CC BY
15DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-32-18-27 УДК 504.06: 575.856(476)(047.31)
В. А. Лемеш, Г. В. Мозгова, В. Н. Кипень, Л. В. Хотылёва
ПОЛИМОРФИЗМ АЛЛЕЛЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ, У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА BRASSICACEAE С ШИРОКИМ АРЕАЛОМ РАСПРОСТРАНЕНИЯ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: [email protected]
Исследован полиморфизм локусов, ассоциированных с холодостойкостью у представителей семейства Brassicaceae. Использованы 11 SSR-маркеров, достоверно коррелирующих с относительной электропроводностью тканей и содержанием MDA, 4 SCAR-маркера, сцепленных с аллелями гена CCA1, а также SSR 0110 и SSR BnOllO, тесно сцепленные с QTL, ассоциированными с временем начала цветения растений, морозостойкостью и зимней выживаемостью. Верификация образцов при помощи SCAR-маркера BoCCA1-1R1 показала, что аллель BoCCA1-1, характерный для устойчивых к холоду сортов, содержится в геномах 26 из 88 проанализированных форм, включая белорусские сорта рапса Зенит, Добродей, Мартын.
Начаты работы по определению CNV для SSR-маркеров, ассоциированных с содержанием MDA и относительной электропроводностью тканей, у представителей семейства Brassicaceae. Установлено, что для ДНК-маркеров BrGMS102 и BrGMS4511, которые оказались не эффективны для выявления полиморфизма по генетическим локусам, ассоциированными с морозостойкостью у представителей семейства Brassicaceae, также отсутствует выраженный полиморфизм по числу копий в геноме. Эффективный маркер BnGMs180-1 проявил вариабельность: от двух до двенадцати копий на геном. Показано, что копийность генов оказывает влияние на повышение устойчивости к низким температурам представителей семейства Brassicaceae.
Ключевые слова: семейство Brassicaceae, холодостойкость, SSR-маркеры, SCAR-маркеры, CNV.
Введение
Существующие трудности проведения полевых испытаний сельскохозяйственных культур общепринятыми методами традиционного отбора и гибридизации стимулировали интерес к исследованию генов-регуляторов холодового стресса и механизмов, лежащих в его основе, а также выявления молекулярных маркеров, проявляющих положительную корреляцию с признаками, определяющими холодостойкость и морозостойкость растений [1, 2]. Учитывая тот факт, что устойчивость к пониженным температурам является количественным признаком [3], научно обоснованный подход для создания новых устойчивых сортов растений семейства Brassicaceae состоит в том, чтобы идентифицировать полиморфные аллели генов, ассоциированные с устойчивостью к пониженным температурам, разработать эффективные молекулярные маркеры к выявлен-
ным аллелям и использовать их для отбора устойчивых форм.
Факторы транскрипции и эффекторные гены, участвующие в реакции растений на хо-лодовой стресс, в совокупности называются генами, регулируемыми холодом (COR, cold-regulated) [4]. Были выявлены основные гены-регуляторы холодового ответа: COR (холодорегулируемые, cold-regulated), KIN (индуцируемые холодом, cold-induced), LTI (индуцируемые низкой температурой, low temperature induced) и RD (реагирующие на обезвоживание, responsive to dehydration) [5]. Продукты этих генов можно классифицировать на две группы: 1) транскрипционные факторы, регулирующие передачу сигналов и экспрессию генов ответа на холод; 2) белки позднего эмбриогенеза LEA (late embryogenesis abundant proteins), белки теплового шока HSP (heat shock proteins), анти-
фриз-белки, белки транспорта липидов, деги-дрины [5].
Установлено, что одними из первых в каскадный механизм формирования морозоустойчивости вовлекаются гены семейства CBF (C-repeated Binding Factor), которые играют ведущую роль в регуляции ответа на холодовой стресс у растений [6]. С использованием модельного объекта семейства Brassicaceae — A. thaliana были открыты ключевые гены сигнального пути CBF: индукторы экспрессии генов CBF-ICE (inducer of CBF expression), гены CBF (C-repeat-binding factor), гены COR (cold-regulated genes) и их сигнальные пути [7, 8]. В последующем было выявлено наличие CBF-генов у многих видов растений, включая полевые и овощные культуры, древесные растения [9, 10], указывая на то, что сигнальный путь CBF-ответа на холодо-вой стресс является высоко консервативным для царства растений.
