CC BY
21
10.Царенко П.П., Станишевская О.И., Федорова Е.С., Джолова М.Н. Проблемы качества скорлупы во второй половине периода яйцекладки: возможные причины и пути решения // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2009. - № 13. - С.46-49.
11.Balnave D. Calcium and carbonate supply in the shell gland of hens laying eggs with strong and weak sells and during and after f rest from lau// Poultry Sc, 2012. -Vol.71, N 12. - p. 2035-2040.
12.Kleker D., Siske V., Zeman L. The egg shell a case study in improving quality by altering mineral metabolism - naturally// Poultry Industry. - 2007. - p. 23.
Literatura
1. Podobed L.I. Obespechenie pticy mineral'nymi veshchestvami //Pticefabrika. - 2005. - № 1. - S. 35-37.
2. Okolelova T.M., Markelova N.N. O problemah mineral'nogo pitaniya sovremennyh vysokoproduktivnyh krossov kur//Pticevodstvo. - 2012. - №4. - S. 26-28.
3. Petrosyan A. Mineral'noe pitanie pticy: materialy HIH Mezhdunarodnoj konferencii VNAP «Mirovye i Rossijskie trendy razvitiya pticevodstva: realii i vyzovy budushchego». - Sergiev Posad, 2018. - S.299-303.
4. Timofeeva E.A. Rol' mikroelementov v racione ptic //AgroRynok. - 2012. - №1. - S.34-36.
5. Prohorova YU.V., Gavrikov A.V., YOshchik V.V. Znachenie mikroelementov v zhiznedeyatel'nosti pticy// Pticevodstvo. - 2016. - №6. - S.32-35.
6. Podobed L.I. IMK-ideal'noe mineral'noe pitanie dlya pticy// Pticevodstvo. - 2012. - №9. - S. 33- 36.
7. Okolelova T.M., Zubarev V.N. Butofan OR sposobstvuet uluchsheniyu kachestva skorlupy//Pticevodstvo. - 2016. - №5. - S.5-7.
8. Fisinin V.I., Egorov I.A. SHCHepetkina S.V. Organizaciya sistemy kontrolya infekcionnyh boleznej ptic, primeneniya antimikrobnyh preparatov i vypuska bezopasnoj produkcii pticevodstva. - SPb.: SPbGAVM, 2018. - 536 s.
9. Carenko P.P., Vasil'eva L.T. Metody ocenki i povysheniya kachestva yaic sel'skohozyajstvennoj pticy: uchebnoe posobie. - SPb.: Izdatel'stvo «Lan'», 2016. - 280s.
10.Carenko P.P., Stanishevskaya O.I., Fedorova E.S., Dzholova M.N. Problemy kachestva skorlupy vo vtoroj polovine perioda yajcekladki: vozmozhnye prichiny i puti resheniya // Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2009. - № 13. -S.46-49.
11.Balnave, D. Calcium and carbonate supply in the shell gland of hens laying eggs with strong and weak sells and during and after f rest from lau// Poultry Sc, 2012. -Vol.71, N 12. - p. 2035-2040.
12.Kleker D., Siske V., Zeman L. The egg shell a case study in improving quality by altering mineral metabolism - naturally// Poultry Industry. - 2007. - p. 23.
УДК 636.592:636.082.2 DOI 10.24411/2078-1318-2019-12108
Доктор биол. наук В.П. ТЕРЛЕЦКИЙ (ВНИИГРЖ, valeriter@mail.ru) Канд. биол. наук В.И. ТЫЩЕНКО (ВНИИГРЖ, tinatvi@mail.ru) Канд. биол. наук Т.Э. ПОЗДНЯКОВА (ФГБОУ ВО СПбГАУ, erastovna@mail.ru)
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ ПТИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ДНК-ЗОНДА*
Определенная генетическая обособленность пород индеек объясняется историей их выведения. Например, серебристая северокавказская порода, утвержденная в 2008 году, создавалась на основе скрещивания индеек палевой узбекской с белой широкогрудой породой [1, 2]. В последующем совершенствование популяции осуществляли «в себе». Белая
московская порода появилась в середине прошлого века при скрещивании местных птиц с индейками голландской и белтсвиллской селекции. Бронзовая северокавказская идейка была создана и затем утверждена в 1956 году при участии бронзовых местных и широкогрудых индеек с последующим закреплением желательных признаков. Белая северокавказская выводилась на основе скрещивания северокавказской бронзовой с самцами белой широкогрудой породы, завезенной из Англии, с отбором на нужные признаки и белое оперение (была утверждена в 1975 году). Узбекская палевая индейка получилась при использовании в селекции узбекских местных бронзовых и белых широкогрудых индеек.
