурам и морозостойкостью, для 51 сорта культурных растений семейства Brassicaceae с широким ареалом возделывания. Показано, что наибольшим спектром вариаций значения CNV обладает генетический маркер BnGMS180, диапазон значений варьировал от 0,48 (сорт рапса Мартын, Беларусь) до 12,61 (сорт брюквы Sutton's Favorite, Швеция). Для остальных генетических маркеров вариация значения CNV незначительна.
Ключевые слова: CNV, Copy Number Variation, число копий участков ДНК, Brassicaceae, генетические маркеры, холодоустойчивость.
Введение
Культурные сорта растений семейства Brassicaсeae прошли долгую историю одомашнивания, поэтому некоторые его разновидности характеризуются высокой устойчивостью к пониженным температурам и морозостойкостью. Показано, что устойчивость к пониженным температурам тесно связана с процессами, происходящими в клеточных мембранах растений, изменением синтеза ферментов и активизацией физиологически активных систем защиты растений [1-3]. Известно, что в формировании толерантности к пониженным температурам и морозостойкости задействовано множество генов, запускающих ответ на стрессовые воздействия [4-7].
Несмотря на большой прогресс в исследовании молекулярных механизмов ответа на холодовое воздействие и выявлении локусов ключевых факторов транскрипции и эффекторных генов на модельном объекте А. ^аНапа, разработано немного молекулярных маркеров, которые выявляют полиморфизм генов и локусов количественных признаков, ассоциированных с холодо- и морозостойкостью, у представителей семейства Вга^шеаееае. Это связано с тем, что не все ге-
ны сложной транскрипционной регуляторной сети могут быть напрямую ассоциированы с фенотипическим признаком.
Например, у вида B. rapa выявлены только несколько генов, участвующих в формировании ответа на пониженные температуры [6, 8, 9] и практически нет сообщений по картированию генов, участвующих в формировании холодостойкости и морозостойкости. Также единичными являются работы по поиску ДНК-маркеров, сцепленных с генами COR (cold-regulated) у вида B. rapa, и их использования для исследования хозяйственно-ценных разновидностей данного вида.
Роль вариации числа копий локусов (CNV, Copy Number Variation), ассоциированных с устойчивостью к пониженным температурам и морозостойкостью, изучалась для множества видов культурных растений [10-14].
Таким образом, цель настоящего исследования — определить для растений семейства Brassicaceae число копий (CNV) на геном по пяти генетическим маркерам BnGMS180, BrGMS102, BrgMS372, BrGMS4511 и SSROllO, ассоциация которых с устойчивостью к пониженным температурам и морозостойкостью была продемонстрирована в ряде научных исследований [15-17].
Материалы и методы
Биологические образцы
Материалом для исследования служили образцы семян 51 сорта культурных растений семейства Brassicaсeae различного ареала (табл. 1).
Семена получены из коллекций: РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (Жодино, Беларусь), ФГБНУ Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова (Санкт-Петербург, Россия).
Оценка качества семян вначале проводилась органолептически: по запаху, цвету и их внешним признакам. Перед началом отсчета семян для анализа были осмотрены все образцы на наличие поврежденных, плесневелых или имеющих внешние изменения семян. Далее было подготовлено требуемое количество чашек Петри, которые тщательно вымыли, высушили и обработали изнутри смоченной в этиловом
спирте марлей. Для проращивания семян (2530 шт. на одну чашку Петри) в качестве подстилки использовали фильтровальную обеззо-ленную бумагу (ООО «Реакон», Россия). Для увлажнения подстилки использовали воду комнатной температуры. Проращивание вели в термостате в темноте при 25,0 ± 1,0 °С, для оценки всхожести на 7-8 день подсчитывали количество проросших семян. Термостат один раз в сутки в течение всего времени проращивания вентилировали путем открывания дверцы на 3-5 мин для удаления конденсата.