Установлено, что критическую роль в регуляции многих физиологических и метаболических процессов у растений, а также в формировании адаптивных реакций на абиотические стрессы, в т. ч. адаптации к пониженным температурам, играют циркадные ритмы [1]. Ассоциированный с циркадными ритмами транскрипционный фактор семейства MYB CCA1 (белок 1, Circadian Clock Associated 1), а также LHY (Late Elongated Hypocotyl) играют важную роль в фитохром-зависимой индукции фотосинтетических генов и регуляции циркад-ных ритмов. У капусты огородной B. oleracea в последовательности гена BoCCAl выявлены делеции и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и разработаны молекулярные SCAR-маркеры, позволяющие выявлять их наличие в двух аллелях гена (BoCCA1-1 и BoCCA1-2), ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью растений к низким температурам [3].
Несмотря на большой прогресс в исследовании молекулярных механизмов ответа на холодовое воздействие и выявлении локу-сов ключевых генов-факторов транскрипции и эффекторных генов на модельном объекте A. thaliana, разработано немного молекулярных маркеров, которые выявляют полиморфизм генов и локусов количественных признаков, ассоциированных с холодо- и морозостойкостью, у представителей семейства
Brassicaceae. Это связано с тем, что не все гены сложной транскрипционной регуляторной сети могут быть напрямую ассоциированы с фенотипическим признаком. Эффективными молекулярными маркерами являются те, с помощью которых можно четко дифференцировать аллели холодостойкости. Предпочтительнее использовать молекулярные маркеры, которые позволяют выявлять мутации на уровне последовательности ДНК, включая SNP либо вставки или делеции. Так, Song et al. (2018) разработали молекулярные маркеры BoCCA1-1R1, BoCCA1-2R1, BoCCA1-1R2, BoCCA1-2R2, BoCCA1-1 и BoCCA1-2, позволяющие детектировать делеции и инсерции, а также SNP (замена С на G и С на А) в двух аллелях гена CCA1B. oleracea: BoCCAl-1 и BoCCA1-2 [3]. Показана эффективность ДНК-маркеров для дифференциации устойчивых и чувствительных к низким отрицательным температурам генотипов B. oleracea [3]. Нами было выявлено, что данные ДНК-маркеры позволяют эффективно дифференцировать между собой отдельные сорта B. napus и B. rapa [7, 8].
Было установлено, что при высоком содержании малонового диальдегида (MDA, malondialdehyde) в мембранах растений происходит ускорение перекисного окисления липидов, что приводит к снижению устойчивости к холоду [9]. У рапса B. napus выявлена отрицательная корреляция относительной проводимости мембран с устойчивостью к холоду [14]. У репы B. rapa степень повреждения растений отрицательными температурами также коррелирует с содержанием MDA и относительной проводимостью мембран, были выявлены SSR-маркеры, достоверно коррелирующие с данными признаками [2].
Известно, что SNP, делеции и инсерции могут быть использованы как маркеры для дифференциации аллелей [3, 7, 8]. Кроме того, недавние исследования по полногеномному секвенированию растений и животных выявили вариации копий генов (copy number variation, CNV) и то, что в геномах имеются протяженные инсерции или делеции от сотен до миллионов пар оснований [10], что подтверждает важность CNV как компонентов геномной изменчивости у эукариот. Результатом вариации может являться снижение или повышение числа копий определенного гена и, сле-
довательно, повышение или снижение экспрессии продукта гена [11]. Было установлено, что многие CNV напрямую или опосредованно вовлечены в стрессовый ответ [12]. Установлено, что CNV влияют на фенотип, включая адаптивные реакции, в т. ч. устойчивость к заморозкам [13, 14], и их можно ассоциировать с признаком и использовать как маркер. Например, CNV успешно использованы для реконструкции генетической структуры популяции A. thaliana. Кроме того, показано, что существенные изменения дозы гена могут приводить к изменению количества транскриптов (РНК и белков) у растений данного вида [10].
Таким образом, к настоящему времени установлены ряд маркеров генетических локусов, генов и вариации копий генов CNV, ассоциированных с морозостойкостью у представителей семейства Brassicacea.