В промышленном птицеводстве, в частности, индейководстве, большое значение имеет выведение генетически различающихся линий, скрещивание которых позволяет добиться сочетания полезных генов и их аллелей, т.е. получить максимальный эффект гетерозиса. Молекулярно-генетические методы используют при выявлении особенностей генома птиц и расчета ряда популяционно-генетических параметров [3, 4]. Достаточно простым в исполнении, но ненадежным в плане воспроизводимости является генотипирование методом амплификации случайных последовательностей (RAPD) [5]. Используются также микросателлитные последовательности ДНК [3, 6] и гипервариабельные минисателлитные повторы [4], позволяющие выявить различия между особями на уровне организации генома. Большое внимание уделяют поискам и использованию генов, формирующих конкретные признаки птицы, такие как цвет оперения [7].
Цель исследования - выяснить возможности молекулярно-генетического анализа индеек четырех пород в изучении популяционно-генетических параметров и связать полученные результаты с историей выведения и совершенствования этих пород.
Материалы, методы и объекты исследования. Объектом исследования служили индейки четырех пород Северо-Кавказской зональной опытной станции (СКЗОСП) в количестве 11 голов от каждой породы, от которых была взята кровь и выделена геномная ДНК.
Кровь отбирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в качестве антикоагулянты. Кровь замораживали до выделения ДНК. После размораживания образцы крови смешивали с равным объемом буфера TES (10 мМ трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCL, рН 7,5) и центрифугировали для осаждения ядер клеток. Последние лизировали с помощью детергента додецилсульфат натрия, белки в смеси расщепляли ферментом протеиназа К. Суспензию смешивали с равным объемом водонасыщенного фенола, встяхивали 10 мин. и центрифугировали при 12 000 об/мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК, отбирали в другую микропробирку. ДНК осаждали этанолом, а затем растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5).
Первым этапом в анализе было ферментативное расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции HaelII. Продукты расщепления подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле в течение 44 часов при напряжении 50В. Разделенные по длине фрагменты ДНК переносили на нейлоновый фильтр под вакуумом в аппарате VacuGene XL Vacuum Blotting System™ (GE Healthcare).
Реакцию молекулярной гибридизации проводили в присутствии меченого дезоксигенином олигонуклеотидного зонда (ГТГ)5. Отмывка фильтра от невключившейся метки осуществлялась трехкратно. После этого места связывания зонда с геномными участками выявляли в иммуно-химической реакции с использованием конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза. Конъюгат избирательно связывался с дезоксигенином, а фермент щелочная фосфатаза позволяла детектировать эти места на фильтре в цветной реакции с использованием специальных коммерчески доступных красителей NBT и BCIP. Все популяционно-генетические параметры рассчитывались по программе Gelstats™. Для построения филогенетического древа использовалась программа «Статистика 6» с использованием алгоритма UPGMA.
Результаты исследования. На фильтре анализировали популяционно-генетические параметры в группе, состоящей из белой московской, бронзовой северокавказской,
серебристой северокавказской и белой северокавказской породы (табл. 1). Бронзовая северокавказская показала низкие значения коэффициента сходства (BS = 0, 48), так же как и белая северокавказская (BS = 0,46). Максимальное сходство внутри породы было у серебристой северокавказской (BS = 0,71).
Генетически близкими были бронзовые и белые северокавказские (Б = 0,020), что хорошо согласуется с известной историей создания белой северокавказской породы (выведена в 70-е годы с использованием бронзовой северокавказской птицы), в то же время наиболее удаленными от других пород были серебристые северокавказские, в создании которых принимали участие узбекские палевые индейки. Последние, в свою очередь, выводились с использованием местных аборигенных пород.