Выделение ДНК
Геномную ДНК выделяли из листьев индивидуальных растений (не менее 20 шт.), объединенных в пул, с использованием набора Genomic DNA Purification Kit (K0512, Thermo Fisher Scientific, США). Количественно концентрацию ДНК определяли с использованием флюориметра Quantus Fluorometer (E6150, Promega) и QuantiFluor ONE dsDNA System
Таблица 1
Информация о биологических образцах, включенных в исследование
Вид Сорт Страна
Брюква Brassica napus var. napobrassica (L.) Döll Svalof Victoria Швеция
Местная Россия
Бемуар
Морана Беларусь
Капуста полевая Brassica rapa ssp. oleifera (DC.) Metzg Завея
Латвийская 6 Латвия
Злата Россия
Gruber Финляндия
Rápido
Репа кормовая — турнепс Ova Daehnfeldt Дания
Brassica rapa L. ssp. rapa Metzg. Brunstadnepe Норвегия
Репа листовая форма комацуна Brassica rapa L. ssp. rapa var. komatsuna Makino Goseki Late Япония
Okute Oosaka Shirona
Окончание таблицы 1
Вид Сорт Страна
Зенит
Ветразь
Август
Мартын
Днепр
Гордон Беларусь
Федор
Лидер
Империал
Арсенал
Прогресс
Добродей
Sutton's Favorite
Hungry gar Великобритания
Asparagus
Dunne
Schnitt brauner Германия
Schnitt gruner
Рапс Гедемин х Крис
Brassica napus L. Гранит х Крис Казахстан
М401
Tall Scotch curled Канада
Pabularia Новая Зеландия
Forrajero Перу
Лауреат
Столичный
Горизонт Россия
Норд
Северянин
Вик2
Чорний Велетень Украина
Синтетик
Кодиак Франция
Jet Neuf
Osiq sensaps Швеция
Каванагаре Япония
Васэ Абурана
Зорны Беларусь
(Е4870, Promega). Качественно препараты геномной ДНК анализировали с использованием электрофореза в 2,0% агарозе (ТАЕ-буфер) при 80 V в течение 90 мин. Для всех образцов было показано высокое содержание двухце-почечной (нативной) фракции ДНК, РНК при этом отсутствовала (рис. 1).
СШ
Генетические маркеры для анализа были отобраны на основании ранее проведенных исследований [18, 19]. Для оценки копийности исследуемых локусов нами были смоделированы олигонуклеотиды (табл. 2), фланкирующие небольшой фрагмент в пределах ампли-
м
Рис. 1. Результат электрофоретической оценки нативности препаратов ДНК, лунки 1-6 — образцы №1-6 соответственно, М — маркер молекулярного веса GeneRuler 1 kb (SM0311, ThermoFisher Scientific, Литва)
Таблица 2
Последовательности олигонуклеотидов для определения CNV
Маркер Праймеры Размер ампликона, п. н.
BnGMS180 F 5'-GTCTTGTTTTGGTGTTGGCTT-3' R 5'-GCAGAGGCTTGAGATACACCA-3' 105
BrGMS102 F 5'-GCTCATACATTTGGAAGAGCACA-3' R 5'-ACTCGGGTCTGGTTTATTGGT-3' 84
BrgMS372 F 5'-TTCGGTTTCTACGTCGCTGT-3' R 5'-TGGTGCTATTGTTGGCGAATG-3' 61
BrGMS4511 F 5'-GTTGGTGCTCCTAAATTCCTTAGC-3' R 5'-GGCCGCCATATGTCAGTGAA-3' 84
SSR0110 F 5'-AACGGAAGAATCAACGGACCC-3' R 5'-TGTTGCTGGTCGAACGGTTA-3' 60
кона, синтезирующегося при использовании оригинальных праймеров [6, 21].
ПЦР
Целевые фрагменты ДНК амплифициро-вали с локусспецифическими парами олигонуклеотидов (праймеров), фланкирующими участки последовательностей генов, детерминирующих различия в устойчивости к пониженным температурам и устойчивости к замораживанию у семейства Brassicaceae. ПЦР проводили на амплификаторе QuantStudio 5 (Applied Biosystems, США) со следующими температурно-временными условиями: 5 мин — 95 °С, 40 циклов: 15 сек — 95 °С,
60 сек — 60 °С. Для ПЦР использовали ма-стер-микс qPCRmix-HS LowROX (PK154L, Евроген, Россия), в качестве интеркаллирую-щего красителя — EvaGreen (PCR-379, Jena Bioscience, Германия). Итоговая концентрация праймеров в смеси — 0,2 пмоль/мкл. Количество ДНК в реакции — 10-50 нг. Далее следовал этап плавления ампликонов (Melt Curve Stage), с помощью которого осуществляли первичную оценку специфичности ПЦР.