Цель работы — выявление полиморфных аллелей генов, ассоциированных с морозостойкостью, у представителей семейства Brassicacea с широким ареалом распространения, а также определение вариации числа копий для некоторых из этих генов.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы 88 сортов семейства Brassicaceae различного происхождения: 78 образцов рапса B. napus L. (Беларусь, Россия, Украина, Германия, Франция, Швейцария, Швеция, Великобритания, США, Канада, Перу, Япония, Новая Зеландия), 4 образца капусты полевой B. rapa ssp. oliefera (DC) Metzg (Россия, Латвия, Финляндия), 2 образца турнепса Brassica rapa L. ssp. rapa Metzg (Дания, Норвегия), 2 образца репы листовой Brassica rapa L. ssp. rapa f. Shirona Kitam и Brassica rapa L. ssp. rapa var. komatsuna Makino (Япония), 2 образца брюквы Brassica napus var. napobrassica (L.) Döll (Швеция, Россия).
Детекция ДНК-маркеров
Геномную ДНК выделяли из листьев индивидуальных растений (не менее 15 шт.), объединенных в пулл, с помощью набора Genomic DNA Purification Kit согласно инструкции (Thermo Fisher Scientific, Литва). Концентрацию ДНК определяли с использованием спектрофотометра Implen Nano Photometer N50 (Implen, Германия). Целевые фрагмен-
ты ДНК амплифицировали с локус-специфи-ческими парами праймеров. ПЦР проводили на амплификаторе SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 2,0% агарозном геле. Результаты электрофореза документировали с использованием системы E-Box CX5 (Vilber, Германия), ПО E-Box CX5 TS Edge 18.01. Последовательности олигонуклеоти-дов для амплификации генетических маркеров Na10-C03, BrgMS4511, BRAS011, O113-G05 даны в работе [2], BoCCA1-1R1, BoCCA1-2R1, BoCCA1-1R2, BoCCA1-2R2 в работе [3], CB10578-1, BrgMS653-2, BrgMS609-1, BrgMS5339-1, BrgMS372-2, BnGMS180-1, BnGMS10578-1 в работе [15], SSR OllO, SSR BnOllO в работе [16].
Определение CNV
ДНК была выделена единовременно в течение одного рабочего дня и проанализирована в течение 2-х дней. Праймеры смоделированы в программе Primer-BLAST таким образом, чтобы последовательности нуклеотидов располагались внутри ампликонов, которые синтезируются в ПЦР с использованием оригинальных праймеров из работ [22, 23, 24] (табл. 1). Соответственно, были подобраны праймеры в ре-гонах, максимально консервативных для всех анализируемых видов. Амплификацию проводили на термоциклере QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo FS, США).
Результаты и обсуждение
Нами исследован полиморфизм микросател-литных локусов, сцепленных с QTL, ассоциированных с холодостойкостью у представителей семейства Brassicaceae. Использованы 11 SSR-маркеров, достоверно коррелирующих с относительной электропроводностью тканей и содержанием MDA у B. napus и B. rapa [2, 15]. Данные маркеры расположены у B. rapa в интервале BrgMs609-1-BrgMs5339-1 и сцеплены с QTL qSPADYL-6, qSPADYS-6 и qMADYS-6 B. napus [2, 15], а также SSR 0l10 и SSR Bn0l10, тесно сцепленные с QTL, ассоциированными с временем начала цветения растений, морозостойкостью и зимней выживаемостью [16]. ДНК-маркеры BrgMS4511, BRAS011, BrgMS653-2, BrgMS609-1, BrgMS372-2 и SSR 0l10 не выявили полиморфизм коллекции. С помощью остальных ДНК-
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидов для амплификации генетических маркеров для
определения С^У
№ Маркер Праймеры Размер ампликона, п. н.