Таблица 1. Популяционно-генетические параметры 4-х пород индеек Северо-Кавказской зональной опытной станции по птицеводству (СКЗОСП) - белая московская, серебристая северокавказская, бронзовая северокавказская и белая северокавказская, рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5 и программой Gelstats™
Породы индеек п Полос на дорожку Х±т Р В81 В82 Б
Белая московская Серебристая северокавказская 11 11 23,3±1,3 24,2±1,0 3,85 х 10-6 2,94 х 10-4 0,59 0,71 0,58 0,070
Белая московская Бронзовая северокавказская 11 11 23,3±1,3 18,3±2,1 3,85 х 10-6 1,59 х 10-6 0,59 0,48 0,50 0,035
Белая московская Белая северокавказская 11 11 23,3±1,3 16,7±2,0 3,85 х 10-6 1,99 х 10-6 0,59 0,46 0,49 0,035
Серебристая северокавказская Бронзовая северокавказская 11 11 24,2±1,0 18,3±2,1 2,94 х 10-4 1,59 х 10-6 0,71 0,48 0,52 0,075
Серебристая северокавказская Белая северокавказская 11 11 24,2±1,0 16,7±2,0 2,94 х 10-4 1,99 х 10-6 0,71 0,46 0,50 0,085
Бронзовая северокавказская Белая северокавказская 11 11 18,3±2,1 16,7±2,0 1,59 х 10-6 1,99 х 10-6 0,48 0,46 0,45 0,020
Р - вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором фрагментов ДНК;
В81 - коэффициент сходства внутри групп;
В82 - коэффициент сходства между группами;
Б - генетическое расстояние
Внутрипопуляционная генетическая гетерогенность изучалась по критерию гетерозиготности (табл.2). В частности, было установлено, что наименьшая гетерозиготность была у серебристой северокавказской (Н = 0,35), а наивысшей гетерозиготностью обладали индейки белой северокавказской породы (Н = 0,62). Эти данные хорошо коррелируют с ранее полученными значениями по коэффициентам сходства внутри соответствующих пород (табл. 1). Белая северокавказская индейка была выведена путем скрещивания недавно по сравнению с другими породами (70-е годы XX века). Можно предположить, что у этой птицы сохранились генетические варианты исходных форм, что и обусловило повышенное разнообразие в популяции.
Специфические фрагменты были выявлены у всех четырех пород. Например, фрагмент №16 встречается с частотой 0,91 у белой московской и частотой всего 0,18 у серебристой северокавказской (табл. 3). Таким образом, данный фрагмент ДНК является маркерным для белой московской птицы и может быть использован при генетической паспортизации этой породы.
Таблица 2. Гетерозиготность в четырех породах индеек
Породы индеек п Число локусов Число аллелей Число полиморф. локусов Н
Белая московская 11 15,58 3,02 0,84 0,50
Бронзовая северокавказская 11 13,30 3,45 0,91 0,56
Серебристая северокавказская 11 17,98 2,28 0,67 0,35
Белая северокавказская 11 10,35 4,06 0,90 0,62
Н - средняя гетерозиготность
Таблица 3. Специфические фрагменты ДНК и аллели, имеющие разную частоту встречаемости в четырех породах индеек
№* Частота фрагментов ДНК Частота встречаемости аллелей q=lWl-p
Белая москов. Серебр. северок. Бронз. северок. Белая северок. Белая москов. Серебр. северок. Бронз. северок. Белая северок.
1 0,45 1,00 0,36 0,18 0,26 1,00 0,20 0,09
8 0,64 0,82 0,18 0,18 0,40 0,58 0,09 0,09
16 0,91 0,18 0,45 0,27 0,70 0,09 0,26 0,15
21 0,73 1,00 0,18 0,45 0,48 1,00 0,09 0,26
35 0,82 1,00 0,27 0,73 0,58 1,00 0,15 0,48
48 0,73 1,00 0,90 0,27 0,48 1,00 0,68 0,15
* Номер фрагмента ДНК на фильтре
Более наглядно генетические взаимоотношения в изученных породах представлены графически в виде дендрограммы (рис.). Серебристая северокавказская генетически наиболее удалена от остальных пород, в то же время белая северокавказская и бронзовая северокавказская являются близкими, что соответствует истории их создания (белая северокавказская порода выведена из бронзовой северокавказской и белой широкогрудой).
Белая московская
Бронзовая северокавказская
Белая северокавказская
Серебристая северокавказская
Рис. Дендрограмма генетических взаимоотношений в четырех породах индеек
Выводы. Молекулярно-генетический метод с использованием ДНК-зонда позволяет выявить как внутрипопуляционное разнообразие в породах индеек, так и рассчитать генетические расстояния между породами. Полученные результаты соответствуют истории выведения пород индеек. Кроме того, метод идентифицирует маркерные фрагменты ДНК,
У
являющиеся специфическими для отдельных популяций, которые можно использовать для паспортизации пород.