Для минимизации технической погрешности проведения количественной ПЦР (кПЦР) методика выполнялась в трипликатах для каждого образца с последующим усреднением.
Также для минимизации технической погрешности для каждого образца брали две аликво-ты по концентрации ДНК — 1х и 0,5х, впоследствии для анализа использовали среднее значение Ct и Cp, соответствующее каждому из разведений.
Контроль эффективности ПЦР для каждого анализируемого локуса для каждого вида семейства Brassicaceae проводили с использованием серии разведений ДНК с построением калибровочной прямой. По графикам линейной регрессии, построенным на основании зависимости порогового значения Ct от разведений образов ДНК, определено, что R2 находился в диапазоне 0,991-0,999.
Электрофорез
Для итоговой оценки специфичности ПЦР ампликоны разделяли электрофорезом в 2,0%-ном агарозном геле при напряжении 100 V в течение 60 мин. В качестве интер-калирующего красителя использовали EtBr. Результаты электрофореза документировали с помощью системы E-Box CX5 (Vilber, Германия), программное обеспечение E-Box CX5 TS Edge 18.01. В результате для всех генетических маркеров было показано наличие специфического ампликона, неспецифические продукты амплификации отсутствовали.
Статистический анализ
Для анализа графиков, полученных при проведении кПЦР, нами выбраны два алгоритма: пороговый метод, основанный на определении значения порогового цикла реакции Ct (threshold cycle), который реализован в программе QuantStudio™ Design & Analysis Software для прибора QuantStudio 5 [22]; и метод прямого сравнения графиков Cp (crossing point), который реализован в про-
грамме LinRegPCR v.11.0 [23].
Определение уровня CNV производилось с помощью относительной количественной оценки [24]. Общий вид математической модели детекции CNV имеет вид: R = 2Л(-[Г - С ]).
образец контроль-17
Матрица дистанций на основании расчетов CNV по методу многомерного шкалирования (ALSCAL, Multidimensional scaling) построена в SPSS v.20, использован алгоритм «квадрат расстояния Евклида», проведена Z-стандар-тизация. Графическая визуализация матрицы произведена в программе Past v.4.03 [25].
Результаты и обсуждения
Для успешной амплификации и последующего сопоставления результатов для нескольких биологических видов в рамках семейства Brassicaceae (брюква, капуста полевая, рапс, репа кормовая — турнепс, репа листовая форма комацуна) необходимо было добиться высокой специфичности для отжига смоделированных олигонуклеотидов. Биоинформатический анализ показал, что для смоделированных нами праймеров наличие некомплементарных оснований сведено к минимуму, а небольшой размер синтезируемых в процессе кПЦР ам-ликонов призван нивелировать разницу в эффективности амплификации при последующем объединении результатов для нескольких генетических маркеров, поскольку эффективность ПЦР зависит, в том числе, от размера ампликона. На основании анализа в Primer-BLAST определены потенциальные места отжига смоделированных праймеров для генома Brassica napus, таблица 3.