1 BnGMS180-1 F 5'-GTCTTGTTTTGGTGTTGGCTT-3' R 5'-GCAGAGGCTTGAGATACACCA-3' 105
2 BrGMS102 F 5'-GCTCATACATTTGGAAGAGCACA-3' R 5'-ACTCGGGTCTGGTTTATTGGT-3' 84
3 BrgMS372 F 5'-TTCGGTTTCTACGTCGCTGT-3' R 5'-TGGTGCTATTGTTGGCGAATG-3' 61
4 BrGMS4511 F 5'-GTTGGTGCTCCTAAATTCCTTAGC-3' R 5'-GGCCGCCATATGTCAGTGAA-3' 84
5 SSR 0110 F 5'-AACGGAAGAATCAACGGACCC-3' R 5'-TGTTGCTGGTCGAACGGTTA-3' 60
маркеров установлен полиморфизм изученной коллекции образцов с широким ареалом распространения. Были выявлены некоторые закономерности для отдельных SSR-маркеров. Так, для SSR-маркера Bn 0110 B. napus, который, как было показано в работе [15], ассоциирован с QTL холодостойкости, у всех исследованных нами сортов рапса выявлялся идентичный фрагмент размером 180 п. н. Вместе с тем у сортов Васэ Абурана и Каванага-рэ (Япония), а также у сорта Sutton's Favorite (Великобритания) выявлялся дополнительный фрагмент размером 274 п. н., а у сорта Asparagus (Великобритания) выявлялся дополнительный фрагмент размером 308 п. н. Фрагмент в 274 п. н. выявлялся также у капусты полевой Злата (Россия) и репы листовой Okute Oosaka Shirona (Япония).
Ранее показано, что SSR-маркер BnGMS180-1, ассоциированный с QTL холодостойкости у рапса, позволяет выявить у B. napus фрагменты размером 383 п. н.
(устойчивые формы) и 361 п. н. (чувствительные формы) [20]. В данном исследовании в генотипах образцов из различных стран выявлено наличие фрагмента размером 383 п. н. либо обоих фрагментов 383 п. н. и 361 п. н. При этом установлено, что японский сорт рапса Васэ Абурана содержит уникальный фрагмент размером 400 п. н. вместо фрагмента 383 п. н. наряду с фрагментом 361 п. н. (рис. 1).
SSR-маркер BnGMS10578-1, ассоциированный с QTL холодостойкости у рапса, выявлял у сортов B. napus, в основном, оба фрагмента размером 232 и 202 п. н, за редким исключением — 202 п. н. (сорта Арсенал, Sutton's Favorite, Schnitt brauner, Pabularia, Forragero). Фрагмент 202 п. н. выявлялся также у брюквы B. napobrassica Местная. При этом у сортов рапса из Японии Васэ Абурана и Каванагаре выявлялся только фрагмент размером 232 п. н. Данный единичный фрагмент выявлялся также у всех сортов капусты полевой, репы листовой и кормовой.
I
^ Ж ф ,
а? ■<?
О 400 КЗВЗ 1333/361 В361
Рис. 1. Процентное соотношение нуклеотидных последовательностей, выявляемых с помощью ДНК-маркера
BnGMS180-1 по странам
SSR-маркер CB10578-1 позволил детектировать у сортов B. napus фрагменты размером 200 п. н., 232 п. н. или оба фрагмента. SSR маркер BrgMS 372-2 выявлял фрагменты размером 386 п. н., 401 п. н. или оба фрагмента, при этом у большинства сортов B. napus выявлялся единичный фрагмент размером 401 п. н.
С помощью SSR-маркера BrgMS5339-1, фланкирующего области qSPADYS-6 и qMDAYS-6, также были определены полиморфные фрагменты. У большинства сортов рапса детектировалось 2 фрагмента размером 299 и 363 п. н. Фрагмент размером 363 п. н. также детектировался у сортов брюквы B. napus var. napobrassica. У сорта рапса Schnitt brauner (Германия) детектировались фрагменты размером 313 п. н. и 363 п. н. Интересно то, что и у исследованных сортов капусты полевой детектировалась последовательность размером 313 п. н. У B. rapa (репа кормовая и листовая) идентифицировался либо единичный фрагмент размером 298 п. н., либо два фрагмента размером 313 п. н.
С помощью SSR-маркера Na10-C03 выявлен фрагмент размером 222 п. н. у 50 сортов B. napus L. Для SSR Bn0l10 были определены полиморфные фрагменты размером 180 п. н., 274 п. н. и 308 п. н. для различных генотипов.
ДНК-маркер 0113-G05 [2] позволял детектировать фрагмент размером 127 п. н. практически у всех сортов рапса, вне зависимости от региона происхождения, но отсутствовал у японского сорта рапса Васэ Абурана. У со-
ртов других видов и разновидностей семейства данный фрагмент не выявлен.