*Исследование выполнено при поддержке Государственного задания, № ГЗ АААА-А18-118021590138-1 по теме №0445-2019-0026.
Литература
1. Беленький Ю.В., Шинкаренко Л.А., Щербакова Н.Г., Терлецкий В.П. Популяционно-генетические особенности индеек генофонда отечественной селекции // Птица и птицепродукты. - 2017. - № 2. - С. 50-52.
2. Погодаев В.А., Канивец В.А., Шинкаренко Л.А. Использование серебристой северокавказской породы индеек в качестве материнской формы при гибридизации // Птица и птицепродукты. - 2012. - № 6. - С. 24-26.
3. Фисинин В.И., Селионова М.И., Шинкаренко Л.А., Щербакова Н.Г., Кононова Л.В. Исследование микросателлитных локусов в породах индеек российской селекции // Сельскохозяйственная биология. - 2017. - Т. 52. - № 4. - С. 739-748.
4. Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Яковлев А.Ф. Использование метода фингерпринтинга ДНК для изучения генетической дивергенции в популяциях сельскохозяйственных животных // Вестник РАСХН. - 2003. - № 1. - С. 79-80.
5. Al-Barzinji Y.M.S., Fatah A.O. Genetic diversity of domestic and commercial turkey breeds: assessment using RAPD-PCR technique // Malays. Appl. Biol. - 2016. - Vol. 45. - No 1. -P.65-68.
6. Karsli T., Balcioglu M.S. Genetic characterization and population structure of six brown layer pure lines using microsatellite markers // Asian-Australas J. Anim. Sci. - 2019.-Vol.32. - No1. -P. 49-57. doi: 10.5713/ajas.17.0870
7. Corso J., Hepp D., Ledur M.C., Peixoto J.O., Nelson J. R. Fagundes N.J.R., Freitas T.R.O.
Genetic variation of the bronze locus (MC1R) in turkeys from Southern Brazil // Genet. Mol. Biol. - 2017. - Vol.40. - No 1. - P. 104-108. doi: 10.1590/1678-4685-GMB-2016-0136.
Literatura
1. Belen'kij YU.V., SHinkarenko L.A., SHCHerbakova N.G., Terleckij V.P. Populyacionno-geneticheskie osobennosti indeek genofonda otechestvennoj selekcii // Ptica i pticeprodukty. -2017. - № 2. - S. 50-52.
2. Pogodaev V.A., Kanivec V.A., SHinkarenko L.A. Ispol'zovanie serebristoj severokavkazskoj porody indeek v kachestve materinskoj formy pri gibridizacii // Ptica i pticeprodukty. - 2012. -№ 6. - S. 24-26.
3. Fisinin V.I., Selionova M.I., SHinkarenko L.A., SHCHerbakova N.G., Kononova L.V.
Issledovanie mikrosatellitnyh lokusov v porodah indeek rossijskoj selekcii // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. - 2017. - T. 52. - № 4. - S. 739-748.
4. Dement'eva N.V., Terleckij V.P., Tyshchenko V.I., YAkovlev A.F. Ispol'zovanie metoda fingerprintinga DNK dlya izucheniya geneticheskoj divergencii v populyaciyah sel'skohozyajstvennyh zhivotnyh // Vestnik RASKHN. - 2003. - № 1. - S. 79-80.
5. Al-Barzinji Y.M.S., Fatah A.O. Genetic diversity of domestic and commercial turkey breeds: assessment using RAPD-PCR technique // Malays. Appl. Biol. - 2016. - Vol. 45. - No 1. -P.65-68.
6. Karsli T., Balcioglu M.S. Genetic characterization and population structure of six brown layer pure lines using microsatellite markers // Asian-Australas J. Anim. Sci. - 2019.-Vol.32. - No1. -P. 49-57. doi: 10.5713/ajas.17.0870
7. Corso J., Hepp D., Ledur M.C., Peixoto J.O., Nelson J. R. Fagundes N.J.R., Freitas T.R.O.
Genetic variation of the bronze locus (MC1R) in turkeys from Southern Brazil // Genet. Mol. Biol. - 2017. - Vol.40. - No 1. - P. 104-108. doi: 10.1590/1678-4685-GMB-2016-0136