Для сравнения графиков, полученных при проведении кПЦР, нами применены два основных подхода к анализу результатов: пороговый
Таблица 3
Места отжига смоделированных праймеров для генома Brassica napus
Маркер Хромосомная позиция* RefSeq
(01) Ch.A8:g.1102864-1102968 NC 027764.2
(02) Ch.C3:g.79006606-79006710 NC 027769.2
BnGMS180 (03) Ch.C3:g.78998945-78999049 NC_027769.2
(04) Ch.C3:g.45100479-45100583 NC 027769.2
(05) Ch.A2:g.20447976-20448080 NC 027758.2
(06) Ch.C9:g.19311036-19311140 NC_027775.2
Окончание таблицы 3
Маркер Хромосомная позиция* RefSeq
(01) Ch.C4:g.65356485-65356568 NC_027770.2
(02) Ch.C4:g.65352512-65352595 NC_027770.2
BrGMS102 (03) Ch.A4:g.19864013-19864096 (04) Ch.A3:g.12490171-12490254 NC_027760.2 NC 027759.2
(05) Ch.A3:g.12499096-12499179 NC_027759.2
(06) Ch.A9:g.23176029-23176112 NC_027765.2
BrgMS372 (01) Ch.C3:g.8732776-8732836 (02) Ch.A8:g.7549803-7549863 NC_027774.2 NC_027764.2
BrGMS4511 (01) Ch.A2:g.2700019-2700102 (02) Ch.C2:g.620184-620267 NC_027758.2 NC_027768.2
SSR0110 (01) Ch.A8:g.15859044-15859103 (02) Ch.C3:g.73063827-73063886 NC_027764.2 NC_027769.2
Примечание. * Brassica napus Bra_napus_v2.0, GCA_000686985.2 (PRJNA293435)
метод с определением точки пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии (С), метод прямого сравнения графиков накопления ДНК по форме кривой (Ср).
Суть порогового метода заключается в том, чтобы определить момент О (выраженный в циклах ПЦР), когда количество ДНК в реакционной пробирке и, следовательно, флуоресцентный сигнал достигает одинаковой для всех образцов пороговой величины № (по умолчанию задается программным обеспечением к прибору). Чем меньше О;, тем больше было в образце целевой ДНК в начальный момент времени. Для корректной работы порогового метода необходимым условием является сходство коэффициентов преобразования уровня флуоресценции в количество ДНК.
К методам прямого сравнения результатов по форме графика относятся подходы с использованием первой и второй производных графиков накопления ДНК. В большинстве случаев методы прямого сравнения результатов по форме графика дают более надежные результаты, поскольку позволяют игнорировать (не принимать во внимание) значения коэффициента преобразования уровня флуоресценции в количество ДНК. Максимум второй производной в большинстве случаев находится внутри экспоненциального участка кривой
ПЦР, т. е. зоны графика, где E (эффективность ПЦР) еще постоянна.
Для корректного анализа нами были использованы оба подхода. В результате для всех генетических маркеров коэффициент корреляции Ct и Cp стремился к 1,0. Далее для всех генетических маркеров было рассчитано значение Cmean по формуле (Ct + Cp)/2. Данный подход оказался оправдан, в особенности для тех образцов, для которых разница между Ct и Cp составляла более 20%. Частота встречаемости таких случаев не превышала 5% (рис. 2).
Результаты проведенного молекулярно-ге-нетического анализа подтверждают, что для генетических маркеров BrgMS372 и SSR0110 имеется линейная зависимость значений С
mean
от значения Log[B^ ] (коэффициенты RA2 в диапазоне 0,985-1,0). Данная зависимость характерна для всех исследуемых биологических видов семейства Brassicaceae (рис. 3). Полученные данные согласуются с таблицей 3 и подтверждают, что для генетических маркеров BrgMS372 и SSR0110 имеется равное количество копий на геном.
Далее был проведен расчет параметра АС для генетических маркеров BnGMS180, BrGMS102 и BrGMS4511 относительно генетических маркеров BrgMS372 и SSR0110, и по формуле 2-АС рассчитано значение CNV. Результаты по оцен-
21ЛО 24,00 26,СО УЗ,00 30,00 »,00
СрЯЙКОИО
Рис. 2. Сравнение О: и Ср для исследуемых генетическим маркеров
—I— -1-1-1-1-1—
22.000 24,000 26,000 28,000 30.000 32.000
Стеап ввШПО
Рис. 3. Зависимость между значениями Стеап для генетических маркеров BrgMS372 и SSROl10
ке CNV округлены до двух знаков после запятой и представлены в таблице 4.
Значения в таблице 4 в диапазоне <1,2 указывает на две копии участка ДНК, а более 1,4 рассматривается как увеличение копийности.