Потеря функциональных аллелей генов CCA1, LHY, а также PRRs, ZTL, TOC1 влечет за собой появление циркадных эффектов, подобных световым эффектам, что указывает на критическую роль этих компонентов циркад-ной системы [21]. Ген CCA1 участвует в позитивной регуляции холодового ответа у растений путем индукции экспрессии CBF-генов (факторов транскрипции генов COR) при низких температурах и определяет различия по степени устойчивости растений [8, 22]. Нами проведен анализ коллекции с помощью молекулярных маркеров к гену CCA1. Использованы молекулярные маркеры BoCCA1-1R1, BoCCA1-2R1, BoCCA1-1R2, BoCCA1-2R2 [10, 11].
Верификация коллекции образцов рапса при помощи SCAR-маркера BoCCA1-1R1 показала, что аллель BoCCA1-1, характерный для устойчивых к холоду сортов, содержится в геномах 26 из 88 проанализированных форм, включая белорусские сорта рапса Зенит, До-бродей, Мартын (рис. 2).
SCAR-маркер BoCCA1-2R1 сцеплен с ал-лелем BoCCA1-2 гена CCA1, который вносит вклад в устойчивость рапса к низким температурам. Праймеры, фланкирующие последовательность маркера, позволяют ампли-фицировать фрагмент размером 792 п. о. для восприимчивых образцов. Использование ДНК-маркера BoCCA1-2R1 позволило де-
Рис. 2. Электрофореграммы продуктов амплификации аллелей гена CCA1 c помощью SCAR-маркера BoCCA1-1R1 М — маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (100-3 000 п. о., Thermo Fisher Scientifiс), 1 — Зенит; 2 — Зорный; 3 — Добродей; 4 — Инспирацион; 5 — Кодиак; 6 — Мартын; 7 — Jet Neuf; 8 — ВИК 2; 9 — Васэ Абурана; 10 — НОРД; 11 — Август; 12 — Tall Scotch Curled; 13 — Мерседес
тектировать последовательность, определяющую восприимчивость к пониженным отрицательным температурам, у подавляющего числа сортов рапса. SCAR-маркер ВоССА1-2Я2 выявлял практически у всех сортов рапса два аллеля 531 и 504 п. о. Вместе с тем выявлено, что у сортов рапса из регионов Канады и Японии, где резкие различия между летом и зимой, с помощью SCAR-маркера ВоССА1-1Ю была установлена гомозиготность по ал-лелю ВоССА1-1, наличие которой определяет устойчивость к отрицательным температурам, с помощью SCAR-маркера ВоССА1-2Я2 детектировался только фрагмент размером 504 п. о. (рис. 3).
Установлено также, что отдельные SCAR-маркеры, фланкирующие аллель ВоССА1-1, позволяют амплифицировать нуклеотидные последовательности различных размеров
и выявлять делеции либо инсерции в данных последовательностях. Тот факт, что у рапса из регионов с неблагоприятными погодными условиями — Каванагаре (Япония) и Tall Scotch Curled (Канада), у которых с помощью BoCCA1-1R1 была установлена гомозиготность по аллелю BoCCA1-1, наличие которой определяет устойчивость к отрицательным температурам, а с помощью маркера BoCCA1-2R2 не детектировалась последовательность 531 п. н., а выявлялся фрагмент размером 504 п. н., указывает на наличие делеции в гене CCA1. Эта делеция, возможно, определяет наибольшую морозостойкость данных сортов. Следует отметить, что у сортов Васэ Абурана (Япония), Satton's Favorite (Великобритания), Добродей, Днепр (Беларусь), Синтетик (Украина), Мемфис (Германия), ЕС Нептун (Франция), а также у исследованных сортов капусты
Рис. 3. Электрофореграммы продуктов амплификации аллелей гена CCA1 c помощью SCAR-маркера BoCCA1-2R2 М — маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (100-3 000 п. о., Thermo Scientific), 1 — Зе-нит;2 — Мартын; 3 — Август; 4 — ВИК 2; 5 — НОРД; 6 — Добродей; 7 — Мерседес; 8 — Кодиак; 9 — Jet Neuf;
10 — Васэ Абурана; 11 — Синтетик; 12 — Каванагаре
полевой, репы листовой и кормовой выявлялся единичный фрагмент размером 531 п. о., что, по-видимому, указывает на наличие инсерции в исследуемом гене. По нашему мнению, отклонения по амплифицируемым фрагментам от ожидаемых, выявленные с помощью отдельных SSR-маркеров для некоторых сортов, указывают на наличие делеций либо инсерций, которые также могут определять отклонения по степени холодостойкости у данных сортов.
Нами было также отмечено, что маркеры Na10CO3, Ol13-G05 выявляли локусы, ассоциированные с холодостойкостью, вне зависимости от страны происхождения. Вместе с тем, по данным литературы, ряд семейств генов ответа на температурный стресс, или даже индивидуальные члены этих семейств, могут быть вовлечены как в высоко-, так и в низкотемпературный стресс [23, 24]. Поэтому в нашем исследовании подтверждена гипотеза о предпочтительном сохранение генов, ассоциированных с холодом, в процессе эволюции как результат полиплоидизации растений семейства Brassicaceae, происходящих как из холодных, так и теплых областей.
Вариация числа генов (copy number variation, CNV)
Предполагается, что полиплоидизация геномов может быть основным двигателем эволюции растений и коррелирует с возникновением и быстрой диверсификацией основных таксонов [11]. Секвенирование геномов Arabidopsis thaliana и Oryza sativa выявило рекурсивную полиплоидизацию, несмотря на их небольшие размеры [20]. Геномный анализ A. thaliana, трех видов рода Brassica и представителей 17 других видов растений, позволил установить, что гены холодового ответа CRGs (cold-related genes) и их коллинеарность предпочтительно сохраняются после полиплоидизации, в то время как для других геномных сетей характерно разнообразие механизмов развития. Показано, что холодовой стресс может способствовать возникновению полиплоидных растений путем как увеличения полиплоидии, так и селективного отбора CRGs в ходе эволюции [21].
Нами начаты работы по определению CNV для SSR-маркеров, ассоциированных с содержанием MDA и относительной электропроводностью тканей, у представителей семейства Brassicaceae. Показано [2, 15], что у B. rapa
и B. napus степень повреждения растений при отрицательных температурах также коррелирует с содержанием MDA и относительной проводимостью мембран. Были выявлены SSR-маркеры, в том числе BnGMs180-1, BrGMS102 и BrGMS4511 [2, 15], пригодные для диагностики устойчивых и восприимчивых к холоду генотипов. Ранее нами были протестированы вышеперечисленные ДНК-маркеры на отдельных сортах B. napus и B. rapa. Однако на рабочей коллекции изученных генотипов образцов показано, что полиморфизм выявлял только один из трех отобранных для изучения ДНК-маркеров — BnGMs180-1 [7, 8]. Вместе с тем в работе [2] выявлена достоверная корреляция этих ДНК-маркеров (BnGMs180-1, BrGMS102 и BrGMS4511) с содержанием MDA и относительной электропроводностью тканей. В связи с этим мы предположили, что изменения в характере ДНК-маркирования могут происходить на уровне вариации числа генов.
В проведенном нами исследовании установлено, что ДНК-маркеры BrGMS102 и BrGMS4511, которые были не эффективны для выявления полиморфизма по генетическим локусам, ассоциированными с морозостойкостью у представителей семейства Brassicaceae, также не имеют выраженного полиморфизма по CNV и показывают в среднем две копии на геном. Эффективный для оценки полиморфизма генотипов нашей коллекции маркер BnGMs180-1 проявил вариабельность. Показано присутствие в генотипах коллекции образцов, содержащих от двух до двенадцати копий на геном, для сорта из Великобритании Sutton's Favorite.
Заключение
Семейство Brassicaceae включает в себя ценные сельскохозяйственные культуры масличного, кормового и овощного назначения, такие как рапс, сурепица, репа, брюква, турнепс, капуста и др. В зонах рискованного земледелия растения подвергаются воздействию низких температур как в период зимних заморозков, так и весенних резких понижений температуры, которые могут совпадать у озимых форм с периодом вегетации и первым урожаем. В связи с этим отбор и создание сортов с повышенной устойчивостью к охлаждению и за-
мораживанию является крайне актуальным.