Наибольший полиморфизм значений CNV показан для генетического маркера BnGMS180, диапазон значений варьировал от 0,48 (сорт рапса Мартын, Беларусь) до 12,б1 (сорт брюквы Sutton's Favorite, Швеция). Для генетических маркеров BrGMS102 и BrGMS4511 показан незначительный полиморфизм в диапазоне 0,34-1,55 и 0,55-1,05 соответственно.
Значения CNV >1,4 для генетического маркера BnGMS180 были характерны для всех исследуемых видов в семействе Brassicaceae, а именно:
Brassica napus L. — Зенит (Беларусь), Forrajero (Перу), Чорний Велетень (Украина), Schnitt gruner (Германия), Jet Neuf (Франция), Asparagus и Sutton's Favorite (Великобритания), М401 (Казахстан) и Лауреат ^ссия);
- Brassica napus var. napobrassica (L.) Döll — Местная ^осотя);
Brassica rapa ssp. oleifera (DC.) Metzg — Gruber и Rapido (Финляндия), Латвийская б (Латвия);
- Brassica rapa L. ssp. rapa var. komatsuna Makino — Okute Oosaka Shirona (Япония);
Brassica rapa L. ssp. rapa Metzg — Ova Daehnfeldt (Дания) и Brunstadnepe (Норвегия).
Значения CNV >1,4 для генетического маркера BrGMS102 установлены только для сорта Brassica rapa ssp. oleifera (DC.) Metzg — Rapido (Финляндия).
На основании полученных данных по CNV c использованием метода многомерного шкалирования (ALSCAL) в SPSS v.20 построена матрица дистанций, c использованием которой по методу ближайших соседей (Neighbor joining) в PAST v.4.03 построено дерево кластеризации (рис. 4).
В пределах дерева кластеризации представляется возможным выделить три кластера (рис. 4). В целом, подразделенность на кластеры обусловлена вкладом включенных в анализ переменных (в данном случае значения CNV для генетических маркеров), наибольший вклад из которых приходится на BnGMS180. Тот факт, что данный генетический маркер и его эволюционно сформированные изофор-мы, которые распределены по геному растений семейства Brassicaceae, распространен в широком ареале, охватывающем несколько континентов с порой весьма контрастными климатическим условиями, косвенно свидетельствует о его ассоциации с реакцией растения на холодовой стресс. Однако следует учитывать, что анализ CNV не позволяет дать ответ на вопрос, являются ли выявленные аллели функционально значимыми. Выяснить это предстоит в последующих исследованиях, направленных на анализ экспрессии ряда транскипционных факторов.
Ранее было показано, что SSR-маркер BnGMS180, ассоциированный с QTL холодостойкости у рапса, позволяет выявить у B. napus фрагменты размером 383 п. н. (устойчивые формы) и 361 п. н. (чувствительные формы) [16, 17]. Установлено, что япон-
Таблица 4
Значения CNV для генетических маркеров BnGMS180, BrGMS102 и BrGMS4511
Вид Сорт BnGMS180 BrGMS102 BrGMS4511
Брюква Brassica napus var. napobrassica (L.) Döll Svalof Victoria 1,0б 0,б3 0,85
Местная 1,4б 0,93 0,84
Капуста полевая Brassica rapa ssp. oleifera (DC.) Metzg Gruber 1,7б 1,00 0,б9
Rapido 7,53 1,55 0,55
Бемуар 0,58 0,84 0,92
Завея 0,89 0,75 0,85
Злата 0,бб 0,бб 1,05
Латвийская б 1,94 0,93 0,89
Морана 0,70 0,б3 0,79
Окончание таблицы 4
Вид Сорт BnGMS180 BrGMS102 BrGMS4511
Asparagus 6,10 1,31 0,91
Dunne 1,26 0,49 0,86
Forrajero 1,84 0,59 0,67
Hungry gar 0,94 0,59 0,89
Jet Neuf 3,25 0,63 0,84
Osiq sensaps 0,60 0,54 0,67