В настоящее время разработано небольшое количество молекулярных маркеров, которые выявляют полиморфизм генов и локусов количественных признаков, ассоциированных с холодо- и морозостойкостью, у представителей семейства Brassicaceae. В нашей работе мы использовали эффективные молекулярные маркеры, с помощью которых были дифференцированы аллели холодостойкости у 88 образцов семейства Brassicaceae с широким ареалом распространения. В коллекции были представлены образцы из Европы, Азии, Северной и Южной Америки, Новой Зеландии.
В нашей работе из проанализированных SSR-маркеров, ассоциированных с QTL морозостойкости, шесть (Na10-C03, 01l13-G05, SSR Bn 0l10, BngMS180-1, BrgMS 5339-1, CB 10578-1), позволили установить полиморфизм коллекции. Кроме того, были выявлены некоторые закономерности для отдельных SSR-маркеров.
Первый опыт исследований по выявлению копийности генетических локусов CNV показал, что эффективный для выявления полиморфизма генотипов нашей коллекции образцов маркер BnGMs180-1 проявил вариабельность: установлено присутствие в геномах от двух до двенадцати копий на геном. Показано, что ко-пийность генов, ассоциированных с холодостойкостью, оказывает влияние на повышение устойчивости к низким температурам представителей семейства Brassicaceae.
Список использованных источников
1. Rihan H. Z., Al-Issawi M., Fuller M. P. Advances in physiological and molecular aspects of plant cold tolerance / J. of Plant Interactions. -2017. - Vol. 12. - P. 143-157.
2. Analysis of cold resistance and identification of SSR markers linked to cold resistance genes in Brassica rapa / Z. Huang [et al.] / Breed Sci. -2017. Vol. 67, № 3. - P. 213-220.
3. Allelic variation in Brassica oleracea ORCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (BoCCA1) is associated with freezing tolerance / H. Song [et al.] // Hortic. Environ. Biotechnol. - 2018. -Vol. 59, № 3. - P. 423-434.
4. Thomashow MF. (1998) Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiol. 118, 1-7.
5. Генетические механизмы акклиматизации чайного растения (Camellia sinesis (L.) Kuntze) к холодовому стрессу / Самарина Л.С. и соавт. // Вавиловский журнал генетики и селекции -2019. - Т. 23, № 8. - С. 958-963.
6. Arabidopsis transcriptional activators CBF1, CBF2, and CBF3 have matching functional activities / S.J. Gilmour [et al.] // Plant Mol Biol. -2004. Vol. 54, № 5. - P. 767-781.
7. Генетический полиморфизм рапса (Brassica napus) в связи с морозостойкостью/ Мозгова Г. В., Хоружий Н. Е., Амосова А. В., Пилюк Я. Э., Белявский В. М., Храмчен-ко С. Ю., Муравенко О. В., Лемеш В. А. // Молекулярная и прикладная генетика. - 2019. -Т. 26. - С. 34-43.
8. Геномные маркеры, ассоциированные с устойчивостью к низким температурам у Brassica rapa L. / Амосова А. В., Саматадзе Т. Е., Мозгова Г. В., Кипень В. Н., Дубовская А. Г., Артемьева А. М., Юркевич О. Ю., Зо-щук С. А., Лемеш В. А., Муравенко О. В. // Молекулярная биология. - 2020. - T. 54, № 4.
- C. 603-615.
9. Lin Y., Guo W., Xu Z. and Jia Z. Cold resistance and changes in MDA and soluble shugar of lives of Ligustrum lucidum Ait in winter / Chinese Agricultural Science Bulleten. - 2013. - Vol. 28.
- P. 68-72.
10. Zmienko, A., Samelak, A., Kozlowski, P., and Figlerowicz, M. / Copy number polymorphism in plant genomes. - Theor. Appl. Genet. -2014. - Vol. 127. - P. 1-18.
11. Genome reduction uncovers a large dispensable genome and adaptive role for copy number variation in asexually propagated Solanum tuberosum / Hardigan M. [et al.] // The Plant Cell.
- 2016. - Vol. 28. - DOI:10.1105/tpc.15.00538
12. CBF gene copy number variation at Frost Resistance-2 is associated with levels of freezing tolerance in temperate-climate cereals / Knox A.K. [et al.]. - Theor. Appl. Genet. - 2010. - Vol. 121. - P. 21-35.
13. Sub1A is an ethylene-response-factor-like gene that confers submergence tolerance to rice / Xu K. [et al]. // Nature. - 2006. - Vol. 442. -P. 705-708.