Pabularia 1,01 0,86 0,94
Schnitt brauner 0,88 0,95 0,88
Schnitt gruner 2,09 0,79 0,93
Sutton's Favorite 12,61 0,67 0,90
Tall Scotch curled 1,18 0,90 1,04
Август 1,05 0,70 0,82
Арсенал 0,67 0,63 0,88
Васэ Абурана 1,03 0,82 0,87
Ветразь 0,94 0,70 0,87
Вик2 1,16 0,98 0,92
Гедемин х Крис 1,02 0,62 0,90
Гордон 1,32 1,22 0,88
Рапс Горизонт 1,15 0,80 0,84
Brassica napus L. Гранит х Крис 1,03 0,76 0,84
Днепр 0,56 0,48 0,81
Добродей 1,21 0,71 0,89
Зенит 1,57 0,58 0,85
Зорны 0,67 0,67 0,82
Империал 1,16 0,89 0,88
Каванагаре 1,17 0,99 0,91
Кодиак 0,74 0,42 0,86
Лауреат 6,82 0,66 0,83
Лидер 0,67 0,66 0,90
М401 6,11 0,57 0,85
Мартын 0,48 0,46 0,67
Норд 1,06 0,65 0,85
Прогресс 0,63 0,54 0,92
Северянин 1,25 0,68 0,84
Синтетик 0,89 0,76 0,84
Столичный 1,15 0,73 0,81
Федор 0,58 0,85 0,93
Чорний Велетень 2,08 0,72 0,86
Репа кормовая — турнепс Brunstadnepe 9,64 0,72 0,90
Brassica rapa L. ssp. rapa Metzg. Ova Daehnfeldt 2,16 0,51 0,88
Репа листовая форма комацуна Okute Oosaka Shirona 4,17 0,59 0,87
Brassica rapa L. ssp. rapa var. komatsuna Makino Goseki Late 1,00 0,34 0,90
Рис. 4. Дерево кластеризации для исследуемых образцов на основании значений CNV для генетических маркеров
BnGMS180, BrGMS102 и BrGMS4511
ский сорт рапса Васэ Абурана содержал уникальный фрагмент размером 400 п. н. наряду с фрагментом 361 п. н. [19]. В то же время увеличений копийности по данному локусу для сорта рапса Васэ Абурана не выявлено.
Среди сортов рапса, для которых по BnGMS180 установлено увеличение параметра CNV, а именно: Schnitt gruner (Германия), Sutton's Favourite (Великобритания), Лауреат (Россия) и Чорний велетень (Украина) показано наличие чувствительных форм, ассоциированных со слабым эффектом на холодовой стресс (361 п. н.), в то время как для осталь-
ных образцов из этой группы выявлено наличие устойчивых форм, ассоциированных с выраженным эффектом на холодовой стресс (383 п. н.) [19].
В целом, результаты научных исследований, направленных на оценку вклада генетического локуса ВпОМБ180 в ответную реакцию растений на холодовой стресс, свидетельствуют о том, что с этим локусом ассоциированы множественные эффекты, вызывающие заметные изменения в метаболоме и транскрипто-ме рапса в ответ на колебания температуры окружающей среды [26].
Заключение
На основании результатов проведенных исследований по определению числа копий на геном (CNV) по пяти генетическим маркерам для 51 сорта растений семейства Brassicaceae различного ареала сделаны следующие выводы:
наибольшая вариация относительных значений CNV показана для генетического маркера BnGMS180, диапазон значений варьировал от 0,48 (сорт рапса Мартын, Беларусь) до 12,61 (сорт брюквы Sutton's Favorite, Швеция). Значения CNV >1,4 были характерны для всех исследуемых видов (рапс, полевая капуста, репа, брюква) в рамках семейства Brassicaceae, культивируемых по всему миру (Беларусь, Перу, Украина, Германия, Франция, Казахстан, Россия, Финляндия, Япония, Норвегия и др.);
значения CNV >1,4 для генетического маркера BrGMS 102 были показаны только для сорта Brassica rapa ssp. oleifera (DC.) Metzg — Rapido (Финляндия);
увеличение CNV больше двух на геном для генетических маркеров BrgMS372, BrGMS4511 и SSR0110 не выявлено.