14. Aluminum tolerance in maize is associated with higher MATE1 gene copy number / Maron L. G. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2013. - Vol. 110. - P. 5 241-5 246.
15. Mapping of quantitative trait loci related to cold resistance in Brassica napus L. / Zh. Huang [et al.] // J. of Plant Physiology. - 2018. -Vol. 231. - P. 147-154.
16. Genetic variability between several Bra-sicaceae populations of different winter survival ability / B. Rakic [et al.] // In. 12th IRC: Sustainable Development in Cruciferous Oilseed Crops Production. Vol. 2. - Wuhan, China. - 2007. -P. 78-80.
17. Analysis of cold resistance and identification of SSR markers linked to cold resistance genes in Brassica rapa L. / Huang Zh. [et al.] // Breed Sci. - 2017. - Vol. 67, № 3. - P. 213-220.
18. A Complex Recombination Pattern in the Genome of Allotetraploid Brassica napus as Revealed by a High-Density Genetic Map / Cai G. [et al.] // PLoS One. 2014. - Vol. 9, № 10: e109910.
19. Kole 2002 Linkage mapping of genes controlling resistance to white rust (Albugo candida) in Brassica rapa (syn. campestris) and comparative mapping to Brassica napus and Arabidopsis thaliana / Genome. - 2002. - Vol. 45, № 1. - P. 22-27.
20. Paterson, A. H., Bowers, J. E. & Chap-
man, B. A. Ancient polyploidization predating divergence of the cereals, and its consequences for comparative genomics / Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 9 903-9 908.
21. Preferential gene retention increases the robustness of cold regulation in Brassicaceae and other plants after polyploidization / Horticulture Research // Song [et al.]. - 2020. - Vol. 7, № 20. - https://doi.org/10.1038/s41438-020-0253-0.
22. Salome P. A., McClung C.R. PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7 and 9 are partially redundant genes essential for the temperature responsiveness of the Arabidopsis circadian clock / Plant Cell. - 2005. - Vol. 17. - P. 791-803.
23. A cytosolic class II small heat shock protein, PfHSP17.2, confers resistance to heat, cold, and salt stresses in transgenic Arabidopsis / Genet. Mol. Biol. // Zhang, L. [et. al]. - 2018. - Vol. 41. - P. 649-660.
24. Genome-wide identification and characterization of HSP gene superfamily in whitefly (Be-misia tabaci) and expression profiling analysis under temperature stress / Wang X. R. [et al.] // Insect Sci. - 2019. - Vol. 26. - P. 44-57.
V. A. Lemesh, G. V. Mozgova, V. N. Kipen, L. V. Khotyleva
POLYMORPHISM OF ALLELES ASSOCIATED WITH LOW TEMPERATURE RESISTANCE IN REPRESENTATIVES OF THE BRASSICACEACE FAMILY WITH A WIDE DISTRIBUTION AREA
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Belarus e-mail: [email protected]
The polymorphism of loci associated with cold resistance in representatives of the Brassicaceae family was studied. We used 11 SSR markers significantly correlated with relative electrical conductivity of tissue and MDA content, 4 SCAR-markers linked to the alleles of gene CCA1, as well as SSR OllO and SSR BnOllO, closely linked to QTLs associated with plant flowering start time, frost resistance, and winter survival. Verification of samples using the BoCCA1-1R1 SCAR marker showed that the BoCCA1-1 allele, which is characteristic of cold resistant varieties, is contained in the genomes of 26 out of 88 analyzed forms, including the Belarusian varieties of rapeseed Zenit, Dobrodey, Martyn.
Work has begun on the determination of CNV for SSR markers associated with MDA content and relative electrical conductivity of tissues in representatives of the Brassicaceae family. It was found that the DNA markers BrGMS102 and BrGMS4511, which are not effective for detecting polymorphism at genetic loci associated with cold resistance in representatives of the Brassicaceae family, show less than one copy per genome. The effective marker BnGMs180-1 showed variability: from two to twelve copies per genome. Consequently, gene copy number has an effect on increasing resistance to low temperatures in representatives of the Brassicaceae family.
Keywords: family Brassicaceae, cold resistance, SSR-markers, SCAR-markers, CNV
Дата поступления в редакцию: 15 марта 2022 г.