Исследование выполнено в рамках ГПНИ «Биотехнологии-2», подпрограмма «Геноми-ка, эпигеномика, биоинформатика» 2021-2023 годы, тема НИР «Изучение экспрессии генов А- и С- геномов семейства Brassicaceae, ассоциированных с морозостойкостью».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список использованных источников
1. Orvar, B. L. Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity / B. L. Orvar [et al.] // The Plant Journal. - 2000. - Vol. 23(6). - P. 785-794. DOI: 10.1046/j.1365-313x.2000.00845.x.
2. Chinnusamy, V. Cold stress regulation of gene expression in plants / V. Chinnusamy [et al.] / Trends in Plant Sci. - 2007. - Vol. 12(10). -P. 444-451. DOI: 10.1016/j.tplants.2007.07.002
3. Prospects for transgenic and molecular breeding for cold tolerance in canola (Brassica napus L.). / Oilseeds, ed.: Uduak G. Akpan. -Croatia: InTech. - 2012. - 184 p.
4. Bais, H. P. Allelopathy and exotic plant invasion: from molecules and genes to species
interactions / H.P. Bais [et al.] // Science. - 2003.
- Vol. 301. - P. 1 377-1 380. DOI: 10.1126/ science.1083245.
5. Monroy, A. F. Regulatory gene candidates and gene expression analysis of cold acclimation in winter and spring wheat / A. F. Monroy [et al.] // Plant Mol Biol. - 2007. - Vol. 64, № 4. -P. 409-423. DOI: 10.1007/s11103-007-9161-z
6. Huang, Z. Analysis of cold resistance and identification of SSR markers linked to cold resistance genes in Brassica rapa L. / Z. Huang [et al.] // Breed Sci. - 2017. - Vol. 67(3). - P. 213-220. DOI: 10.1270/jsbbs.16161.
7. Song, H. Allelic variation in Brassica oleracea ORCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (BoCCA1) is associated with freezing tolerance / H. Song [et al.] // Hortic. Environ. Biotechnol. -2018. - Vol. 59, № 3 - P. 423-434. DOI: 10.1007/ s13580-018-0045-8.
8. Maibam, P. The Influence of Light Quality, Circadian Rhythm, and Photoperiod on the CBF-Mediated Freezing Tolerance / P. Maibam [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14. - P. 11 52711 543. DOI: 10.3390/ijms140611527.
9. Ahmed, N. U. Anthocyanin biosynthesis for cold and freezing stress tolerance and desirable color in Brassica rapa / N. U. Ahmed [et al.] // Functional & Integrative Genomics. - 2014.
- Vol. 15, № 4. - P. 383-394. DOI: 10.1007/ s10142-014-0427-7.
10. Mareri, L. Influence of CNV on transcript levels of HvCBF genes at Fr-H2 locus revealed by resequencing in resistant barley cv. 'Nure' and expression analysis / L. Mareri [et al.] // Plant Sci. - 2020. - e.290:110305. DOI: 10.1016/j. plantsci.2019.110305.
11. Francia, E. Copy number variation at the HvCBF4-HvCBF2 genomic segment is a major component of frost resistance in barley / E. Francia [et al.] // Plant Mol. Biol. - 2016. -Vol. 92(1-2). - P. 161-175. DOI: 10.1007/s11103-016-0505-4.
12. Knox, A. K. CBF gene copy number variation at Frost Resistance-2 is associated with levels of freezing tolerance in temperate-climate cereals / A. K. Knox [et al.] // Theor. Appl. Genet.
- 2010. - Vol. 121(1). - P. 21-35. DOI: 10.1007/ s00122-010-1288-7.
13. Sandve, S. R. Molecular mechanisms underlying frost tolerance in perennial grasses adapted to cold climates / S. R. Sandve [et al.] //
Plant Sci. - 2011. - Vol. 180(1). - P. 69-77. DOI: 10.1016/j.plantsci.2010.07.011.
14. Tondelli, A. Inside the CBF locus in Poaceae / A. Tondelli [et al.] // Plant Sci. -2011. - Vol. 180(1). - P. 39-45. DOI: 10.1016/j. plantsci.2010.08.012.
15. Mapping of quantitative trait loci related to cold resistance in Brassica napus L. / Z. Huang [et al.] // J. Plant Physiol. - 2018. - Vol. 231. -P. 147-154. DOI: 10.1016/j.jplph.2018.09.012.
16. Analysis of cold resistance and identifcation of SSR markers linked to cold resistance genes in Brassica rapa L. / Z. Huang [et al.] // Breeding Science. - 2017. - Vol. 67. - P. 213-220. D0I:10.1270/jsbbs.16161.
17. Genetic variability between several Brasicaceae populations of different winter survival ability / B. Rakic [et al.] // In. 12th IRC: Sustainable Development in Cruciferous Oilseed Crops Production. Vol. 2. - Wuhan, China. -2007. - P. 78-80.
18. Амосова, А. В. Геномные маркеры, ассоциированные с устойчивостью к низким температурам у Brassica rapa L. / А. В. Амосова [и др.] // Молекулярная биология. -2020. - Т. 54(4). - С. 603-615. DOI:10.31857/ S0026898420040035.
19. Лемеш, В. А. Полиморфизм аллелей, ассоциированных с устойчивостью к низким температурам, у представителей семейства Brassicaceae с широким ареалом распространения / В. А. Лемеш, Г. В. Мозгова, В. Н. Кипень, Л. В. Хотылёва // Молекулярная и прикладная генетика. - 2022. - Т. 32. - С. 18-27. DOI: 10.47612/1999-9127-2022-32-18-27.
20. Cai, G.A complex recombination pattern in the genome of allotetraploid Brassica napus
as revealed by a high-density genetic map /
G. Cai [et al.] // PLoS One. - 2014 - Vol. 9(10).
- e109910. DOI: 10.1371/journal.pone.0109910.
21. Kole, C. Linkage mapping of genes controlling resistance to white rust (Albugo candida) in Brassica rapa (syn. campestris) and comparative mapping to Brassica napus and Arabidopsis thaliana / C. Kole, P. H. Williams, S. R. Rimmer, T. C. Osborn // Genome. - 2002.
- Vol. 45(1). - P. 22-27. DOI: 10.1139/g01-123.
22. QuantStudio™ Design and Analysis Software USER GUIDE [Электронный ресурс].
- Режим доступа: https://tools.thermofisher. com/content/sfs/manuals/MAN0010408_ QuantStudioDesign_Analysis_Desktop_ Software_UG.pdf - Дата доступа: 25.08.2022.
23. LinRegPCR (11.0) Analysis of quantitative RT-PCR data [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.gene-quantification.de/ LinRegPCR_help_manual_v11.0.pdf - Дата доступа: 25.08.2022.
24. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time PCR / M. W. Pfaffl // Nucleic Acids Res. -2001. - Vol. 29(9). - P. 16-21. DOI: 10.1093/ nar/29.9.e45.
25. Hammer, Q. Past: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis / Q. Hammer, A. T. Harper, P. D. Ryan // Palaeontologia Electronica. - 2001.
- Vol. 4(1). - P. 1-9.
26. Jian, H. Characterization of cold stress responses in different rapeseed ecotypes based on metabolomics and transcriptomics analyses /
H. Jian [et al.] // PeerJ. - 2020. - Vol. 8. - e8704. DOI: 10.7717/peerj.8704.
V. A. Lemesh, V. N. Kipen, G. V. Mozgova, L. V. Khotyleva
VARIATION IN THE COPY NUMBER OF DNA REGIONS FOR THE BRASSICACEAE FAMILY ASSOCIATED WITH COLD RESISTANCE
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: V.Lemesh@igc.by
We determined copy number variation (CNV) per genome by five genetic markers BnGMS180, BrGMS102, BrgMS372, BrGMS4511 and SSR0110 associated with low temperatures and frost resistance for 51 cultivated plants of the Brassicaceae family with a wide cultivation range. It was shown that the genetic marker BnGMS180 has the greatest range of variations in the CNV value. The range of values varied from 0.48 (rapeseed variety Martyn, Belarus) to 12.61 (rutabaga variety Sutton's Favorite, Sweden). For other genetic markers, variation in CNV values is insignificant.
Keywords: CNV, Copy Number Variation, Brassicaceae, genetic markers, cold resistance.
Дата поступления в редакцию: 30 августа 2022 г.
